Summary
本协议描述泄殖腔按摩, 一种非侵入性的手工技术, 用于从禽类中收集精子, 以及使用商业提取试剂盒进行 DNA 提取, 并进行修改。
Abstract
收集的精子可能是有用的广泛的应用, 包括研究涉及精质, 精子端粒动力学和表观遗传学。鸟类是生物学研究中广泛使用的学科, 是涉及反复精子样本研究的理想选择。然而, 对于那些希望学习如何从禽类精子中收集和提取 DNA 的人来说, 目前还没有多少资源可用。在这里, 我们描述泄殖腔按摩, 一个温和的, 非侵入性的手工技术收集禽类精子。虽然这项技术是建立在文献, 它可能是很难从可用的描述学习。我们还提供信息, 从禽精提取 DNA 的商业提取试剂盒的修改。泄殖腔按摩可以很容易地用于任何小到中型雄鸟的生殖条件。在收集后, 可以立即使用精子进行运动化验, 或在本协议所述的 DNA 提取后冷冻。这一提取协议被提炼为禽精, 并已成功地用于收集的样本从几个雀物种 (过路人幼雏, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, 和鸫 migratorius) 和一个 columbid (鸽)。
Introduction
鸟类是研究精子质量和竞争的理想科目1, 精子端粒动力学2, 遗传学的3, 和类似的主题, 因为它们广泛用于生物研究和精子可以很容易地取样使用泄殖腔按摩.泄殖腔按摩是一种温和的, 非侵入性的手工收集精子的技术, 从鸟类4,5,6。重复样品可以很容易获得, 不需要特殊的工具, 使其易于在现场或实验室执行。虽然泄殖腔按摩已经使用了几十年, 很难从现有的书面说明。本刊物旨在减少学习泄殖腔按摩所涉及的时间和不确定因素。
从鸟类收集的精子使用泄殖腔按摩可立即用于运动评估4,7或人工授精8, 或冷冻其他用途, 如高级成像和 DNA 提取。来自雀鸟的精子样本很小, 但含有浓密的精子。DNA 的提取使用一个商业提取试剂盒简单, 与修改, 以克服专门的保护功能的精子9。提取后, 精子端粒可以使用 qPCR10进行测量。
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Protocol
该议定书涉及脊椎动物的主题, 并已批准的机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 在北达科他州立大学。
1. 使用泄殖腔按摩的雀鸟的精子收集
注: 泄殖腔按摩是一种有效的生殖活禽的精子收集技术, 但可以在适当的圈养情况下成功地在繁殖季节之外进行。在使用泄殖腔按摩之前, 应确定目标物种的生殖活动。这种技术可以用于野生鸟类捕获或圈养鸟类。
- 从雄鸟开始, (在繁殖条件) 達的握在非主导的手, 转移鸟到支配的手与它的腹侧接触手掌 (图 1)。
- 确保鸟的头部离手掌的侧边最近。用小指、环和中指轻轻地保护头部和身体。这就使得鸟的排气口和尾部露出来了。
- 用手掌把鸟的腿松开或轻轻地克制。
图 1: 泄殖腔按摩手柄.这只鸟在占优势的手上被轻轻地固定着, 它的腹侧接触手掌, 头部被小指固定。请单击此处查看此图的较大版本.
- 将占主导地位的食指和拇指放在泄殖腔的任一侧, 轻轻地捏住手指, 对尾部施加非常轻微的压力 (图 2)。泄殖腔将埃弗特, 露出泄殖腔粘膜 (粉红色内部)。
注意: 如果鸟目前没有生产精子, 泄殖腔突起可以小, 泄殖腔很难埃弗特。有经验, 很容易区分 cloacas 的生殖活动和非活动的男性5,11。
图 2: 手指位置和泄殖腔突起.埃弗特泄殖腔通过施加轻微的压力到上级端 (A)。在生殖活跃的雄性雀中, 泄殖腔突起明显且牢固 (B)。请单击此处查看此图的较大版本.
- 用非显性手, 将食指的垫放在尾巴底部的背侧以稳定手, 然后将拇指的尖端放在外翻泄殖腔的下方。
注意: 短而平滑的缩略图有利于进行泄殖腔按摩, 保护鸟免受意外伤害。 - 移动非显性拇指深和 cranially 在一个重复的运动中压, 保持低于泄殖腔。继续, 直到鸟射精。根据个人, 这通常需要在1和几十个中风。
- 鸟一射精, 就在 microhematocrit 管中收集精子。重复泄殖腔按摩以获得多射精。
注: 雀的精子呈浅褐色, 通常有较厚的稠度。从泄殖腔中排出的白色或深色物质不是精子, 可能会污染精子样本。在泄殖腔或与精子混合时出现少量的血液, 通常是由于按摩时压力太大造成的。 - 对于 DNA 提取, 将精子放入离心管中, 20 µL 1x PBS (pH 7.4)。注: 1x PBS 中贮存的精子不适合人工受精, 但在-80 ° c 贮存时可用于 DNA 提取。PBS 可以是室温或冷冻的, 但在储存精子样本时应处于液态状态。
- 通过在复合显微镜下观察少量的稀释样品 (图 3), 确认样品中是否存在精子。
- 将稀释的精子贮存在-80 ° c 直至提取。
2. 从禽精中提取 DNA
注: 本协议已通过多个商业 dna 提取试剂盒进行了测试, 但仅在使用一个 dna 套件12时才成功。从套件协议中修改的步骤由 * 表示。
- 在水中准备一个1米的糖 (德勤) 溶液, 并使用涡流混合。
- 分的解决方案, 并存储在-20 ° c, 直到使用前立即。每个样品要提取需要10µL 1 M 的解决方案。
- 准备一个包含20毫米三氯的缓冲液, pH 值 8.0;20毫米 EDTA;200毫米氯化钠;和 4% SDS。要提取的每个样本需要此缓冲区的90µL。
- 在室温下存储缓冲区。如果它已经沉淀, 温暖它到56° c 溶化。
- 将装有摇杆或振动筛的恒温箱预热至65° c。
- 在开始提取之前, 在步骤2.2 中为每个抽取的样本准备10µL 的90µL 的缓冲液, 并在提取100样本时,例如900 µL 缓冲器加10µL 的解决方案。这种混合物将被称为 "数码缓冲"。
- 添加70µL 1x PBS 到整个稀释的精子样本和混合良好使用涡流。
- 添加100µL 的数码缓冲和10µL 蛋白酶 K 溶液的样品。漩涡20秒, 然后孵化在预热孵化器1小时的摇杆或振动筛。
- 添加200µL 缓冲 AL 和200µL 新鲜乙醇 (100%) 和漩涡20秒。
- 将整个样品转移到旋转柱, 离心机1分钟, 6000 x g. 丢弃收集管。
- 将列放在新管上, 并添加500µL 准备的缓冲 AW1。离心机1分钟在 6000 x g. 丢弃收集管。
- 将列放在新管上, 并添加500µL 准备的缓冲 AW2。离心机1分钟, 在 6000 x g. 丢弃流, 并将列放回管上。
- 离心机3分钟在 2万 x g. 丢弃收集管, 将柱放在1.5 毫升离心管上。
- 吸管35µL 将 AE 缓冲器直接放在柱膜上, 室温孵育5分钟。
- 离心机1分钟在 1.4万 x g. 丢弃自旋柱, 并在-80 ° c 处储存提取的样品。
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Representative Results
泄殖腔按摩和 DNA 提取使用所描述的协议已经对几个雀物种和一个 columbid (表 1) 进行。在泄殖腔按摩收集的精子样本中, 通过在400X 放大倍数显微镜下观察少量稀释后的样品 (图 3), 证实了精的存在。从家庭麻雀收集的精子样本中提取的 dna 使用这里所描述的协议, 八样品在凝胶电泳和 dna 阶梯上运行 (三样本可以在图 4中看到)。在所有的八条取样车道上都看到了无涂抹的不同带, 表明了高质量 DNA 的成功分离。使用此协议提取的所有其他样本都是用分光光度计对 DNA 浓度进行评估的 (请参见表 1)。
图 3:来自两个小形的精子.这些精子样本通过泄殖腔按摩获得的房子雀科 (Haemorhous mexicanus), 左, 和房子麻雀 (过路人幼雏), 右, 被困在法戈, ND 在2016年。样品分别在20µL PBS 中稀释, 并在1,000X 和400X 放大倍数的复合显微镜下查看。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 精子 dna 的 dna 凝胶电泳.三从家庭麻雀精子中提取的 dna 样本在一个带有 dna 阶梯的凝胶上运行。注意不同波段的存在, 表明高品质 DNA 的成功提取。请单击此处查看此图的较大版本.
| 议院麻雀 (过路人幼雏) | 削麻雀 (Spizella passerina) | 议院雀科 (Haemorhous mexicanus) | 美国罗宾 (鸫 migratorius) | 摇滚鸽子 (鸽莉薇莉) | |
| 收集的样本数 | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 提取的样品数 | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 精子采集成功率 | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
表 1: 迄今收集和提取的种类和样品.在出版时, 使用4雀物种和 1 columbid 所描述的协议来处理样品。精子收集成功率是指在尝试中成功获得的样本总数的百分比。
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Discussion
本文介绍了一种简单可靠的生殖活性条件下从中小鸟类采集精子的方法, 并从禽精中提取 DNA。
所描述的精子 DNA 提取协议是从一个简单的套件修改, 但被提炼为使用在禽类的精子。精子抗裂解的标准萃取化学品9,13, 从形收集的精样本是相当小的 (通常是少数升)。这些因素提出了在65° c 的情况下使用适当浓度的德勤和孵化成功克服的挑战。使用这种方法, 我们一直分离可用数量的 DNA qPCR 分析精子端粒长度 (通常在 40-250 ng/µL, 取决于射精量)。
以前, 使用过的是从禽精中提取 DNA, 并结合苯酚/氯仿反应13。苯酚/氯仿反应是有效的分离 DNA, 但他们更费时, 更危险和需要一个油烟罩。我们的提取协议的一个显著的限制是, 它只有在使用一个品牌和类型的提取试剂盒, 可能由于开始样品的体积小而成功。非常小的精子样本 (少于1µL) 或样本与低精密度可能阻止成功提取 dna 由于样本中的不足, 但我们没有遇到这个问题时, 泄殖腔按摩是对鸟类进行繁殖条件.为了避免这个问题, 泄殖腔按摩可以立即重复收集多个射精, 可以汇集, 以提取。
泄殖腔按摩已经在使用了几十年, 在许多物种1中,4,5,6,715,16,17, 是在许多情况下, 快速有效的收集禽精的方法。对于那些可以被捕获的野生或未经训练的鸟类的研究, 它比收集方法更有效, 它依赖于说服雄性鸟与某一物品交配, 并心甘情愿地将其精子存入4。另一个精子收集方法是通过解剖的睾丸或精 glomera, 但这不是一个选择为保护目的或重复采样4,14。泄殖腔推拿的主要局限性是无示范地学习技术的难点。书面说明往往不足以理解和学习实施过程。通过详细说明泄殖腔按摩, 我们希望减少学习时间和困难的人希望学习的技术。
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Disclosures
作者声明他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
我们感谢何塞诺格拉的早期协助泄殖腔按摩, 和杰弗里 Kittilson 的实验室支持。这项工作得到了 EPSCoR FAR0022429 奖对 BJH 的支持。出版费用得到了 NDSU 生物科学部的慷慨支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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