Summary
Este protocolo describe cloacal masaje, una técnica manual no invasivo para la recogida de semen de aves y la extracción de ADN de esperma aviar utilizando un kit de extracción comercial con modificaciones.
Abstract
Colección de semen puede ser útil para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios que involucran la calidad del esperma, esperma telomere dinámica y epigenética. Las aves son temas ampliamente utilizados en la investigación biológica y son ideales para estudios con muestras de esperma repetidas. Sin embargo, pocos recursos están disponibles para aquellos que deseen aprender a recoger y extraer ADN de esperma aviar. Aquí describimos cloacal masaje, una técnica manual suave, no invasiva para la recogida de esperma aviar. Aunque esta técnica se establece en la literatura, puede ser difícil de aprender de las descripciones disponibles. También ofrecemos información para la extracción de ADN de semen aviar utilizando un kit de extracción comercial con modificaciones. Masaje cloacal puede utilizarse fácilmente en cualquier pájaro macho tamaño pequeño a mediano en condición reproductiva. Después de colección, el semen puede ser utilizado inmediatamente para los ensayos de motilidad, o congelado para la extracción de ADN siguiendo el protocolo descrito en este documento. Este protocolo de extracción fue refinado aviar de los espermatozoides y se ha utilizado con éxito en muestras recogidas de varias especies de paseriformes (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanusy migratorius de Turdus ) y un columbid (Columba livia).
Introduction
Las aves son sujetos ideales para estudios relacionados con la calidad del esperma y competencia1esperma telomere dinámica2, epigenética3y temas similares, como son ampliamente utilizados en la investigación biológica y esperma puede probarse fácilmente usando cloacal masaje. Masaje cloacal es una técnica manual suave, no invasiva para la recogida de semen de aves4,5,6. Muestras repetidas pueden obtenerse fácilmente y herramientas especiales no se necesitan, lo que facilita llevar a cabo en el campo o en laboratorio. Aunque masaje cloacal ha estado en uso durante décadas, es difícil aprender de las descripciones por escrito disponible. Esta publicación se pretende reducir el tiempo y la incertidumbre implicados en el aprendizaje de masaje cloacal.
Semen de aves con masaje cloacal puede ser utilizada inmediatamente para movilidad evaluación4,7 o8de la inseminación artificial, o congelado para otros usos como proyección de imagen avanzada y extracción de ADN. Muestras de semen de las aves paseriformes son pequeñas pero contienen esperma densamente. Se extrajo ADN utilizando un kit comercial de extracción para la simplicidad, con modificaciones para superar las características de protección especializadas de esperma9. Después de la extracción, se pueden medir los telómeros de esperma utilizando qPCR10.
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Protocol
Este protocolo implica sujetos animales vertebrados y ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en Universidad de estado de Dakota del norte.
1. colección de semen de passerine pájaro mediante masaje cloacal
Nota: El masaje Cloacal es una técnica de colección de semen eficaz reproductivamente activa aves solamente, pero puede realizarse con éxito fuera de la temporada de cría en situaciones de cautiverio apropiadas. Actividad reproductiva debe determinarse para las especies de destino antes de utilizar el masaje cloacal. Esta técnica puede utilizarse en aves silvestres después de captura o en aves en cautiverio.
- A partir de un pájaro masculino, (en condición de cría) agarre de bander en la mano no dominante, transferir el pájaro a la mano dominante con la parte ventral, tocando la palma (figura 1).
- Asegúrese de que la cabeza de pájaro es más cercano el borde lateral de la palma. Fijar ligeramente la cabeza y el cuerpo utilizando el pinky, anillo y los dedos medios. Esto deja el pájaro ventilación y cola expuesta.
- Deja las piernas de pájaro suelto o ligeramente restringida utilizando la palma.
Figura 1 : Apretón para masaje cloaca. El pájaro se fija ligeramente en la mano dominante con su lado ventral tocar la palma y la cabeza asegurada por el dedo meñique. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Coloque el dedo dominante del índice y el pulgar a cada lado del extremo superior de la cloaca y apriete ligeramente los dedos juntos mientras aplica presión ligera hacia la cola ( figura 2). La cloaca se vuelque, exponiendo la mucosa cloacal (rosa interior).
Nota: Si el pájaro no está actualmente produciendo semen, protuberancia cloacal puede ser pequeña y la cloaca es difícil de evert. Con experiencia, es fácil distinguir entre las cloacas de los machos reproductivamente activos e inactivos5,11.
Figura 2 : Posición y protuberancia cloacal del dedo. Vuelque la cloaca aplicando ligera presión en el extremo superior (A). En un paseriformes machos reproductivamente activos, la protuberancia cloacal es evidente y la empresa (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Con la mano no dominante, coloque la almohadilla del dedo índice en el lado dorsal de la base de la cola para estabilizar la mano y luego colocar la punta del pulgar justo por debajo de la cloaca evertido.
Nota: La miniatura de un corta y suave es ventajosa para realizar masaje cloacal y protege a las aves de lesiones accidentales. - Mueva el pulgar no dominante profundamente y cranially en un movimiento repetitivo con presión media, está por debajo de la cloaca. Continúe hasta que el ave eyacule. Dependiendo de la persona, esto normalmente toma entre 1 y varias docena pasadas.
- Tan pronto como el pájaro eyacula, recoger el semen en un tubo de microhematocrito. Repita el masaje cloacal para obtener múltiples eyaculados.
Nota: Paseriformes semen es marrón claro y suele tener una consistencia algo espesa. Sustancias oscuras o blanco expulsadas de la cloaca no están semen y pueden contaminar la muestra de semen. La aparición de una pequeña cantidad de sangre en la cloaca o mezclado con el semen generalmente es causado por demasiada presión durante el masaje. - Para la extracción de ADN, coloque el semen en un tubo de microcentrífuga con 20 μl de 1 x PBS (pH 7.4). Nota: El Semen almacenado en PBS 1 x no es conveniente para la inseminación artificial, pero puede ser utilizado para la extracción de ADN en una fecha posterior cuando se almacena a-80 ° C. El PBS puede ser temperatura ambiente o fría, pero debe estar en estado líquido cuando se deposita la muestra de semen.
- Confirmar la presencia de espermatozoides en la muestra mediante la visualización de una pequeña cantidad de la muestra diluida bajo un microscopio compuesto (figura 3).
- Almacenar el semen diluido a-80 ° C hasta la extracción.
2. extracción de ADN de semen de aves
Nota: Este protocolo ha sido probado con múltiples kits comerciales de extracción de ADN, pero sólo ha tenido éxito cuando se utiliza con un ADN kit12. Pasos que se modificarán el protocolo del kit se indican con *.
- Preparar una solución de 1 M de Ditiotreitol (DTT) en agua y mezclar con un vortex.*
- Alícuota de la solución DTT y almacenar a-20 ° C hasta inmediatamente antes del uso. Cada muestra se extrae requiere 10 μl de 1 M TDT solution.*
- Preparar una memoria intermedia que contiene 20 mM Tris-Cl, pH 8.0; 20 mM EDTA; 200 mM de NaCL; y 4% SDS. Cada muestra se extrae requiere 90 μl de este buffer.*
- Almacenar el buffer a temperatura ambiente. Si ha precipitado, caliéntelo a 56 ° C para dissolve.*
- Precalentar una incubadora que contiene un eje de balancín o coctelera a 65 ° C.*
- Inmediatamente antes de comenzar la extracción, mezclar 10 μl TDT solución con 90 μl del buffer preparado en el paso 2.2 para cada muestra se extrae, por ejemplo, 900 μl de tampón más solución DTT 100 μl si extraer 10 muestras. Esta mezcla se llama TDT-buffer.*
- Añadir 70 μl 1 x PBS a la muestra de semen diluido todo y mezclar bien con un vortex.*
- Añada 100 μl tampón de TDT y 10 μl proteinasa K solución de la muestra. Vórtex por 20 segundos, luego incubar en la incubadora precalentada durante 1 hora en un eje de balancín o shaker.*
- Añadir 200 μL de tampón AL y 200 μL EtOH fresco (100%) y agitar por 20 segundos.*
- Transferencia de toda la muestra a una columna de spin y centrifugar 1 minuto a x 6.000 g. Deseche el tubo de la colección.
- Coloque la columna en un nuevo tubo y agregar 500 μl preparado de tampón de AW1. Centrifugar 1 minuto a x 6.000 g. Deseche el tubo de la colección.
- Coloque la columna en un nuevo tubo y agregar 500 μl preparado de tampón de AW2. Centrifugue durante 1 minuto a 6.000 x g. Deseche el flujo y el lugar la columna de nuevo en el tubo.
- Centrifugar 3 minutos a 20.000 x g. Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Pipeta 35 μl de AE directamente sobre la membrana de la columna de búfer e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.*
- Centrifugar 1 minuto a 14.000 x g. descarte la columna spin y almacene extraídas muestras a-80 ° C.
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Representative Results
Cloacal de masaje y extracción de DNA usando que el protocolo descrito ha llevado a cabo en varias especies de passeriformes y uno columbid (tabla 1). La presencia de espermatozoides en las muestras de semen recogidas por masaje cloacal fue confirmada mediante la visualización de una pequeña cantidad de las muestras bajo un microscopio compuesto con 400 aumentos (figura 3). Después de extraer ADN de muestras de semen recogidas de gorriones, utilizando el protocolo descrito aquí, ocho muestras se corrieron en electroforesis en gel con una escalera de DNA (tres muestras pueden verse en la figura 4). Distintas bandas sin manchar fueron vistos en los ocho de los carriles de la muestra, que indica éxito aislamiento de ADN de alto calidad. Resto de las muestras extraída mediante este protocolo se evaluó la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro (ver tabla 1).
Figura 3: esperma de dos pequeños Passeriformes. Estos espermatozoides se obtuvieron muestras mediante masaje cloacal de un Pinzón de la casa (Haemorhous mexicanus), izquierda y un gorrión (Passer domesticus), derecha, atrapados en Fargo, ND en 2016. Las muestras fueron cada uno diluidas en 20 μl PBS y vistas bajo un microscopio compuesto a 1.000 X y aumento de 400 X, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : ADN gel electroforesis de la DNA de la esperma. Tres muestras de la DNA extraída de gorrión semen correr en un gel con una escalera de ADN. Tenga en cuenta la presencia de distintas bandas, que indica la extracción exitosa de ADN de alta calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gorrión común (Passer domesticus) | Chipping sparrow (Spizella passerina) | Pinzón de la casa (Haemorhous mexicanus) | Petirrojo americano (Turdus migratorius) | Paloma (Columba livia) | |
| Número de muestras recolectadas | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Número de muestras extraídas | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Tasa de éxito de colección de semen | 98% | 75% | 100% | 67% | 67% |
Tabla 1: especies y muestras recogidas y extrae hasta la fecha. En el momento de publicación, se han procesado muestras utilizando el protocolo descrito de 4 especies de passeriformes y 1 columbid. Tasa de éxito de colección de semen se refiere al porcentaje de cada uno para que con éxito se obtuvo una muestra sobre el total tratado.
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Discussion
Describimos un método simple y confiable para la recogida de semen de aves pequeñas y medianas en condición activa reproductivamente y extracción de ADN de esperma aviar.
El protocolo de extracción de ADN de semen descrita es modificado a partir de un kit para la simplicidad, pero fue refinado para el uso en semen aviar. Espermatozoides son resistentes a la lisis por productos químicos de extracción estándar9,13, y las muestras de semen recogidas de paseriformes son bastante pequeñas (típicamente de unos pocos microlitros). Estos factores presentan retos que se superan con éxito mediante una concentración adecuada de la TDT y la incubación a 65 ° C. Usando este método, hemos aislado constantemente cantidades utilizables de ADN para el análisis de qPCR de longitud de los telómeros de la esperma (normalmente entre 40-250 ng/μl, dependiendo del volumen de eyaculado).
TDT se ha utilizado anteriormente para extraer ADN de esperma aviar en combinación con una reacción de fenol/cloroformo13. Reacciones del fenol/cloroformo son eficaces para aislar ADN, pero son más lentos, son más peligrosos y requieren de una campana de humos. Una limitación notable de nuestro protocolo de extracción es que sólo ha tenido éxito cuando se utiliza con una marca y el tipo de kit de extracción, posiblemente debido al pequeño volumen de muestra de partida. Muestras de semen muy pequeña (menos de 1 μl) o las muestras con densidad baja de la esperma pueden prevenir extracción exitosa de ADN debido a la insuficiente ADN presente en la muestra, pero no hemos encontrado este problema cuando se realiza masaje cloaca en las aves en condiciones de cría . Para evitar este problema, masaje cloacal puede repetirse inmediatamente para recoger múltiples eyaculaciones que pueden combinarse para la extracción.
Masaje cloacal ha estado en uso durante décadas y en muchas especies1,4,5,6,7,15,16,17y es un medio rápido y eficaz de recogida de semen de aves en muchos casos. Para estudios con aves silvestres o inexpertas que pueden capturar, es más eficaz que los métodos de recopilación que confían en convencer a un pájaro macho copular con un elemento y depositar su semen voluntariamente4. Otro método de colección de semen es por la disección de los testículos o glomera seminal, pero esto no es una opción para fines de conservación o muestreo repetitivo4,14. La limitación primaria de masaje cloacal es la dificultad en el aprendizaje de la técnica sin demostración. Descripciones escritas son a menudo insuficientes para entender y aprender a implementar el proceso. Ilustrando el masaje cloacal en detalle, esperamos reducir el tiempo de aprendizaje y dificultad para aquellos que deseen aprender la técnica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Acknowledgments
Agradecemos a Jose Noguera de asistencia temprana con masaje cloacal, y Jeffrey Kittilson de laboratorio de apoyo. Este trabajo fue apoyado por un premio ND EPSCoR FAR0022429 BJH. Los costos de publicación generosamente fueron apoyados por el Departamento de ciencias biológicas de ganado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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