Summary
Denne protokollen beskriver cloacal massasje, en ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling av sæd fra fugler og DNA utvinning fra avian sperm bruke en kommersiell utvinning kit med endringer.
Abstract
Samling av sæd kan være nyttig for en rekke applikasjoner inkludert studier med kvaliteten, sperm telomere dynamics og epigenetics. Fugler er brukte fag i biologiske, og er ideelle for studier som involverer gjentatte sperm prøver. Men er få ressurser tilgjengelige for de som ønsker å lære å samle og ekstra DNA fra avian sperm. Her beskriver vi cloacal massasje, en mild, ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling av avian sperm. Men denne teknikken er etablert i litteraturen, kan det være vanskelig å lære fra de tilgjengelige beskrivelsene. Vi gir også informasjon for uttrekking av DNA fra avian sæd ved hjelp av en kommersiell utvinning kit med modifikasjoner. Cloacal massasje kan enkelt brukes på alle små - og mellomstore mannlig fuglene i reproduktive tilstand. Følgende samling, sæd kan brukes umiddelbart for motilitet analyser eller frosset i DNA utvinning følger protokollen beskrevet her. Dette utvinning var raffinert for avian sædcellene og har blitt brukt på prøver fra flere ei gruppe arter (forbipasserende domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusog Turdus migratorius ) og en columbid (Columba livia).
Introduction
Fugler er ideelle fag for studier som involverer kvaliteten og konkurranse1, sperm telomere dynamics2, epigenetics3og lignende emner, som mye brukt i biologisk forskning og sperm kan lett samplet bruker cloacal massasje. Cloacal massasje er en mild, ikke-invasiv manuell teknikk for innsamling sæd fugler4,5,6. Gjentatt prøvene kan hentes lett spesial verktøy er nødvendig, noe som gjør det enkelt å utføre i feltet eller laboratorium. Selv cloacal massasje har vært i bruk i flere tiår, er det vanskelig å lære fra tilgjengelig skrevet beskrivelser. Denne publikasjonen er ment å redusere tid og usikkerhet involvert i å lære cloacal massasje.
Sæd fra fugler bruke cloacal massasje kan brukes umiddelbart for motilitet vurdering4,7 eller kunstig insemination8eller frosset for andre bruksområder som avansert bildebehandling og DNA utvinning. Sæd prøver fra ei gruppe fugler er små, men inneholder tettpakkede sperm. DNA trekkes ut ved hjelp av en kommersiell utvinning kit for enkelhet, med modifikasjoner å overvinne de beskyttende spesialfunksjoner sperm9. Etter ekstraksjon, kan sperm telomeres måles med qPCR10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen innebærer vertebrate dyr fag og er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved North Dakota State University.
1. semen samling fra en ei gruppe fugl bruker cloacal massasje
Merk: Cloacal massasje er en effektiv sæd teknikk på reproductively aktive fugler bare, men kan være utført utenfor hekkesesongen i riktig fange situasjoner. Reproduktive aktivitet bør fastsettes for målet artene før cloacal massasje. Denne teknikken kan brukes på ville fugler på fange eller fugler holdt i fangenskap.
- Starter med en mannlig fugl, (i avl tilstand) bander's grep i den ikke-dominante hånden, overføre fuglen til den dominerende siden med sin ventral side berører håndflaten (figur 1).
- Kontroller at fuglens hodet er nærmest laterale kanten av palm. Lett sikre hodet og kroppen pinky, ring og midten finger. Dette etterlater fuglens ventil og hale utsatt.
- La fuglens Ben løs eller lett tilbakeholdne med håndflaten.
Figur 1 : Grep for cloacal massasje. Fuglen er sikret lett i dominerende hånden med sin ventral side berøre palm og hodet sikret av pinky med fingeren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Plasser den dominerende pekefingeren og tommelen på hver side av overlegen slutten av den tidligere imot kloakk og lett knipe fingrene sammen mens søknad svært lett trykk mot halen ( figur 2). Den tidligere imot kloakk vil evert, utsette cloacal mucosa (rosa interiør).
Merk: Hvis fuglen ikke produserer sæd, cloacal fremspringet kan være små og den tidligere imot kloakk er vanskelig å evert. Med erfaring er det enkelt å skille mellom cloacas av reproductively aktive og inaktive menn5,11.
Figur 2 : Finger posisjon og cloacal fremspringet. Evert den tidligere imot kloakk ved å bruke lett trykk overlegen slutten (A). En reproductively aktive mannlige spurvefugler, cloacal fremspringet er åpenbart og firmaet (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Med ikke-dominante hånd, plasser puten til pekefingeren på dorsal side av foten av halen å stabilisere hånd, og deretter plassere tommelen rett under everted på tidligere imot kloakk.
Merk: En kort og glatt miniatyr er fordelaktig for å utføre cloacal massasje og beskytter fuglen fra utilsiktet skade. - Flytte ikke-dominante tommelen dypt og cranially i en repeterende bevegelse med middels press, opphold under den tidligere imot kloakk. Fortsett til fuglen ejakulerer. Avhengig av enkelt tar dette vanligvis mellom 1 og flere dusin slag.
- Så snart fuglen ejakulerer, samle sæd i et microhematocrit rør. Gjenta cloacal massasje for å få flere ejakulerer.
Merk: Ei gruppe sæd er lys brun og har vanligvis en litt tykk konsistens. Hvit eller mørk stoffer ut fra den tidligere imot kloakk er ikke sæd, og kan smitte sæden. Utseendet til en liten mengde blod på den tidligere imot kloakk eller blandet i med sæd forårsakes vanligvis av for mye press under massasje. - For DNA utvinning, plassere sæd inn i et microcentrifuge rør med 20 µL av 1 x PBS (pH 7.4). Merk: Sæd lagret i 1 x PBS er ikke egnet for kunstig insemination, men kan brukes for DNA utvinning senere når lagret på-80 ° C. PBS kan romtemperatur eller kjølt, men bør være i flytende form når sæden avsettes.
- Påvise sperm i prøven ved å vise litt utvannet prøven under sammensatte mikroskop (Figur 3).
- Lagre utvannet sæd ved-80 ° C til utvinning.
2. utvinning av DNA fra fugl sæd
Merk: Denne protokollen har blitt testet med flere kommersielle DNA utvinning kits, men det har bare vært vellykket når den brukes med en DNA kit12. Trinnene som endres fra kit protokollen angis med *.
- Forberede en 1 M løsning av dithiothreitol (DTT) i vann og bland med en vortex.*
- Aliquot DTT løsningen og lagre den på 20 ° C til like før bruk. Hver pakkes ut krever 10 µL av 1 M DTT solution.*
- Forberede en buffer som inneholder 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM NaCL; og 4% SDS. Hver pakkes ut krever 90 µL av denne buffer.*
- Lagre bufferen ved romtemperatur. Hvis det har forårsaket, varme det til 56 ° C til dissolve.*
- Forvarm en inkubator som inneholder en rocker eller shaker til 65 ° C.*
- Umiddelbart før du begynner utvinning, bland 10 µL DTT løsning med 90 µL bufferen som utarbeidet i trinn 2.2 for hver eksempel pakkes, f.eks 900 µL buffer pluss 100 µL DTT løsning hvis utpakking 10 prøver. Denne blandingen vil bli kalt DTT-buffer.*
- Legg 70 µL 1 x PBS til hele utvannet sæden og bland godt med en vortex.*
- Legge til 100 µL DTT-buffer og 10 µL proteinasen K løsning til prøven. Vortex 20 sekunder, deretter ruge i forvarmet inkubator i 1 time på en rocker eller shaker.*
- Legge til 200 µL buffer AL og 200 µL frisk EtOH (100%) og vortex for 20 seconds.*
- Overføre hele utvalget til en spinn kolonne og sentrifuge 1 minutt 6000 x g. Forkast samling røret.
- Plasser kolonnen på en ny tube og legge 500 µL forberedt buffer AW1. Sentrifuge 1 minutt 6000 x g. Forkast samling røret.
- Plasser kolonnen på en ny tube og legge 500 µL forberedt buffer AW2. Sentrifuger i 1 minutt på 6000 x g. kast gjennomflytsenhet og sted kolonnen tilbake på røret.
- Sentrifuge 3 minutter på 20.000 x g. Forkast samling rør og plasser kolonnen på en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Pipetter 35 µL av AE bufferen direkte på kolonnen membranen og Inkuber ved romtemperatur for 5 minutter.*
- Sentrifuge 1 minutt 14.000 x g. Forkast kolonnen spinn og lagre utdraget prøver på-80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cloacal massasje og DNA utvinning bruker beskrevet protokollen er utført på flere ei gruppe arter og en columbid (tabell 1). Tilstedeværelsen av sæd i sæd prøver innsamlet av cloacal massasje ble bekreftet ved å vise litt av fortynnede prøvene under sammensatte mikroskop på 400 X forstørrelse (Figur 3). Når utdrager DNA fra sæd prøver fra huset spurver ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, ble åtte prøver kjørt på gel geleelektroforese en DNA stige (tre eksempler kan sees på Figur 4). Forskjellige band uten flekker ble sett i alle åtte av eksempel baner, indikerer vellykket isolering av høy kvalitet DNA. Alle andre prøver utdraget benytter denne protokollen ble vurdert for DNA konsentrasjon bruker et spektrofotometer (se tabell 1).
Figur 3: Sperm fra to små spurvefugler. Disse sperm prøver ble innhentet av cloacal massasje fra en huset finch (Haemorhous mexicanus), venstre, og en Gråspurv (forbipasserende domesticus), rett, fanget i Fargo, ND i 2016. Prøvene ble hver fortynnet i 20 µL PBS og vises under sammensatte mikroskop på 1000 X og 400 X forstørrelse, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : DNA gel geleelektroforese av sæd DNA. Tre eksempler på DNA utvunnet fra Gråspurv sæd kjøre på en gel en DNA stige. Legg merke til tilstedeværelsen av forskjellige band, indikerer vellykket utvinning av høy kvalitet DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gråspurv (forbipasserende domesticus) | Brunissespurv (Spizella passerina) | Huset finch (Haemorhous mexicanus) | Amerikanske robin (Turdus migratorius) | Rock pigeon (Columba livia) | |
| Antallet eksempler samlet | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Antallet eksempler Hentet | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Sæd samling suksessrate | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
Tabell 1: arter og prøver innsamlet og utdraget ennå. På tidspunktet for utgivelsen, er prøver behandlet ved hjelp av beskrevet protokollen fra 4 ei gruppe arter og 1 columbid. Sæd samling suksessrate refererer til prosentandelen av hver som en prøve var med hell fått ut av det totale antallet forsøkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en enkel og pålitelig metode for innsamling av sæd fra små og mellomstore fugler i reproductively aktiv tilstand og utdrager DNA fra avian sperm.
Beskrevet sæd DNA utvinning protokollen endres fra et kit for enkelhet, men ble raffinert for bruk på avian sæd. Sperm er motstandsdyktig mot lysis av standard utvinning kjemikalier9,13, og sæd prøver fra spurvefugler er ganske liten (vanligvis noen microliters). Disse faktorene presentere utfordringer som er vellykket overvinne ved hjelp av en passende konsentrasjon av DTT og rugende på 65 ° C. Bruker denne metoden, har vi konsekvent isolert brukbare mengder DNA for qPCR analyse av sæd telomere lengde (vanligvis mellom 40-250 ng/µL, avhengig av ejaculate volum).
DTT har tidligere blitt brukt til å trekke ut DNA fra avian sperm i kombinasjon med en fenol/kloroform reaksjon13. Fenol/kloroform reaksjoner er effektive for å isolere DNA, men de er mer tidkrevende, er mer farlig og krever avtrekksvifte. En kjent begrensning av våre utvinning-protokollen er at den bare var vellykket når det brukes med en merkevare og type utvinning kit, muligens på grunn av lite antall starter utvalg. Svært liten sæd prøver (mindre enn 1 µL) eller prøver med lav sperm tetthet kan hindre vellykket utvinning av DNA på grunn av utilstrekkelig DNA i prøven, men vi har ikke støtt på denne problem når cloacal massasje utføres på fugler i avl tilstand . For å unngå dette problemet, kan cloacal massasje gjentas umiddelbart for å samle flere ejaculates som kan samordnes for utvinning.
Cloacal massasje har vært i bruk i flere tiår og mange arter1,4,5,6,7,15,16,17, og er et rask og effektiv måte å samle sæd fra fugler i mange tilfeller. For studier som involverer vill eller utrent fugler som kan hentes, er det mer effektivt enn samling metoder som bruker overbevise en mannlig fuglen å pare med et element og sette sin sæd frivillig4. En annen sæd samling metoden er Disseksjon av testiklene eller banebrytende glomera, men dette er ikke et alternativ for bevaring formål eller gjentatte prøvetaking4,14. Den største begrensningen cloacal massasje er vanskeligheten i å lære teknikken uten demonstrasjon. Skriftlige beskrivelser er ofte nok til å forstå og lære å gjennomføre prosessen. Ved å illustrere cloacal massasje i detalj, håper vi å redusere læring og vanskeligheter for de som ønsker å lære teknikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Jose Noguera for tidlig hjelp med cloacal massasje og Jeffrey Kittilson for laboratorium støtte. Dette arbeidet ble støttet av en ND EPSCoR FAR0022429 prisen til likevel. Publikasjonen kostnader ble sjenerøst støttet av NDSU departementet av biologisk vitenskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T.
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA 'fingerprints'. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).
- QIAamp DNA Micro Handbook. , Third edition (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
