Summary
이 프로토콜 cloacal 마사지를, 조류, 그리고 수정 상업 추출 키트를 사용 하 여 새 정자에서 DNA 추출에서 정액을 수집 하는 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다.
Abstract
정액의 컬렉션은 다양 한 정자의 품질, 정자 telomere 역학, 그리고 epigenetics 관련 된 연구를 포함 하 여 응용 프로그램에 대 한 유용할 수 있습니다. 새 생물학 연구에 널리 사용 되는 과목 이며 반복된 정자 샘플을 포함 하는 연구에 이상적입니다. 그러나, 몇 가지 리소스는 그 수집 및 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 방법을 배울 하고자 현재 사용할 수 있습니다. 여기는 cloacal 마사지, 조류 정자를 수집 하기 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술에 설명 합니다. 비록이 기술은 문학에서 설립, 그것은 사용 가능한 설명에서 배울 어려울 수 있습니다. 우리는 또한 상업적인 추출 키트를 사용 하 여 수정 하는 조류 정액에서 DNA를 추출에 대 한 정보를 제공 합니다. Cloacal 마사지는 생식 상태에서 어떤 중간 소형 남성 조류에 쉽게 사용할 수 있습니다. 컬렉션, 다음 정액 운동 성 분석에 대 한 즉시 사용 하거나 여기에 설명 된 프로토콜에 따라 DNA 추출에 대 한 동결 될 수 있습니다. 이 추출 프로토콜 조류 정자에 대 한 세련 되었고 여러 passerine 종 (통행 인 domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus및 Turdus migratorius에서에서 수집 된 샘플에서 성공적으로 사용 되었습니다. )와 1 개의 columbid (비둘기 리비아).
Introduction
새 생물학 연구에서 널리 이용 되 고 정자 수 쉽게 샘플링할 cloacal를 사용 하 여 정자 품질 및 경쟁1, 정자 telomere 역학2, epigenetics3및 유사한 주제를 포함 하는 연구를 위한 이상적인 주제는 마사지. Cloacal 마사지 새4,,56에서 정액을 모으기를 위한 부드러운, 비-침략 적 수동 기술입니다. 반복된 샘플을 쉽게 얻을 수 있습니다 그리고 특별 한 도구가 필요, 필드 또는 실험실에서 수행 하는 간단 하 합니다. Cloacal 마사지 수십 년 동안 사용 되었습니다, 비록 사용할 수 설명 작성에서 배울 하기가 어렵습니다. 이 게시는 시간과 cloacal 마사지 학습에 관련 된 불확실성을 줄일 것입니다.
Cloacal 마사지를 사용 하 여 새 들에서 수집 하는 정액 운동 성 평가4,7 또는8인공 수정 대 한 즉시 사용 하거나 고급 이미징, DNA 추출 등 다른 용도 대 한 동결 수 있습니다. Passerine 새에서 정액 샘플 작은 하지만 밀도가 포장된 정자를 포함. DNA는 정자9의 특수 보호 기능을 극복 하기 위해 수정 편의상 상업 추출 키트를 사용 하 여 추출 됩니다. 추출 후 정자 telomeres 정량10를 사용 하 여 측정 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜은 척추 동물 주제를 포함 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 다코타 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 정액 passerine 새 cloacal 마사지를 사용 하 여 컬렉션
참고: Cloacal 마사지 재생산으로 활동적인 새만, 효과적인 정액 컬렉션 기법 이지만, 적절 한 조임 상황에서 번 식 시즌 밖에 성공적으로 수행할 수 있습니다. 생식 활동 cloacal 마사지를 사용 하 여 이전 대상 종에 대 한 결정 되어야 합니다. 캡처 시 야생 조류 또는 조류 포로에서 개최에이 기술을 사용할 수 있습니다.
- (사육 조건)에 남성 새부터 손바닥 (그림 1)를 만지고 그것의 복 부 측으로 지배적인 손을 비 지배적인 손에 bander의 그립 전송 새.
- 새의 머리는 손바닥의 측면 가장자리에 가까운 인지 확인 합니다. 가볍게 머리와 몸을 핑 키, 반지, 그리고 가운데 손가락을 사용 하 여 보호 합니다. 이것은 조류의 환기와 꼬리 노출.
- 느슨한 또는 가볍게 손바닥을 사용 하 여 절제 된 새의 다리를 둡니다.
그림 1 : Cloacal 마사지에 대 한 그립. 새는 복 부 쪽 손바닥과 머리 핑 키 손가락에 의해 보안 감동 지배적인 손에 가볍게 확보 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 지배적인 검지와 엄지는 cloaca의 우수한 끝의 양쪽에 놓고 가볍게 함께 ( 그림 2) 꼬리 쪽으로 아주 약간의 압력을 적용 하는 동안 손가락을 꼬집어. cloaca cloacal 점 막 (핑크 인테리어) 노출 evert 것입니다.
참고: 새 하지 않으면 정액, 현재 생산 cloacal 융기 작은 수 고는 cloaca evert 어렵다. 경험, 재생산으로 활성 및 비활성 남성5,11의 cloacas 사이 분화 하기 쉽습니다.
그림 2 : 손가락 위치와 cloacal 융기. 우수한 끝 (A)을 약간의 압력을 적용 하 여는 cloaca evert. 재생산으로 활동적인 남성 참새목 cloacal 융기는 분명 하 고 회사 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 비 지배적인 손을 가진 안정 손, 꼬리의 기지의 등 쪽 측에 검지 손가락의 패드를 놓고 나왔으며 cloaca 바로 아래 엄지손가락의 끝을 놓습니다.
참고: 짧고 부드러운 축소판 cloacal 마사지를 수행 하기 위한 유리한 이며 실수로 부상에서 새를 보호 한다. - 아래는 cloaca 머물고, 중간 압력으로 반복적인 움직임에 cranially 깊은 비 지배적인 엄지 이동. 새는 사정 될 때까지 계속 합니다. 개인에 따라이 일반적으로 1, 몇몇 다스 선 사이의 걸립니다.
- 최대한 빨리 사정 하는 새, microhematocrit 튜브에 정액을 수집 합니다. 여러 ejaculates 얻기 위해 cloacal 마사지를 반복 합니다.
참고: Passerine 정액은 밝은 갈색 및 일반적으로 다소 두꺼운 견실 함이 있다. cloaca에서 배출 하는 흰색 또는 어두운 물질 정액, 고 정액 샘플을 오염 시킬 수 있습니다. cloaca에 혈액의 작은 금액의 외관에 혼합 또는 정액 일반적으로 마사지 하는 동안 너무 많은 압력에 의해 발생. - DNA 추출에 대 한 1 x PBS (pH 7.4)의 20 µ L 가진 microcentrifuge 관에 정액을 놓습니다. 참고: 1 x PBS에 저장 된 정액 인공 수정에 적합 하지 않습니다 하지만 DNA 추출 나중에 사용할 수 있습니다-80 ° c.에 저장 될 때 PBS 실내 온도 될 수 또는 냉장, 있지만 정액 샘플 예금 될 때 액체 상태에 있어야 한다.
- 적은 양의 화합물 현미경 (그림 3) 희석된 샘플을 보고 샘플에서 정자의 존재를 확인 합니다.
- 추출까지-80 ° C에 희석된 정액을 저장 합니다.
2입니다. 새 정액에서 DNA 추출
참고:이 프로토콜 여러 상업 DNA 추출 키트, 테스트 되었습니다 하지만 단지 하나의 DNA 키트12와 함께 사용 하면 성공 했습니다. 단계를 수정 키트 프로토콜에서 표시 됩니다 *.
- 물에서 dithiothreitol (DTT)의 1 분 솔루션을 준비 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 혼합
- 약 수 DTT 솔루션 사용 직전까지-20 ° C에서 그것을 저장 하 고. 각 샘플 추출에 필요한 1 M DTT solution.*의 10 µ L
- 20 mM Tris-Cl, pH 8.0;을 포함 하는 버퍼를 준비 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; 그리고 4 %SDS. 각 샘플 추출에 필요한이 buffer.*의 90 µ L
- 실 온에서 버퍼를 저장 합니다. 그것은 시 켰 던 경우 dissolve.*에 56 ° C에 따뜻한
- 포함 하는 로커 또는 65 흔드는 인큐베이터를 예 열 ° C.*
- 바로 시작 하기 전에 추출, 10 µ L DTT 솔루션 10 샘플을 추출 하는 경우 각 샘플을 추출, 예: 900 µ L 버퍼 플러스 100 µ L DTT 솔루션 단계 2.2에서에서 준비 하는 버퍼의 90 µ L 믹스. 이 혼합물 DTT buffer.* 라는 것입니다.
- 70 µ L 1 x PBS 전체 희석된 정액 샘플을 추가 하 고는 vortex.*를 사용 하 여 잘 혼합
- 100 µ L를 추가 DTT 버퍼 및 10 µ L 성분 K 솔루션 샘플을. 20 초간 소용돌이 다음 품 어 따뜻한 인큐베이터에서 1 시간 로커 또는 shaker.*에 대 한
- 200 µ L 버퍼 알 및 200 µ L 추가 신선한 EtOH (100%)와 20 seconds.*에 대 한 소용돌이
- 전체 샘플 스핀 열을 전송 하 고 원심 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브.
- 새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW1를 추가 합니다. 6000 x g. 삭제에서 1 분 컬렉션 튜브 원심.
- 새로운 튜브에 열을 놓고 500 µ L 준비 버퍼 AW2 추가 합니다. 6000 x g.에서 1 분간 원심 분리기는 흐름을 통해 장소와 열 튜브에 다시 삭제 합니다.
- 원심 20000 x g. 삭제 3 분 컬렉션 튜브 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브에는 열을 놓습니다.
- 피펫으로 35 AE의 µ L 열 막에 직접 버퍼 및 5 신속성에 대 한 실 온에서 품 어
- 원심 1 분 14000 x g. 삭제에서 스핀 열 고-80 ° c.에서 추출한 샘플을 저장
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Representative Results
Cloacal 마사지 그리고 DNA 추출을 사용 하 여 설명된 프로토콜 여러 passerine 종과 한 columbid (표 1)에서 수행 되었습니다. 정액 샘플 cloacal 마사지에 의해 수집 된에 정자의 존재는 400 배 확대 (그림 3)에서 복합 현미경 희석된 샘플의 작은 금액을 확인 하 여 확인 되었다. 집 참새는 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여에서 수집 하는 정액 샘플에서 DNA를 추출, 젤 전기 이동 법 (세 가지 예제는 그림 4에서 볼 수 있습니다) DNA 사다리와에 8 개의 샘플 실행 되었습니다. 번짐 없이 독특한 밴드 고품질 DNA의 성공적인 분리를 나타내는 샘플 레인의 모든 8에서 볼 수 있었다. 이 프로토콜을 사용 하 여 추출 하는 다른 모든 샘플 (참조 표 1) 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 대 한 평가 됐다.
그림 3: 두 개의 작은 passerines에서 정자. 이러한 정자 샘플 cloacal 마사지 집 피리 새 류 (Haemorhous mexicanus)에서 왼쪽 및 오른쪽, 집 참새 (통행 domesticus)에 의해 가져온 2016에서 파고, 노스다코타에 갇혀. 샘플 각 20 µ L PBS에 희석 되었고 각각 1000 X 400 X 배율에서 화합물 현미경 볼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : DNA 젤 전기 이동 법 정자 DNA의. DNA 사다리와 젤에서 실행 하는 집 참새 정액에서 추출 된 DNA의 3 개의 샘플. 독특한 밴드, 고품질 DNA 추출 나타내는 존재 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 하우스 참새 (통행 인 domesticus) | 치핑 참새 (Spizella passerina) | 집 피리 새 류 (Haemorhous mexicanus) | 아메리칸 로빈 (Turdus migratorius) | 바위 비둘기 (비둘기 리비아) | |
| 수집 된 샘플 수 | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 샘플 추출 수 | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| 정액 컬렉션 성공률 | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
표 1: 종 및 샘플 수집과 날짜 추출. 간행물의 때에 샘플 4 passerine 종과 1 columbid에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 처리 되었습니다. 정액 컬렉션 성공 속도는 각각의 샘플 성공적으로 얻은 시도 총 수의 비율을 말합니다.
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Discussion
재생산으로 활성 상태에 있는 중소 조류에서 정액을 수집 하 고 조류 정액에서 DNA를 추출 하는 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다.
설명된 정액 DNA 추출 프로토콜 편의상 키트에서 수정 했지만 조류 정액에서 사용 하기 위해 정제 된. 정자는 표준 추출 화학 물질9,13, 세포 및 passerines에서 수집 된 정액 샘플은 매우 작은 (일반적으로 몇 가지 microliters). 이러한 요소 및 65 ° c.에 잠복기 DTT의 적절 한 농도 사용 하 여 성공적으로 극복 과제 제시 이 방법을 사용 하 여, 우리는 지속적으로 고립 된 정자 telomere 길이 (일반적으로 사이 40-250 ng / µ L, 사정 볼륨에 따라)의 정량 분석에 대 한 사용 가능한 양의 DNA.
DTT는 이전 페 놀/클로 프롬 반응13와 함께에서 조류 정액에서 DNA를 추출에 사용 되었습니다. 페 놀/클로 프롬 반응 DNA를 분리 하는 데 효과가 있지만 그들은 더 많은 시간이 소요, 더 위험 하 고 증기 두건 필요. 우리의 추출 프로토콜의 주목할 만한 한계는 겨우 하나의 브랜드와 시작 하는 샘플의 작은 볼륨으로 인해 추출 키트의 종류와 함께 사용 하면 성공 이다. 아주 작은 정액 샘플 (1 µ L) 또는 낮은 정자 밀도 부족 한 DNA 샘플에 존재 때문에 DNA 추출 되지 않을 수 있습니다 하지만 cloacal 마사지 새 사육 조건에서 수행 하는 경우이 문제가 발생 하지 않았습니다 우리 . 이 문제를 방지 하려면 cloacal 마사지 추출 풀링된 수 있습니다 여러 ejaculates 수집에 즉시 반복할 수 있습니다.
Cloacal 마사지 및 많은 종1,4,5,6,7,15,,1617, 수십 년 동안 사용에서 되었습니다 그리고는 많은 경우에는 새에서 정액을 모으기의 신속 하 고 효과적인 의미 합니다. 캡처할 수 야생 또는 일반인 새를 포함 하는 연구에 대 한 항목을 쓰다 하 고 기꺼이 그의 정액을 예금 하 남성 새를 설득에 의존 하는 수집 방법 보다 더 효과적 이다4. 또 다른 정액 수집 방법 testes 또는 정액 glomera의 해 부에 의해 이지만 이것은 보존 목적 또는 반복된 샘플링4,14에 대 한 옵션. Cloacal 마사지의 기본 제한 데모 없이 기술을 학습에 어려움입니다. 서 면된 설명을 종종 이해 하 고 구현 하는 과정을 배울 충분 하지 않습니다. 자세하게에서 cloacal 마사지 설명, 여 그 기술을 배울 하고자 학습 시간과 어려움을 줄이기 위해 노력 하겠습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.
Acknowledgments
우리를 통해 초기 cloacal 마사지, 호세 Noguera를 감사 하 고 제프리 Kittilson 연구소에 대 한 지원. 이 작품을 BJH ND EPSCoR FAR0022429 수상에 의해 지원 되었다. 출판 비용 아낌없이 NDSU 학과 생물 과학을 지원 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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