Summary
Dieses Protokoll beschreibt Blasenekstrophie Massage, eine nicht-invasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel und DNA-Extraktion aus Vogelgrippe Spermien mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen.
Abstract
Sammlung des Samens möglicherweise nützlich für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Studien, die Qualität der Spermien, Sperma Telomere Dynamik und Epigenetik. Vögel sind weit verbreitete Themen in der biologischen Forschung und sind ideal für Studien mit wiederholter Spermaproben. Einige Ressourcen sind jedoch derzeit für diejenigen, die lernen, wie man sammeln und Vogelgrippe Samenzellen DNA extrahieren. Hier beschreiben wir Blasenekstrophie Massage, eine sanfte, nicht-invasive manuelle Technik zur Vogelgrippe Sperma zu sammeln. Obwohl diese Technik in der Literatur hergestellt ist, kann es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen zu lernen sein. Wir bieten auch Informationen zur Extraktion von DNA aus Vogelgrippe Samen mit einem kommerziellen Extraktion Kit mit Modifikationen. Blasenekstrophie Massage kann leicht auf jede kleine bis mittlere männliche Vogel in reproduktive Zustand verwendet werden. Nach Sammlung kann das Sperma sofort für Motilität Assays verwendet oder eingefroren für DNA-Extraktion nach dem hier beschriebenen Protokoll. Diese Extraktion-Protokoll wurde für Vogelgrippe Sperma verfeinert und auf Proben von mehreren Sperlingsvögel (Passer Domesticus, Spizella Passerina Haemorhous Mexicanusund Turdus Migratorius erfolgreich eingesetzt ) und eine Columbid (Columba Livia).
Introduction
Vögel sind ideale Motive für Studien mit Spermien-Qualität und Wettbewerb1, Sperma Telomere Dynamik2Epigenetik3und ähnliche Themen, wie sie weit in der biologischen Forschung verbreitet sind und Spermien leicht entnommen werden können, mit Blasenekstrophie Massage. Blasenekstrophie Massage ist eine sanfte, nichtinvasive manuelle Technik zum Sammeln von Samen von Vögel4,5,6. Wiederholte Proben können leicht erhalten werden und sind keine Spezialwerkzeuge erforderlich, so dass es einfach in das Feld oder Labor durchzuführen. Obwohl Blasenekstrophie Massage seit Jahrzehnten im Einsatz gewesen ist, ist es schwierig, aus den verfügbaren Beschreibungen geschrieben zu lernen. Diese Veröffentlichung dient zur Verringerung der Zeit und Unsicherheit Blasenekstrophie Massage lernen.
Samen gesammelt von Vögel mit Blasenekstrophie Massage kann sofort für Motilität Bewertung4,7 oder künstliche Befruchtung8verwendet, oder für andere Nutzungen wie erweiterte Bildgebung und DNA-Extraktion eingefroren. Spermaproben von passerine Vögel sind klein, aber dicht gepackte Spermien enthalten. DNA wird mit einer kommerziellen Extraktion Kit für Einfachheit, mit Modifikationen, die speziellen Schutzfunktionen von Spermien9zu überwinden. Nach der Extraktion können Sperma Telomere mit qPCR10gemessen werden.
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Protocol
Dieses Protokoll beinhaltet vertebrate Tiere Themen und durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der North Dakota State University genehmigt wurde.
1. die Samengewinnung aus dem passerine Vogel mit Blasenekstrophie massage
Hinweis: Blasenekstrophie Massage ist eine wirksame Sperma Sammlung Technik auf nur reproduktiv aktive Vögel, aber außerhalb der Brutzeit im entsprechenden gefangen Situationen erfolgreich durchgeführt werden kann. Vermehrungstätigkeit sollte für Zielarten vor mit Blasenekstrophie Massage bestimmt werden. Diese Technik kann verwendet werden, auf Wildvögel bei der Erfassung oder Vögel in Gefangenschaft gehalten.
- Beginnend mit einem Männchen (bei der Zucht Zustand) Bander es halt in der nichtdominanten Hand übertragen den Vogel auf die dominante Hand mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche (Abbildung 1).
- Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Vogels am nächsten der seitliche Rand der Palme ist. Kopf und Körper mit dem kleinen Finger, Ring und Mittelfinger leicht zu sichern. Dies lässt des Vogels Vent und Tail ausgesetzt.
- Lassen Sie den Vogel Beine lose oder leicht zurückhaltend mit der Handfläche.
Abbildung 1 : Griff für Blasenekstrophie Massage. Der Vogel ist mit seiner ventralen Seite berühren die Handfläche und Kopf gesichert durch den kleinen Finger leicht in die dominante Hand gesichert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Legen Sie die dominanten Zeigefinger und Daumen auf beiden Seiten des überlegenen Ende der Kloake und auseinanderziehen Sie leicht der Finger während der Anwendung sehr leichten Druck in Richtung Heck ( Abbildung 2). Die Kloake wird evert, Freilegung der Blasenekstrophie Schleimhaut (rosa innen).
Hinweis: Wenn der Vogel nicht produziert derzeit Sperma, Blasenekstrophie Protuberanz kann klein sein und die Kloake ist schwierig, evert. Mit Erfahrung ist es leicht zu unterscheiden zwischen den Cloacas reproduktiv aktive und inaktive Männchen5,11.
Abbildung 2 : Finger Position und Blasenekstrophie Protuberanz. Evert der Kloake durch leichten Druck auf die überlegene Ende (A). In einem reproduktiv aktiven männlichen Botaniker Blasenekstrophie Protuberanz ist offensichtlich und Firma (B). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Legen Sie mit der nichtdominanten Hand das Pad des Zeigefingers an der dorsalen Seite der Schwanzwurzel, die Hand zu stabilisieren, und platzieren Sie die Spitze des Daumens direkt unter der ausladenden Kloake.
Hinweis: Kurze und glatte Miniaturansicht ist vorteilhaft für die Durchführung von Blasenekstrophie Massage und den Vogel vor Verletzungen schützt. - Den nicht-dominanten Daumen tief und cranially in eine sich ständig wiederholende Bewegungen mit mittlerem Druck, bleiben unterhalb der Kloake zu bewegen. Fortgesetzt, bis der Vogel ejakuliert. Abhängig von der Einzelperson geschieht dies in der Regel zwischen 1 und mehreren Dutzend Schläge.
- Sobald der Vogel ejakuliert, sammeln Sie das Sperma in einem Microhematocrit Rohr. Wiederholen Sie bei Massage um mehrere ejakuliert zu erhalten.
Hinweis: Sperlingsvögel Samen ist hellbraun und hat in der Regel eine etwas dicke Konsistenz. Weiße oder dunkle Stoffe aus der Kloake ausgeworfen nicht Sperma, und können die Samenprobe kontaminieren. Das Aussehen einer kleinen Menge von Blut auf der Kloake oder gemischt in mit das Sperma wird in der Regel verursacht durch zuviel Druck während der Massage. - Legen Sie für DNA-Extraktion das Sperma in einem Microcentrifuge Schlauch mit 20 µL 1 X PBS (pH 7,4). Hinweis: Samen mit 1 X PBS-Puffer gespeichert ist nicht geeignet für künstliche Befruchtung, aber kann für DNA-Extraktion zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden wenn bei-80 ° c gelagert Die PBS ist Raumtemperatur oder gekühlt, aber sollte in einem flüssigen Zustand sein, wenn die Samenprobe hinterlegt ist.
- Bestätigen Sie das Vorhandensein von Samenzellen in der Probe, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Probe unter dem Mikroskop Compound (Abbildung 3).
- Bis zur Extraktion lagern Sie der Samenlösung bei-80 ° C.
(2) Extraktion von DNA aus Vogel-Samen
Hinweis: Dieses Protokoll wurde mit mehreren kommerziellen DNA Extraktion Kits getestet, aber es wurde nur erfolgreich, wenn Sie mit einem DNA-Kit12verwendet. Schritte, die geändert werden aus dem Kit-Protokoll sind gekennzeichnet durch *.
- Bereiten Sie eine 1 M Lösung von Dithiothreitol (DTT) in Wasser und mischen mit einem vortex.*
- Aliquoten die DVB-t-Lösung und bei-20 ° C bis unmittelbar vor der Anwendung zu speichern. Jede Probe extrahiert werden erfordert 10 µL 1 M DVB-t-solution.*
- Bereiten Sie einen Puffer mit 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; und 4 % SDS. Jede Probe extrahiert werden erfordert 90 µL von diesem buffer.*
- Lagern Sie den Puffer bei Raumtemperatur. Wenn es ausgefällt hat, warm es auf 56 ° C zu dissolve.*
- Heizen Sie einen Inkubator mit einer Wippe oder Shaker auf 65 ° C.*
- Unmittelbar vor Beginn der Extraktion, mix 10 µL DVB-t-Lösung mit 90 µL des Puffers in Schritt 2.2 für jede Probe extrahiert werden, z. B. 900 µL Puffer plus 100 µL DVB-t-Lösung bereit, wenn 10 Proben zu extrahieren. Diese Mischung wird DVB-t-buffer.* aufgerufen werden
- Die gesamte verdünnte Samenprobe 70 µL 1 X PBS hinzu und mischen Sie gut mit einer vortex.*
- Hinzufügen von 100 µL DTT-Puffer und 10 µL Proteinase K-Lösung zur Probe. Wirbel für 20 Sekunden, dann brüten in den vorgewärmten Brutkasten für 1 Stunde auf einer Wippe oder shaker.*
- Fügen Sie 200 µL Puffer AL und 200 µL frische EtOH (100 %) und Vortex für 20 seconds.*
- Übertragen Sie das gesamte Sample auf einer Spin-Spalte und Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.
- Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und fügen Sie 500 µL vorbereitet Buffer AW1 hinzu. Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen.
- Legen Sie die Spalte auf einen neuen Schlauch und 500 µL vorbereitet Puffer AW2. Zentrifuge für 1 Minute bei 6.000 x g. verwerfen durchströmte und die Spalte mit der u-Bahn zurück.
- Zentrifugieren Sie 3 Minuten bei 20.000 x g. verwerfen das Sammelröhrchen und setzen Sie die Säule an einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
- Pipettieren 35 µL AE-Puffer direkt auf die Spalte Membran und in 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren
- Zentrifugieren Sie 1 Minute bei 14.000 x g. verwerfen die Spin-Spalte und speichern Sie entnommene Proben bei-80 ° C.
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Representative Results
Blasenekstrophie Massage und DNA-Extraktion verwenden, die das beschriebene Protokoll für mehrere Sperlingsvögel Arten und eine Columbid (Tabelle 1) ausgeführt wurde. Das Vorhandensein von Samenzellen im Spermaproben von Blasenekstrophie Massage wurde bestätigt, indem Sie anzeigen eine kleine Menge der verdünnten Proben unter dem Mikroskop Verbindung bei 400 X Vergrößerung (Abbildung 3). Nach Extraktion von DNA aus Spermaproben von Haussperlinge mit dem beschriebenen Protokoll hier gesammelt, wurden acht Proben für Gelelektrophorese mit einer DNA-Leiter ausgeführt (drei Proben sehen in Abbildung 4). Verschiedene Bands ohne Verschmieren wurden in alle acht der Probe Spuren, zeigt erfolgreiche Isolierung von hoher Qualität DNA gesehen. Alle anderen Proben extrahiert unter Verwendung dieses Protokolls wurden für die DNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer (siehe Tabelle 1) bewertet.
Abbildung 3: Sperma von zwei kleinen Singvögel. Diese Spermien Proben von Blasenekstrophie Massage von ein Haus Fink (Haemorhous Mexicanus), links, und ein Haussperling (Passer Domesticus), Recht, erhalten wurden gefangen in Fargo, ND in 2016. Die Proben waren jeweils in 20 µL PBS verdünnt und unter dem Mikroskop Verbindung bei 1.000 X und 400 X Vergrößerung bzw. angesehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : DNA gel-Elektrophorese der Samenzellen DNA. Drei Proben von DNA extrahiert vom Haussperling Sperma laufen auf einem Gel mit einer DNA-Leiter. Beachten Sie die Anwesenheit von verschiedenen Bands, zeigt erfolgreiche Gewinnung von qualitativ hochwertigen DNA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Haussperling (Passer Domesticus) | Chipping Sparrow (Spizella Passerina) | Haus Fink (Haemorhous Mexicanus) | Amerikanischer Robin (Turdus Migratorius) | Felsen-Taube (Columba Livia) | |
| Anzahl der Proben gesammelt | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Anzahl der Proben extrahiert | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Samen Erfolg Sammelquote | 98 % | 75 % | 100 % | 67 % | 67 % |
Tabelle 1: Arten und Proben gesammelt und bis dato extrahiert. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung wurden Proben mit dem beschriebenen Protokoll 4 Sperlingsvögel Arten und 1 Columbid verarbeitet. Samen Erfolg Sammelquote bezieht sich auf den Anteil der, den einzelnen für die eine Probe aus der Gesamtzahl versucht erfolgreich abgerufen wurde.
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Discussion
Wir beschreiben eine einfache und zuverlässige Methode für das Sammeln von Samen von kleinen und mittleren Vögel in reproduktiv aktiven Zustand und Extrahieren von DNA aus Vogelgrippe Sperma.
Die beschriebenen Samen DNA Extraktion Protokoll ist aus einem Bausatz für Einfachheit geändert, aber wurde für den Einsatz auf Vogelgrippe Sperma veredelt. Spermien sind resistent gegen lyse von standard-Extraktion Chemikalien9,13, und Spermaproben von Singvögel sind ziemlich klein (in der Regel wenige Mikroliter). Diese Faktoren stellen Herausforderungen dar, die erfolgreich überwunden werden, indem eine entsprechende Konzentration von DVB-t und Inkubation bei 65 ° C. Mit dieser Methode haben wir konsequent nutzbare Mengen DNA für qPCR Analyse der Spermien Telomerlänge (in der Regel zwischen 40-250 ng/µL, je nach Ejakulatvolumen) isoliert.
DVB-t wurde zuvor verwendet, um DNA aus Vogelgrippe Spermien in Kombination mit Phenol/Chloroform Reaktion13zu extrahieren. Phenol/Chloroform Reaktionen sind wirksam für die Isolierung von DNA, aber sie werden mehr Zeit in Anspruch, sind gefährlicher und erfordern eine Abzugshaube. Eine bemerkenswerte Einschränkung unserer Extraktion-Protokoll ist, dass es nur bei Verwendung einer Marke und Typ des Extraktion Kit, möglicherweise aufgrund des geringen Volumens der Probe ab erfolgreich war. Sehr kleine Samenproben (weniger als 1 µL) oder Proben mit geringe Spermien-Dichte können verhindern, dass erfolgreiche Extraktion von DNA durch unzureichende DNA in der Probe vorhanden, aber wir haben dieses Problem nicht angetroffen, wenn Blasenekstrophie Massage für Vögel bei der Zucht Zustand ausgeführt wird . Um dieses Problem zu vermeiden, kann Blasenekstrophie Massage sofort wiederholt werden, um mehrere ejakuliert zu sammeln, die für Extraktion gebündelt werden können.
Blasenekstrophie Massage wurde seit Jahrzehnten im Einsatz und in vielen Arten1,4,5,6,7,15,16,17, und ist ein schnelle und effektive Mittel zur Erfassung der Samen von Vögel in vielen Fällen. Für Studien mit wild oder ungeübte Vögel, die erfasst werden können, ist es effektiver als Methoden der Datenerhebung, die überzeugend ein Männchen kopulieren mit einem Element und seinen Samen freiwillig einzahlen abhängig4. Eine andere Methode der Sperma-Sammlung ist durch Dissektion der Hoden oder Samen-Glomera, aber dies ist keine Option für Zwecke der Bestandserhaltung oder wiederholte Bemusterung4,14. Die größte Einschränkung der Blasenekstrophie Massage ist die Schwierigkeit beim Erlernen der Technik ohne Demo. Schriftliche Beschreibungen sind oft nicht ausreichend zu verstehen und zu lernen, den Prozess zu implementieren. Durch die Darstellung Blasenekstrophie Massage im Detail, hoffen wir, Lernzeit und Schwierigkeiten für diejenigen, die die Technik erlernen zu reduzieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Jose Noguera für frühe Hilfen mit Blasenekstrophie Massage und Jeffrey Kittilson für Labor zu unterstützen. Diese Arbeit wurde durch einen ND EPSCoR FAR0022429 Award, BJH unterstützt. Publikationskosten waren der NDSU Abteilung der biologischen Wissenschaften großzügig unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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