Summary
Denne protokol beskriver cloacal massage, en non-invasiv manuel teknik til opsamling af sæd fra fugle, og DNA-ekstraktion fra aviær sæd ved hjælp af en kommerciel udvinding kit med ændringer.
Abstract
Opsamling af sæd kan være nyttige for en bred vifte af applikationer, herunder undersøgelser, hvor sædkvalitet, sperm telomere dynamik og Epigenetik. Fugle er himmelvidt anvendte emner i biologisk forskning og er ideelle til undersøgelser der involverer gentagne sperm prøver. Men få ressourcer er i øjeblikket tilgængelig for dem, der ønsker at lære at indsamle og uddrag DNA fra aviær sperm. Her beskriver vi cloacal massage, en blid, ikke-invasiv manuel teknik til indsamling af aviær sperm. Selv om denne teknik er etableret i litteraturen, kan det være svært at lære fra de tilgængelige beskrivelser. Vi leverer også oplysninger til at udtrække DNA fra aviær sæd ved hjælp af en kommerciel udvinding kit med ændringer. Cloacal massage kan let anvendes på alle små til mellemstore mandlige fugl i reproduktiv tilstand. Efter samling, sæden kan bruges straks til motilitet assays, eller frosset til DNA-ekstraktion efter protokollen beskrevet heri. Denne ekstraktion protokol blev raffineret for aviær sperm og held har været anvendt på prøver, der opsamlet fra flere tyk arter (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusog Turdus migratorius ) og en columbid (Columba livia).
Introduction
Fugle er ideelle temaer for undersøgelser, hvor sædkvalitet og konkurrence1, sperm telomere dynamics2, Epigenetik3og lignende emner, som de er meget udbredt i biologisk forskning og sperm nemt kan udtages ved hjælp af cloacal massage. Cloacal massage er en blid, ikke-invasiv manuel teknik til opsamling af sæd fra fugle4,5,6. Gentagne prøver kan opnås nemt og ingen særlige værktøjer er nødvendige, hvilket gør det nemt at udføre i det felt eller lab. Selv om cloacal massage har været anvendt i årtier, er det svært at lære fra de tilgængelige skrevet beskrivelser. Denne publikation er beregnet til at reducere den tid og usikkerhed, der er involveret i at lære cloacal massage.
Sæd opsamlet fra fugle ved hjælp af cloacal massage kan bruges straks til motilitet vurdering4,7 eller kunstig befrugtning8eller frosset til andre anvendelsesformål såsom avanceret billedbehandling og DNA-ekstraktion. Sæd prøver fra tyk fugle er små men indeholder tætpakkede sædceller. DNA er udvundet ved hjælp af en kommerciel udvinding kit for enkelhed, med ændringer til at overvinde de beskyttende specialfunktioner sperm9. Efter ekstraktion, kan sperm telomerer måles ved hjælp af qPCR10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol omfatter hvirveldyr animalske emner og er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på North Dakota State University.
1. tyrestationer fra en spurvefugle ved hjælp af cloacal massage
Bemærk: Cloacal massage er en effektiv sæd samling teknik på reproduktivt aktive fugle kun, men kan udføres med succes uden for yngletiden i passende fangenskab situationer. Reproduktiv aktivitet bør fastsættes målarter inden brug cloacal massage. Denne teknik kan anvendes på vilde fugle ved indfangning eller fugle holdt i fangenskab.
- Begyndende med en mandlig fugl, (i avl betingelsen) bander's greb i den ikke-dominerende hånd, overføre fuglen til den dominerende hånd med sin ventrale side rørende palm (figur 1).
- Sikre, at fuglens hoved der er tættest på den laterale kant af håndfladen. Let sikre hoved og krop ved hjælp af pinky, ring og midterste fingre. Dette efterlader fuglens udluftning og hale udsat.
- Forlade fuglens ben løs eller let tilbageholdende med håndfladen.
Figur 1 : Greb for cloacal massage. Fuglen er sikret let i den dominerende hånd med sin ventrale side rørende palm og hoved sikret ved pinky finger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Placer den dominerende pegefinger og tommelfinger på begge sider af den overlegne ende af kloak og let klem fingrene sammen mens meget lille pressionsmiddel mod halen ( figur 2). Kloak vil evert, udsætter de cloacal slimhinde (pink interiør).
Bemærk: Hvis fuglen ikke er i øjeblikket producerer sæd, den cloacal forhøjning kan være små og kloak er vanskeligt at evert. Med erfaring er det let at skelne mellem cloacas af reproduktivt aktive og inaktive mænd5,11.
Figur 2 : Finger holdning og cloacal forhøjning. Evert kloak ved at anvende mindre pres på den overlegne ende (A). I et reproduktivt aktive mandlige spurvefugle, den cloacal forhøjning er indlysende og firma (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Med den ikke-dominerende hånd, Placer pegefingeren puden på den dorsale side af bunden af hale til at stabilisere hånden, og derefter placere spidsen af tommelfingeren lige under den everted kloak.
Bemærk: En kort og glat miniature er fordelagtige for udfører cloacal massage og beskytter fuglen fra utilsigtet skade. - Flyt ikke-dominerende tommelfinger dybt og cranially i en gentagne bevægelser med medium pres, opholder sig under kloak. Fortsætte indtil fuglen ejakulerer. Afhængigt af enkelt tager det typisk mellem 1 og flere dusin slag.
- Så snart fuglen ejakulerer, indsamle sæd i et microhematocrit rør. Gentag cloacal massage for at få flere ejakulerer.
Bemærk: Tyk sæd er lysebrune og typisk har en lidt tyk konsistens. Hvid eller mørke stoffer bortvist fra kloak er ikke sæd, og kan forurene sædprøven. Udseendet af en lille mængde af blod på kloak eller blandet i med sæden er normalt forårsaget af for meget pres under massage. - DNA-ekstraktion, læg sæden ind i et microcentrifuge rør med 20 µL 1 x PBS (pH 7,4). Bemærk: Sæd opbevares i 1 x PBS er ikke egnet til kunstig insemination, men kan bruges til DNA-ekstraktion senere når den opbevares ved-80 ° C. PBS kan være stuetemperatur eller kølet, men bør være i en flydende tilstand når sædprøven er deponeret.
- Bekræfte tilstedeværelsen af sædceller i prøven ved at få vist en lille mængde af de fortyndede prøve under et sammensat mikroskop (figur 3).
- Gemme den fortyndede sæd ved-80 ° C indtil udvinding.
2. udvinding af DNA fra fugl sæd
Bemærk: Denne protokol er blevet testet med flere kommercielle DNA udvinding kits, men det har kun været en succes, når det bruges med en DNA kit12. Trin, der er ændret fra kit-protokollen er angivet med *.
- Forberede en 1 M opløsning af dithiothreitol (DTT) i vand og blandes ved hjælp af en vortex.*
- Alikvot DTT løsning, og opbevar den ved-20 ° C indtil umiddelbart før brug. Hver prøve skal udtrækkes kræver 10 µL 1 M DTT solution.*
- Forberede en buffer, som indeholder 20 mM Tris-Cl, pH 8,0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; og 4% SDS. Hver prøve skal udtrækkes kræver 90 µL af denne buffer.*
- Gemme buffer ved stuetemperatur. Hvis det har fældet, varm det til 56 ° C til dissolve.*
- Forvarm en rugemaskine, der indeholder en rocker eller shaker til 65 ° C.*
- Umiddelbart før starten udvinding, Bland 10 µL DTT løsning med 90 µL af den buffer, der er udarbejdet i trin 2.2 for hver prøve skal udtrækkes, fx 900 µL buffer plus 100 µL DTT løsning hvis udvinding 10 prøver. Denne blanding vil blive kaldt DTT-buffer.*
- Tilføje 70 µL 1 x PBS til hele fortyndet sædprøven og bland godt ved hjælp af en vortex.*
- Tilsæt 100 µL DTT-buffer og 10 µL proteinase K løsning til prøven. Vortex i 20 sekunder, derefter inkuberes i forvarmet inkubator i 1 time på en rocker eller shaker.*
- Tilføje 200 µL buffer AL og 200 µL frisk EtOH (100%) og vortex for 20 sekunderer.*
- Overføre hele prøven til et spin kolonnen og centrifugeres 1 minut på 6.000 x g. udsmid collection tube.
- Placer kolonnen på et nyt rør og tilføje 500 µL forberedt buffer AW1. Der centrifugeres 1 minut på 6.000 x g. udsmid collection tube.
- Placer kolonnen på et nyt rør og tilføje 500 µL forberedt buffer AW2. Der centrifugeres i 1 minut ved 6.000 x g. kassere gennemstrømning og sted kolonnen tilbage på røret.
- Der centrifugeres 3 minutter på 20.000 x g. udsmid collection tube og placere kolonnen på en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Med pipette overfoeres 35 µL af AE buffer direkte på kolonne membran og inkuberes ved stuetemperatur til 5 minutes.*
- Der centrifugeres 1 minut på 14.000 x g. udsmid kolonnen spin og gemme udpakkede prøver ved-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cloacal massage og DNA udvinding ved hjælp af den beskrevne protokol er blevet udført på flere tyk arter og en columbid (tabel 1). Tilstedeværelsen af sædceller i sæd prøver indsamlet af cloacal massage blev bekræftet ved at få vist en lille mængde af de fortyndede prøver under en sammensat mikroskop på 400 X forstørrelse (figur 3). Efter udpakning DNA fra sæden prøver indsamlet fra huset spurve bruger protokollen beskrevet her, blev otte prøver kørt på gelelektroforese med DNA ladder (tre prøver kan ses i figur 4). Forskellige bands uden udtværing blev set i alle otte af de prøve baner, der angiver vellykket isolation af høj kvalitet DNA. Alle andre prøver, der er udvundet ved hjælp af denne protokol blev vurderet for DNA koncentration ved hjælp af et spektrofotometer (Se tabel 1).
Figur 3: sæd fra to små spurvefugle. Disse sædceller prøver blev fremstillet af cloacal massage fra en hus finch (Haemorhous mexicanus), venstre, og en house sparrow (Passer domesticus), højre, fanget i Fargo, ND i 2016. Prøverne blev hver fortyndes i 20 µL PBS og set under et sammensat mikroskop på 1.000 X og 400 X forstørrelse, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : DNA gel elektroforese af sæd DNA. Tre prøver af DNA ekstraheret fra Gråspurven sæd køre på en gel med et DNA ladder. Bemærk tilstedeværelsen af forskellige bands, der angiver vellykket ekstraktion af høj kvalitet DNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| House sparrow (Passer domesticus) | Flisning sparrow (Spizella passerina) | Hus finch (Haemorhous mexicanus) | Amerikanske robin (Turdus migratorius) | Rock pigeon (Columba livia) | |
| Antal prøver indsamlet | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Antal prøver udvundet | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Sæd samling succesrate | 98% | 75% | 100% | 47g | 47g |
Tabel 1: arter og prøver indsamlet og ekstraheret til datoen. Tidspunktet for publikation, er prøver blevet behandlet ved hjælp af den beskrevne protokol fra 4 tyk arter og 1 columbid. Sæd samling succesrate refererer til den procentdel af hver som en stikprøve blev med succes opnået ud af det samlede antal forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en simpel og pålidelig metode til indsamling af sæd fra små og mellemstore fugle i reproduktivt aktiv tilstand, og uddrager DNA fra aviær sperm.
Beskrevet sæd DNA udvinding protokollen er ændret fra et kit for enkelhed, men blev raffineret til brug på aviær sæd. Sæd er resistente over for lysering af standard udvinding kemikalier9,13, og sæd prøver indsamlet fra spurvefugle er ret lille (typisk et par microliters). Disse faktorer præsentere udfordringer, der er med held overvinde ved hjælp af en passende koncentration af DTT og inkubere ved 65 ° C. Brug denne metode, har vi konsekvent isoleret brugbare mængder DNA qPCR analyse af sperm telomere længde (typisk mellem 40-250 ng/µL, afhængigt af ejakulatvolumen).
DTT har tidligere været brugt til at udtrække DNA fra aviær sædceller i kombination med en fenol/chloroform reaktion13. Fenol/chloroform reaktioner er effektive til at isolere DNA, men de er mere tidskrævende, er mere farlige og kræver et stinkskab. En bemærkelsesværdig begrænsning af vores udvinding protokol er, at det kun har været vellykket, når det bruges med ét mærke og type af udvinding kit, muligvis på grund af den lille mængde starter prøven. Meget lille sæd prøver (mindre end 1 µL) eller prøver med lav sperm tæthed kan forhindre vellykket ekstraktion af DNA på grund af utilstrækkelig DNA findes i prøven, men vi har ikke oplevet dette problem når cloacal massage udføres på fugle i avl betingelsen . For at undgå dette problem, kan cloacal massage gentages umiddelbart for at indsamle flere ejakulerer, der kan samles til udvinding.
Cloacal massage har været i brug i årtier og i mange arter1,4,5,6,7,15,16,17, og er en hurtig og effektiv middel til opkrævning af sæd fra fugle i mange tilfælde. Til undersøgelser der involverer vilde eller utrænede fugle, der kan opfanges, det er mere effektivt end indsamlingsmetoder, der er afhængige af overbevisende en mandlig fugl til at parre sig med en vare og deponere sin sæd villigt4. En anden sæd samling metode er ved dissektion af testiklerne eller skelsættende glomera, men dette er ikke en mulighed for bevarelse eller gentagne prøveudtagninger4,14. Den primære begrænsning af cloacal massage er vanskeligheden i at lære teknikken uden demonstration. Skriftlige beskrivelser er ofte utilstrækkelige til at forstå og lære at gennemføre processen. Ved at illustrere cloacal massage i detaljer, håber vi at reducere læring tid og besvær for dem der ønsker at lære teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jose Noguera for tidlige bistand med cloacal massage, og Jeffrey Kittilson for lab støtte. Dette arbejde blev støttet af en ND EPSCoR FAR0022429 award til BJH. Udgifter blev generøst støttet af NDSU Department of Biological Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
