Summary
इस प्रोटोकॉल cloacal मालिश, पक्षियों से वीर्य इकट्ठा करने के लिए एक गैर इनवेसिव पुस्तिका तकनीक का वर्णन है, और एवियन शुक्राणु से डीएनए निष्कर्षण संशोधनों के साथ एक वाणिज्यिक निष्कर्षण किट का उपयोग कर ।
Abstract
वीर्य का संग्रह शुक्राणु गुणवत्ता, शुक्राणु telomere गतिशीलता, और epigenetics शामिल अध्ययन सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी हो सकता है । पक्षी व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान में विषयों का इस्तेमाल कर रहे है और दोहराया शुक्राणु नमूनों को शामिल अध्ययन के लिए आदर्श होते हैं । हालांकि, कुछ संसाधनों को कैसे इकट्ठा करने और एवियन शुक्राणु से डीएनए निकालने के लिए सीखने के इच्छुक लोगों के लिए वर्तमान में उपलब्ध हैं । यहां हम cloacal मालिश, एक सज्जन, गैर इनवेसिव मैनुअल तकनीक का वर्णन एवियन शुक्राणु इकट्ठा करने के लिए । हालांकि इस तकनीक को साहित्य में स्थापित किया गया है, लेकिन उपलब्ध विवरण से सीखना मुश्किल हो सकता है । हम भी एवियन वीर्य से डीएनए निकालने के लिए संशोधनों के साथ एक वाणिज्यिक निष्कर्षण किट का उपयोग करने के लिए जानकारी प्रदान करते हैं । Cloacal मालिश आसानी से प्रजनन हालत में किसी भी छोटे-से मध्यम आकार के नर पक्षी पर इस्तेमाल किया जा सकता है । संग्रह के बाद, वीर्य गतिशीलता परख के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, या डीएनए निष्कर्षण के लिए जमे हुए प्रोटोकॉल निंनलिखित यहां वर्णित है । इस निष्कर्षण प्रोटोकॉल एवियन शुक्राणु के लिए परिष्कृत किया गया था और सफलतापूर्वक कई passerine प्रजातियों से एकत्र नमूनों पर इस्तेमाल किया गया है (राहगीर domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, और Turdus migratorius ) और एक columbid (Columba livia) ।
Introduction
पक्षियों शुक्राणु गुणवत्ता और प्रतियोगिता1, शुक्राणु telomere गतिशीलता2, epigenetics3, और इसी तरह के विषयों को शामिल अध्ययन के लिए आदर्श विषयों रहे हैं, के रूप में वे व्यापक रूप से जैविक अनुसंधान और शुक्राणु में उपयोग किया जाता है आसानी से cloacal का उपयोग कर सकते है नमूना मालिश. Cloacal मालिश पक्षी4,5,6से वीर्य इकट्ठा करने के लिए एक सौंय, गैर इनवेसिव मैनुअल तकनीक है । दोहराया नमूनों आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता है, यह सरल करने के लिए क्षेत्र या प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं । हालांकि cloacal मालिश दशकों के लिए उपयोग में किया गया है, यह उपलब्ध लिखित विवरण से जानने के लिए मुश्किल है । इस प्रकाशन के लिए समय और cloacal मालिश सीखने में शामिल अनिश्चितता को कम करना है ।
cloacal मालिश का उपयोग कर पक्षियों से एकत्र वीर्य गतिशीलता आकलन4,7 या कृत्रिम गर्भाधान के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है8, या ऐसे उंनत इमेजिंग और डीएनए निष्कर्षण के रूप में अंय का उपयोग करता है के लिए जमे हुए । passerine पक्षियों से वीर्य के नमूने छोटे होते हैं लेकिन घनी पैक्ड शुक्राणु होते हैं. डीएनए सादगी के लिए एक वाणिज्यिक निष्कर्षण किट का उपयोग कर निकाला जाता है, संशोधनों के साथ शुक्राणु के विशेष सुरक्षात्मक सुविधाओं को दूर करने के लिए9. निष्कर्षण के बाद, शुक्राणु telomeres qPCR10का उपयोग कर मापा जा सकता है ।
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Protocol
इस प्रोटोकॉल हड्डीवाला पशु विषयों शामिल है और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति उत्तर डकोटा राज्य विश्वविद्यालय में (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।
1. एक passerine पक्षी से वीर्य संग्रह cloacal मालिश का उपयोग
नोट: Cloacal मालिश केवल सक्रिय पक्षियों पर एक प्रभावी वीर्य संग्रह तकनीक है, लेकिन उचित बंदी स्थितियों में प्रजनन के मौसम के बाहर सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया जा सकता है । प्रजनन गतिविधि cloacal मालिश का उपयोग करने से पहले लक्ष्य प्रजातियों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । इस तकनीक पर कब्जा करने पर या कैद में आयोजित पक्षियों पर जंगली पक्षियों पर इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- एक पुरुष पक्षी के साथ शुरू, (प्रजनन हालत में) गैर-प्रमुख हाथ में बैंडर की पकड़, अपने ventral पक्ष के साथ प्रमुख हाथ से पक्षी हस्तांतरण हथेली छू (चित्रा 1) ।
- सुनिश्चित करें कि पक्षी के सिर हथेली के पार्श्व किनारे के पास है । हल्के से सिर और गुलाबी रंग का उपयोग कर शरीर को सुरक्षित, अंगूठी, और मध्यम उंगलियों । इससे पक्षी की भड़ास और पट अल्पायु हो जाते हैं.
- पक्षी के पैरों को ढीला छोड़ दें या हल्के से हथेली का उपयोग करते हुए रोका जाए ।
चित्र 1 : cloacal मालिश के लिए पकड़ । पक्षी अपनी ventral ओर हथेली और गुलाबी रंग की उंगली से सुरक्षित सिर को छूने के साथ प्रमुख हाथ में हल्के से सुरक्षित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- क्लोअका के बेहतर अंत के दोनों ओर से प्रमुख सूचकांक उंगली और अंगूठे प्लेस और हल्के उंगलियों चुटकी एक साथ जबकि पूंछ की ओर बहुत मामूली दबाव ( चित्रा 2) लागू । क्लोअका एवर्ट, cloacal म्यूकोसा (गुलाबी इंटीरियर) को उजागर करेगा ।
नोट: यदि पक्षी वर्तमान में वीर्य का उत्पादन नहीं कर रहा है, तो cloacal की अवधि छोटी हो सकती है और क्लोअका को एवर्ट मुश्किल हो सकता है । अनुभव के साथ, यह आसानी से प्रतिक्रियाशील और निष्क्रिय नर के cloacas के बीच अंतर करने के लिए है5,11.
चित्र 2 : फिंगर पोजीशन और cloacal । एवर्ट ने क्लोअका को थोड़ा सा दबाव डाल कर सुपीरियर एंड (A) कर डाला । एक प्रतिक्रियाशील पुरुष passerine में, cloacal का उत्पादन स्पष्ट और फर्म (बी) है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
- गैर प्रमुख हाथ के साथ, पूंछ के आधार के पृष्ठीय पक्ष पर तर्जनी उंगली के पैड जगह के लिए हाथ स्थिर, और फिर अंगूठे की नोक जगह बस umbilicus क्लोअका नीचे है ।
नोट: एक छोटी और चिकनी थंबनेल cloacal मालिश प्रदर्शन के लिए लाभप्रद है और आकस्मिक चोट से पक्षी की रक्षा । - मध्यम दबाव के साथ एक दोहराव गति में गैर प्रमुख अंगूठे गहरी और कपाल हटो, क्लोअका नीचे रह । जारी रखें जब तक पक्षी बोल पड़ना । व्यक्ति के आधार पर, यह आमतौर पर 1 और कई दर्जन स्ट्रोक के बीच लेता है ।
- जैसे ही चिड़िया बोल पड़ना, वीर्य को एक microhematocrit ट्यूब में लीजिए. दोहराने cloacal मालिश एकाधिक बोल पड़ना प्राप्त करने के लिए ।
नोट: Passerine वीर्य हल्का भूरा होता है और सामान्यतया कुछ मोटी संगति होती है । क्लोअका से निकाले गए सफ़ेद या काले पदार्थ वीर्य नहीं हैं, और वीर्य के नमूने को दूषित कर सकते हैं । क्लोअका या वीर्य के साथ में मिश्रित पर रक्त की एक छोटी राशि की उपस्थिति आमतौर पर मालिश के दौरान बहुत अधिक दबाव के कारण होता है । - डीएनए निष्कर्षण के लिए, microcentrifuge ट्यूब में वीर्य को 1x पंजाबियों (pH ७.४) के 20 µ l के साथ रखें । नोट: 1x पंजाबियों में संग्रहित वीर्य कृत्रिम गर्भाधान के लिए उपयुक्त नहीं है, लेकिन एक बाद की तारीख पर डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत । पंजाबियों के कमरे का तापमान या ठंडा हो सकता है, लेकिन वीर्य का नमूना जमा होने पर तरल अवस्था में रहना चाहिए ।
- एक यौगिक माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत पतला नमूना की एक छोटी राशि को देखने के द्वारा नमूने में शुक्राणु की उपस्थिति की पुष्टि करें.
- -८० ° c निष्कर्षण तक पतला वीर्य स्टोर ।
2. पक्षी वीर्य से डीएनए का निष्कर्षण
नोट: इस प्रोटोकॉल कई वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट के साथ परीक्षण किया गया है, लेकिन यह केवल सफल रहा है जब एक डीएनए किट12के साथ प्रयोग किया जाता है । किट प्रोटोकॉल से संशोधित किए गए चरण * द्वारा दर्शाई गई हैं ।
- एक भंवर का उपयोग कर पानी और मिश्रण में dithiothreitol (डीटीटी) के एक 1 मीटर समाधान तैयार करें ।
- Aliquot डीटीटी समाधान और यह दुकान पर-20 ° c तुरंत उपयोग करने से पहले जब तक । निकाला जा करने के लिए प्रत्येक नमूने की आवश्यकता 10 µ l के 1 M डीटीटी समाधान. *
- 20 मिमी Tris-सीएल, पीएच ८.० युक्त एक बफर तैयार; 20 मिमी EDTA; २०० मिमी NaCL; और 4% एसडीएस । निकाला जा करने के लिए प्रत्येक नमूने इस बफ़र के ९० µ l की आवश्यकता है. *
- कमरे के तापमान पर बफर स्टोर । यह उपजी है, तो इसे भंग करने के लिए ५६ ° c करने के लिए गर्म है ।
- पहले से गरम एक झूली कुरसी या ६५ डिग्री सेल्सियस के लिए शेखर युक्त एक मशीन. *
- तुरंत निष्कर्षण शुरू करने से पहले, मिश्रण 10 µ l डीटीटी समाधान के साथ ९० µ l के लिए प्रत्येक नमूना निकाला जा करने के लिए २.२ चरण में तैयार की, उदा ९०० µ l बफ़र प्लस १०० µ l डीटीटी समाधान यदि 10 नमूने निकालने. इस मिश्रण को डीटीटी-बफर कहा जाएगा. *
- पूरे पतला वीर्य के नमूने के लिए ७० µ एल 1x पंजाबियों जोड़ें और अच्छी तरह से एक भंवर का उपयोग कर मिश्रण ।
- जोड़ें १०० µ l डीटीटी-बफर और 10 µ l proteinase K समाधान नमूना करने के लिए. 20 सेकंड के लिए भंवर, तो एक झूली कुरसी या शेखर पर 1 घंटे के लिए पहले से गरम करना मशीन में गर्मी ।
- जोड़ें २०० µ एल बफर अल और २०० µ एल ताजा ेतोः (१००%) और भंवर 20 सेकंड के लिए. *
- एक स्पिन कॉलम के लिए पूरे नमूने हस्तांतरण और ६,००० x g पर 1 मिनट के केंद्रापसारक संग्रह ट्यूब त्यागें ।
- एक नई ट्यूब पर कॉलम प्लेस और जोड़ें ५०० µ l तैयार बफर AW1 । ६,००० x जी पर 1 मिनट के केंद्रापसारक संग्रह ट्यूब त्यागें ।
- एक नई ट्यूब पर कॉलम प्लेस और जोड़ें ५०० µ l तैयार बफर AW2 । ६,००० x जी पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक के लिए प्रवाह के माध्यम से त्यागें और कॉलम ट्यूब पर वापस जगह है ।
- २०,००० x जी पर 3 मिनट के केंद्रापसारक संग्रह ट्यूब त्यागें और एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब पर कॉलम जगह है ।
- एई बफर के प्लास्टिक ३५ µ एल सीधे स्तंभ झिल्ली पर और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
- १४,००० x g पर 1 मिनट के लिए स्पिन कॉलम त्यागें और-८० डिग्री सेल्सियस पर निकाले नमूनों की दुकान ।
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Representative Results
Cloacal मालिश और डीएनए निष्कर्षण वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई passerine प्रजातियों और एक columbid पर प्रदर्शन किया गया है (तालिका 1) । cloacal मालिश द्वारा एकत्र वीर्य के नमूनों में शुक्राणु की उपस्थिति 400X आवर्धन पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत पतला नमूनों की एक छोटी राशि को देखने के द्वारा पुष्टि की गई थी (चित्रा 3) । घर गौरैया से एकत्र वीर्य के नमूनों से डीएनए निकालने के बाद यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, आठ नमूने जेल ट्रो पर एक डीएनए सीढ़ी के साथ चलाया गया (तीन नमूने चित्रा 4में देखा जा सकता है). धब्बा के बिना अलग बैंड नमूना गलियों के सभी आठ में देखा गया, उच्च गुणवत्ता के डीएनए के सफल अलगाव का संकेत है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर निकाले गए अंय सभी नमूनों डीएनए एकाग्रता के लिए मूल्यांकन किया गया एक spectrophotometer का उपयोग ( तालिका 1देखें) ।
चित्रा 3: शुक्राणु दो छोटे passerines से । ये शुक्राणु के नमूने एक घर फिंच (Haemorhous mexicanus), बाएँ, और एक घर गौरैया (राहगीर domesticus) से cloacal मालिश द्वारा प्राप्त किए गए थे, ठीक है, फारगो में फंस, २०१६ में एनडी. नमूने एक 20 µ l पंजाब में पतला और 1, 000X और 400X आवर्धन, क्रमशः पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप के नीचे देखा गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : शुक्राणु डीएनए के डीएनए जेल ट्रो । डीएनए के तीन नमूने घर से निकाले गौरैया वीर्य एक डीएनए सीढ़ी के साथ एक जेल पर चला । अलग बैंड की उपस्थिति, उच्च गुणवत्ता वाले डीएनए के सफल निष्कर्षण का संकेत नोट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| घर गौरैया (passion domesticus) | छिल गौरैया (Spizella passerina) | घर फिंच (Haemorhous mexicanus) | अमेरिकन रॉबिन (Turdus migratorius) | रॉक कबूतर (Columba livia) | |
| एकत्र नमूनों की संख्या | १५६ | 3 | 2 | 2 | 2 |
| निकाले गए नमूनों की संख्या | ९० | 3 | 2 | 2 | 2 |
| वीर्य संग्रह सफलता दर | ९८% | ७५% | १००% | 47g | 47g |
तालिका 1: प्रजातियों और नमूनों एकत्र और तारीख को निकाले. प्रकाशन के समय, नमूनों 4 passerine प्रजातियों और 1 columbid से वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर संसाधित किया गया है । वीर्य संग्रह सफलता दर उस प्रत्येक के प्रतिशत को संदर्भित करती है, जिसके लिए प्रयास किए गए कुल संख्या से एक नमूना सफलतापूर्वक प्राप्त किया गया था ।
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Discussion
हम छोटे और मध्यम पक्षियों से पुनर्उत्पादकता सक्रिय स्थिति में वीर्य एकत्रित करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं, और एवियन शुक्राणु से डीएनए निकालने ।
वर्णित वीर्य डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल सादगी के लिए एक किट से संशोधित है, लेकिन एवियन वीर्य पर उपयोग के लिए परिष्कृत किया गया था । शुक्राणु मानक निष्कर्षण रसायन9,13, और वीर्य passerines से एकत्र नमूनों द्वारा lysis के लिए प्रतिरोधी रहे है काफी छोटे है (आमतौर पर कुछ microliters) । इन कारकों को सफलतापूर्वक डीटीटी और ६५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन की एक उपयुक्त एकाग्रता का उपयोग करके दूर कर रहे है कि चुनौतियों मौजूद । इस विधि का प्रयोग, हम लगातार शुक्राणु telomere लंबाई के qPCR विश्लेषण के लिए डीएनए का प्रयोग करने योग्य मात्रा अलग है (आमतौर पर ४० के बीच-२५० एनजी/µ एल, बोल पड़ना मात्रा पर निर्भर करता है) ।
डीटीटी पहले एक phenol/क्लोरोफॉर्म प्रतिक्रिया13के साथ संयोजन में एवियन शुक्राणु से डीएनए निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया है । Phenol/क्लोरोफॉर्म प्रतिक्रियाओं डीएनए को अलग करने के लिए प्रभावी हैं, लेकिन वे अधिक समय लेने वाले हैं, अधिक खतरनाक होते हैं और एक धुएं हुड की आवश्यकता होती है । हमारे निष्कर्षण प्रोटोकॉल की एक उल्लेखनीय सीमा है कि यह केवल सफल रहा है जब एक ब्रांड और निष्कर्षण किट के प्रकार के साथ प्रयोग किया जाता है, संभवतः नमूना शुरू करने की छोटी मात्रा के कारण । बहुत छोटे वीर्य के नमूने (कम 1 µ l) या कम शुक्राणु घनत्व के साथ नमूनों के नमूने में अपर्याप्त डीएनए के कारण डीएनए के सफल निष्कर्षण रोक सकता है, लेकिन हम इस समस्या का सामना नहीं किया है जब cloacal मालिश पक्षियों पर प्रजनन हालत में किया जाता है . इस मुद्दे से बचने के लिए, cloacal मालिश तुरंत दोहराया जा सकता है कि निष्कर्षण के लिए परित किया जा सकता है एकाधिक बोल पड़ना इकट्ठा करने के लिए ।
Cloacal मालिश दशकों के लिए उपयोग में किया गया है और कई प्रजातियों में1,4,5,6,7,15,16,17, और एक कई मामलों में पक्षियों से वीर्य इकट्ठा करने का त्वरित और प्रभावी साधन । जंगली या अप्रशिक्षित पक्षियों कि कब्जा किया जा सकता है शामिल अध्ययन के लिए, यह संग्रह तरीकों से अधिक प्रभावी है कि एक पुरुष पक्षी समझाने पर भरोसा करने के लिए एक आइटम के साथ मैथुन और उसके वीर्य का4जमा । एक और वीर्य संग्रह विधि परीक्षण या प्राथमिक glomera के विच्छेदन से है, लेकिन यह संरक्षण प्रयोजनों के लिए एक विकल्प नहीं है या4नमूना दोहराया,14। cloacal मालिश की प्राथमिक सीमा प्रदर्शन के बिना तकनीक सीखने में कठिनाई है । लिखित विवरण अक्सर समझ और प्रक्रिया को लागू करने के लिए सीखने के लिए अपर्याप्त हैं । विस्तार से cloacal मालिश illustrating द्वारा, हम सीखने की तकनीक को सीखने के लिए इच्छुक लोगों के लिए समय और कठिनाई को कम करने की उंमीद है ।
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Disclosures
लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।
Acknowledgments
हम cloacal मालिश के साथ जल्दी सहायता के लिए जोस Noguera धंयवाद, और Jeffrey Kittilson लैब समर्थन के लिए । इस काम के लिए BJH को एक एनडी EPSCoR FAR0022429 पुरस्कार से समर्थन मिला. प्रकाशन लागत उदारता से जैविक विज्ञान के NDSU विभाग द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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