Summary
Этот протокол описывает клоаки Массаж, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц и экстракции ДНК от птичьего спермы с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями.
Abstract
Коллекция спермы может быть полезным для широкого спектра приложений, включая исследования с участием качества спермы, сперма теломер динамики и эпигенетики. Птицы являются широко используемых предметов в биологических исследованиях и идеально подходит для исследования образцов неоднократные спермы. Однако мало ресурсов в настоящее время доступны для тех, кто хочет научиться собирать и извлечь ДНК от птичьего спермы. Здесь мы описываем клоаки Массаж, нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора птичьего спермы. Хотя этот метод установлен в литературе, это может быть трудно узнать из имеющихся описаний. Мы также предоставляем информацию для извлечения ДНК от птичьего Семен, с использованием комплекта коммерческой добычи с изменениями. Клоаки массаж легко может использоваться на любых малого среднего размера мужчина птица в репродуктивного состояния. После сбора спермы можно использовать немедленно для анализов подвижность, или замороженные для экстракции ДНК после протокол, описанные здесь. Этот протокол извлечения был усовершенствован для птичьего спермы и успешно используется на образцы, собранные из нескольких видов воробьиных (Passer domesticus, Воробьиные овсянки Овсянковые кардиналы, гракл Haemorhousи migratorius дрозд ) и один columbid (Columba livia).
Introduction
Птицы являются идеальным темы для исследований с участием качества спермы и конкуренции1, спермы теломер динамики2, эпигенетики3и подобные темы, как они широко используются в биологических исследованиях и спермы можно легко попробовать с помощью клоаки Массаж. Клоаки массаж – нежный, неинвазивная мануальная техника для сбора спермы птиц4,5,6. Повторные образцы могут быть легко получены, и требуются никаких специальных инструментов, что делает его простым для выполнения в поле или лаборатории. Хотя клоаки массаж был в использовании на протяжении десятилетий, трудно узнать из доступных письменного описания. Эта публикация предназначена для сокращения времени и неопределенности, участвующих в процессе обучения клоаки массаж.
Семен, собранных от птиц, используя клоаки массаж может быть немедленно использованы для оценки подвижности4,7 или искусственного оплодотворения8или замороженные для других целей, например расширенные изображений и экстракции ДНК. Образцы спермы от воробьиных птиц малы, но содержат плотно упакованных спермы. ДНК добывается с использованием коммерческой добычи комплект для простоты, с изменениями для преодоления специализированные защитные функции сперматозоиды9. После извлечения спермы теломеры может быть измерена с помощью ПЦР10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол включает позвоночных животных темы и был одобрен институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Северная Дакота.
1. Семен коллекции из певчих птиц, используя клоаки Массаж
Примечание: Клоаки массаж является эффективным Семен коллекции техника на репродуктивно активных птицы только, но может быть успешно выполнена вне сезона размножения в неволе соответствующих ситуациях. Репродуктивной деятельности должны определяться для целевых видов перед использованием клоаки массаж. Этот метод может использоваться на диких птиц после захвата или на птиц в плену.
- Начиная с мужской птица, (в разведении условие) Бандер в тисках в руке недоминирующих, доминирующей рукой передавать птица с его вентральной стороне прикосновения ладони (рис. 1).
- Убедитесь, что голова птицы рядом с бокового края ладони. Слегка защитить голову и тело, используя мизинец, кольцо и средним пальцами. Это оставляет дефлектора и хвост подвергаются птицы.
- Оставьте птицы ноги loose или слегка сдержанной, используя ладони.
Рисунок 1 : Сцепление для клоаки массаж. Птица слегка обеспечивается в доминирующей рукой с его вентральной стороне прикосновения ладони и голову, обеспечены pinky палец. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Поместите доминирующей указательный палец и большой палец на обе стороны Улучшенный конца клоаку и слегка сожмите пальцы вместе очень легким нажимом к хвосту ( рис. 2). Клоака будет Эверт, обнажая слизистую оболочку клоаки (розовый интерьер).
Примечание: Если птица не является в настоящее время производство спермы, клоаки выпуклости могут быть небольшими и клоаку трудно Эверт. С опытом это легко различать cloacas репродуктивно активных и неактивных мужчины5,11.
Рисунок 2 : Пальцем позиции и клоаки протуберанцем. Эверт клоаку, применяя небольшое давление к концу улучшенный (A). В репродуктивно активных мужчин Воробьинообразные, очевидно клоаки бугорками и фирмы (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Недоминирующих рукой Поместите панель указательный палец на спинной стороне основания хвоста стабилизировать руку и затем поместите кончик пальца чуть ниже everted клоаку.
Примечание: Короткая и гладкая эскизов является выгодным для выполнения клоаки массаж и защищает птица от случайного повреждения. - Перемещение пальца недоминирующих глубоко и краниально в повторяющихся движений с среднего давления, оставаясь ниже клоаку. Продолжайте, пока птица эякуляции. В зависимости от личности это обычно занимает от 1 и несколько десятков ударов.
- Как только птица эякуляции, сбора спермы в гематокритной трубку. Повторите клоаки Массаж, чтобы получить несколько эякуляции.
Примечание: Из отряда воробьинообразных Семен светло-коричневый и обычно имеет несколько густую консистенцию. Белый или темно веществ выбрасывается из Клоака не спермы и могут загрязнять образца спермы. Внешний вид небольшое количество крови на клоаку или смешанные в с спермы обычно вызвано слишком много давления во время массажа. - Для экстракции ДНК поместите спермы в пробки microcentrifuge с 20 мкл ПБС (рН 7,4). Примечание: Семен, хранящиеся в однократном ПБС не подходит для искусственного осеменения, но может быть использован для экстракции ДНК на более позднем этапе при температуре-80 ° C. PBS может быть комнатной температуры или охлажденные, но должно быть в жидком состоянии, когда наносится образца спермы.
- Подтвердите наличие сперматозоидов в образце, просмотрев небольшой объем разреженных образец под микроскопом соединения (рис. 3).
- Храните разбавленные Семен-80 ° c до добычи.
2. Добыча ДНК из спермы птиц
Примечание: Этот протокол был протестирован с нескольких коммерческих экстракции ДНК комплекты, но только он был успешным, когда используется с одним ДНК комплект12. Шаги, которые изменяются от комплект протокола обозначаются *.
- Подготовить раствор 1м Дитиотреитол (DTT) в воде и перемешивают с помощью vortex.*
- Алиготе DTT решения и храните его при 20 ° C до непосредственно перед использованием. Каждый образец извлекаемое требует 10 мкл solution.* 1 М DTT
- Подготовить на буфер, содержащий 20 мм трис-Cl, рН 8,0; 20 мм ЭДТА; 200 мм NaCL; и 4% SDS. Каждый образец извлекаемое требует 90 мкл этой buffer.*
- Сохраните буфер при комнатной температуре. Если он осаждают, нагреть до 56 ° C до dissolve.*
- Разогрейте инкубатор, содержащий рокер или шейкер до 65 ° Отрошевская
- Непосредственно перед началом добычи, Смешайте 10 мкл раствора DTT с 90 мкл буфера, подготовленный на шаге 2.2 для каждого образца должно быть извлечено, например 900 мкл буфера плюс 100 мкл DTT решение, если извлечение 10 образцов. Эта смесь будет называться DTT-buffer.*
- Добавить 70 мкл ПБС образца спермы всей разреженных и перемешать хорошо с помощью vortex.*
- 100 мкл DTT-буфера и 10 мкл пример протеиназы K решения. Вихрь на 20 секунд, затем инкубировать в разогретой инкубатора за 1 час на качалку или shaker.*
- Добавить 200 мкл буфера Аль и 200 мкл свежие EtOH (100%) и вихревые для 20 seconds.*
- Передача всей выборки к столбцу спин и центрифуги 1 минуту на 6000 x g. удаления коллекции трубки.
- Место столбец на новой трубки и добавить 500 мкл подготовленный буфер AW1. Центрифуга 1 минуту на 6000 x g. удаления коллекции трубки.
- Место столбец на новой трубки и добавить 500 мкл подготовленный буфер AW2. Центрифуга за 1 минуту в 6000 x g. отбросить проточных и место столбце обратно на трубе.
- Центрифуга 3 минуты на 20000 x g. удаления коллекции трубки и столбце на пробки microcentrifuge 1,5 мл.
- Накапайте 35 мкл AE буфера непосредственно на столбец мембраны и инкубации при комнатной температуре для 5 минут.*
- Центрифуга 1 минуту в 14.000 x g. отменить столбце спин и хранить извлеченные образцы-80 ° c.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клоаки массаж и ДНК извлечения с помощью описанных протокол выступала на нескольких видов воробьиных и один columbid (Таблица 1). Присутствие спермы в образцах спермы, собранные клоаки массаж было подтверждено путем просмотра небольшое количество разреженных образцов под микроскопом соединения при 400-кратном (рис. 3). После извлечения ДНК из образцов спермы собраны из домовые воробьи, используя протокол, описанный здесь, восемь образцов были запущены на электрофорезе геля с ДНК лестницы (три образцы можно увидеть на рис. 4). Все восемь полос образца, указывающий успешное изоляции высокого качества ДНК наблюдались отдельных полос без размытия. Все образцы, извлеченный с помощью этого протокола были оценены для концентрации ДНК с помощью спектрофотометра (см. таблицу 1).
Рисунок 3: спермы от двух мелких воробьиных. Эти спермы, что образцы были получены клоаки массаж от дома Финч (Haemorhous гракл), слева, и справа, дом Воробей (Passer domesticus), захваченных в Фарго, Северная Дакота в 2016 году. Образцы были каждый разводят в 20 мкл PBS и рассматривать под микроскопом соединения на 1000 X-400 X увеличение, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : ДНК электрофорез ДНК спермы геля. Три пробы ДНК, извлеченные из Домовый воробей спермы на геле с ДНК лестнице. Обратите внимание на присутствие отдельных полос, указывающий успешное извлечение высокого качества ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Домовый воробей (Passer domesticus) | Зазубрин Воробей (Овсянковые кардиналы Воробьиные овсянки) | Дома Финч (Haemorhous гракл) | Американский Робин (дрозд migratorius) | Рок голуби (Columba livia) | |
| Количество собранных образцов | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Количество образцов извлечено | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Семен коллекции успеха | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
Таблица 1: виды и образцы собираются и извлеченных на сегодняшний день. На момент публикации образцы были обработаны с использованием описанных протокола из 4 видов воробьиных и 1 columbid. Семен коллекции успеха относится к доля каждого для которого образец был успешно получен из общего числа попыток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы опишем простой и надежный способ для сбора спермы от малых и средних птиц в состоянии репродуктивно активных и извлечения ДНК от птичьего спермы.
Протокол извлечения ДНК описанных Семен изменен из комплекта для простоты, но был доработан для использования на птичий спермы. Спермы устойчивы к лизис стандарта извлечения химических веществ9,13, и образцы спермы, собранных из семейства воробьиных довольно небольшой (обычно несколько микролитров). Эти факторы создают проблемы, которые успешно преодолеть с помощью соответствующей концентрации DTT и инкубации на 65 ° C. С помощью этого метода, мы последовательно изолированных полезная количество ДНК для ПЦР анализа спермы длины теломер (обычно между 40-250 нг/мкл, в зависимости от объема эякулята).
DTT ранее использовался для извлечения ДНК из птичьего спермы в сочетании с фенол/хлороформ реакции13. Фенол/хлороформ реакции являются эффективными для изоляции ДНК, но они занимают больше времени, являются более опасными и требуют зонта. Заметным ограничением нашей извлечения протокола является, что она была только успешным, когда используется с одним брендом и извлечения комплекта, возможно из-за малого объема начиная образца типа. Образцы спермы очень маленький (менее чем в 1 мкл) или образцы спермы низкой плотности могут помешать успешной экстракции ДНК из-за недостаточной ДНК в образце, но мы не столкнулись с этой проблемой когда клоаки Массаж выполняется на птиц в разведении условие . Чтобы избежать этой проблемы, клоаки массаж может быть повторен немедленно собрать несколько эякуляции, которые могут быть объединены для извлечения.
Клоаки массаж был в использовании на протяжении десятилетий и многих видов1,4,5,6,7,,1516,17и быстрое и эффективное средство сбора спермы от птиц во многих случаях. Для исследований с участием диких или неподготовленные птиц, которые могут быть захвачены, более эффективна, чем методы сбора, которые полагаются на убедительные мужчина птица совокупляться с элементом и сдать его Семен охотно4. Другой метод сбора спермы, рассечение яичек или семенных glomera, но это не вариант для целей сохранения или повторный отбор образцов4,14. Основным ограничением клоаки массаж является трудность в изучении технику без демонстрации. Письменные описания часто недостаточно, чтобы понять и научиться реализации этого процесса. Иллюстрируя клоаки массаж в деталях, мы надеемся сократить время обучения и трудности для тех, кто хочет научиться технике.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Хосе Noguera для ранней помощи с клоаки Массаж, и Джеффри Kittilson для лаборатории поддержки. Эта работа была поддержана премию ND EPSCoR FAR0022429 для BJH. Расходы на публикации были щедро поддерживает Департамент биологических наук NDSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T.
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
