Summary
Ce protocole décrit cloacale massage, une technique non-invasive manuelle de collecte de sperme sur les oiseaux et l’extraction d’ADN de sperme aviaire à l’aide d’un kit d’extraction commerciale sous réserve de modifications.
Abstract
Collecte de sperme peut être utile pour un large éventail d’applications, y compris les études portant sur la qualité du sperme, sperme télomère dynamique et épigénétique. Les oiseaux sont des sujets largement utilisés dans la recherche biologique et sont idéales pour les études portant sur des échantillons de sperme répétées. Cependant, peu de ressources est actuellement disponibles pour ceux qui souhaitent apprendre à collecter et à extraire l’ADN des spermatozoïdes aviaire. Nous décrivons ici cloacale massage, une technique manuelle douce, non invasive pour la collecte de sperme aviaire. Bien que cette technique est établie dans la littérature, il peut être difficile d’apprendre à partir des descriptions disponibles. Nous fournissons également des informations pour extraire l’ADN de sperme aviaire à l’aide d’un kit d’extraction commerciale sous réserve de modifications. Massage cloacale peut être utilisé facilement sur n’importe quel oiseau mâle petites à moyennes en état de se reproduire. Après la collecte, le sperme peut être utilisé immédiatement pour des dosages de motilité, ou congelé pour l’extraction d’ADN suivant le protocole décrit ci-après. Ce protocole d’extraction a été affinée pour les spermatozoïdes aviaire et a été utilisé avec succès sur des échantillons prélevés dans plusieurs espèces de passereaux (Passer domesticus, Spizella passerina, Haemorhous mexicanuset Turdus migratorius ) et un columbid (Columba livia).
Introduction
Les oiseaux sont des sujets idéaux pour les études concernant la qualité du sperme et compétition1, sperme télomère dynamique2, épigénétique3et sujets similaires, car ils sont largement utilisés dans la recherche biologique et le sperme peut être dégustée facilement à l’aide de cloacale massage. Cloacale massage est une technique manuelle douce, non invasive pour recueillir le sperme des oiseaux4,5,6. Échantillons répétés peuvent être obtenus facilement et sans outils spéciaux sont nécessaires, rendant simple à effectuer dans le domaine ou le laboratoire. Bien que le massage cloacale a été utilisé pendant des décennies, il est difficile d’apprendre de l’écrit des descriptions disponibles. Cette publication est destinée à réduire le temps et l’incertitude impliqués dans l’apprentissage de massage cloacale.
Sperme collecté des oiseaux à l’aide de massage cloacale peut être utilisé immédiatement pour la motilité évaluation4,7 ou insémination artificielle8, ou congelé pour d’autres usages tels que l’imagerie avancée et l’extraction d’ADN. Des échantillons de sperme de passereaux sont petites mais contiennent le sperme dense. L’ADN est extrait en utilisant un kit d’extraction commerciale pour plus de simplicité, avec les adaptations pour surmonter les dispositifs de sécurité spécialisées de sperme9. Après extraction, télomères de sperme peuvent être mesurées à l’aide de qPCR10.
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Protocol
Ce protocole comporte des sujets animaux vertébrés et a été approuvé par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à North Dakota State University.
1. prélèvement d’une espèce d’oiseau à l’aide de massage cloacale
NOTE : Cloacale massage est une technique de collection de sperme efficace seulement des oiseaux actifs sexuellement, mais peut être réalisée avec succès à l’extérieur de la saison de reproduction dans les situations appropriées en captivité. Activité reproductrice doit être déterminée pour les espèces cibles avant d’utiliser le massage cloacale. Cette technique peut servir à la capture des oiseaux sauvages ou sur les oiseaux gardés en captivité.
- Commençant par un oiseau mâle, (en état de se reproduire) poignée de bander dans la main non dominante, transférer l’oiseau dans la main dominante avec sa face ventrale, toucher la paume (Figure 1).
- Assurez-vous que la tête de l’oiseau est plus proche du bord latéral de la paume. Fixer légèrement la tête et le corps à l’aide de le pinky, anneau et le médius. Cela laisse de l’oiseau vent et queue exposés.
- Laisser les pattes de l’oiseau libre ou légèrement bloqués à l’aide de la paume.
Figure 1 : Grip pour massage cloacale. L’oiseau est attaché légèrement dans la main dominante avec sa face ventrale, toucher la paume et la tête garanti par le petit doigt. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Placez l’index et pouce dominante de chaque côté de l’extrémité supérieure du cloaque et légèrement pincer les doigts ensemble tout en appliquant une pression très légère vers la queue ( Figure 2). Le cloaque sera evert, exposant la muqueuse cloacale (rose intérieur).
Remarque : Si l’oiseau n’est pas en train de produire le sperme, la protubérance cloacale peut être petite et le cloaque est difficile à evert. Avec l’expérience, il est facile de faire la différence entre les cloaques des mâles sexuellement actifs et inactifs5,11.
Figure 2 : Finger position et protubérance cloacale. Leonie le cloaque en appliquant une légère pression à l’extrémité supérieure (A). Dans un passereau mâle actif sexuellement, la protubérance cloacale est évidente et entreprise (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
- Avec la main non dominante, placez le tampon de l’index sur la face dorsale de la base de la queue pour stabiliser la main et ensuite placer le bout du pouce juste en dessous du cloaque éversé.
Remarque : Une miniature courte et lisse est avantageuse pour l’exécution de massage cloacale et protège l’oiseau des blessures accidentelles. - Déplacer le pouce non dominantes profonde et proche d’un mouvement répétitif avec moyenne pression, restant sous le cloaque. Continuez jusqu'à ce que l’oiseau éjacule. Selon les individus, cela prend en général entre 1 et plusieurs courses de dizaines.
- Dès que l’oiseau éjacule, recueillir le sperme dans un tube de microhematocrit. Répétez cloacale massage pour obtenir les éjaculats multiples.
NOTE : Passereaux sperme est brun clair et a généralement une consistance un peu épaisse. Blancs ou noirs des substances s’est éjectés le cloaque ne sont pas sperme et susceptibles de contaminer l’échantillon de sperme. L’apparition d’une petite quantité de sang sur le cloaque ou mixtes en avec le sperme est habituellement causé par une pression trop grande pendant le massage. - Pour l’extraction de l’ADN, déposer le sperme dans un tube de microcentrifuge 20 µl de solution de 1 PBS x (pH 7,4). NOTE : Sperme stocké dans du PBS 1 x n’est pas adapté à l’insémination artificielle, mais peut être utilisé pour l’extraction d’ADN à une date ultérieure lorsqu’il est conservé à-80 ° C. Le PBS peut être à température ambiante ou réfrigérée, mais devrait être à l’état liquide lorsque l’échantillon de sperme est déposé.
- Confirmer la présence de spermatozoïdes dans l’échantillon en affichant une petite quantité de l’échantillon dilué au microscope composé (Figure 3).
- Conserver le sperme dilué à-80 ° C jusqu'à l’extraction.
2. extraction de l’ADN du sperme de l’oiseau
Remarque : Ce protocole a été testé avec plusieurs kits commerciaux d’extraction d’ADN, mais il a seulement réussi lorsqu’il est utilisé avec un ADN kit12. Étapes qui sont modifiés depuis le protocole de la trousse sont indiqués par *.
- Préparer une solution de 1 M de dithiothréitol (DTT) dans l’eau et mélanger à l’aide d’un vortex.*
- Partie aliquote de la solution DTT et conserver à-20 ° C jusqu'à ce que juste avant l’emploi. Chaque échantillon à extraire nécessite 10 µL de 1 M TNT TomTom.*
- Préparer un tampon contenant 20 mM Tris-Cl, pH 8,0 ; 20 mM EDTA ; 200 mM NaCL ; et 4 % SDS. Chaque échantillon à extraire requiert 90 µL de cette buffer.*
- Stocker le tampon à la température ambiante. Si elle a précipité, réchauffer à 56 ° C à dissolve.*
- Préchauffer un incubateur contenant une bascule ou un shaker à 65 ° C.*
- Immédiatement avant de commencer l’extraction, mélanger 10 µL de solution de TNT avec 90 µL du tampon préparé à l’étape 2.2 pour chaque échantillon à extraire, de p. ex. 900 µL de tampon de plus de 100 µL de solution de TNT s’extraire 10 échantillons. Ce mélange s’appellera DTT-buffer.*
- Ajouter 70 µL 1 x PBS à l’échantillon de sperme dilué entière et mélanger bien à l’aide d’un vortex.*
- Ajouter 100 µL tampon de DTT et 10 µL de solution de protéinase K à l’échantillon. Vortexer pendant 20 secondes, puis incuber dans l’incubateur préchauffé pendant 1 heure sur une bascule ou shaker.*
- Ajouter 200 µL tampon AL et 200 µL EtOH fraîche (100 %) et vortex pour 20 secondes.*
- Transférer la totalité de l’échantillon à une colonne de spin et centrifuger 1 minute à 6 000 x g. jeter le tube de prélèvement.
- Placer la colonne sur un nouveau tube et ajouter 500 µL préparé tampon AW1. Centrifuger 1 minute à 6 000 x g. jeter le tube de prélèvement.
- Placer la colonne sur un nouveau tube et ajouter 500 µL préparé tampon AW2. Centrifuger pendant 1 minute à 6 000 x g. jeter les intermédiaires et les replacer la colonne sur le tube.
- Centrifuger à 3 minutes à 20 000 x g. jeter le tube de prélèvement et placer la colonne sur un tube de microtubes de 1,5 mL.
- Pipette 35 µL de AE tampon directement sur la membrane de la colonne et incuber à température ambiante pendant 5 minutes
- Centrifuger 1 minute à 14 000 x g. jeter la colonne et stocker les échantillons extraits à-80 ° C.
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Representative Results
Massage cloacale et ADN extraction en utilisant que le protocole décrit ont été effectué sur plusieurs espèces de passereaux et un columbid (tableau 1). La présence de spermatozoïdes dans le sperme prélèvements cloacaux massage a été confirmée en affichant une petite quantité des échantillons dilués sous un microscope composé au grossissement X 400 (Figure 3). Après que l’extraction d’ADN provenant d’échantillons de sperme prélevés moineaux en utilisant le protocole décrit ici, huit échantillons ont été exécutés par électrophorèse sur gel avec une échelle d’ADN (trois échantillons peuvent être vu dans la Figure 4). Les bandes distinctes sans bavures ont été vus dans les huit les couloirs d’échantillon, indiquant la réussite de l’isolement de l’ADN de haute qualité. Tous les autres échantillons extraits à l’aide de ce protocole ont été évalués pour la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre (voir tableau 1).
Figure 3: sperme prélevé deux petits passereaux. Ces spermatozoïdes échantillons ont été prélevés par cloacale massage un Roselin (Haemorhous mexicanus), à gauche et un moineau domestique (Passer domesticus), droit, pris au piège dans Fargo, ND en 2016. Les échantillons ont été chacun dilués dans 20 µL de PBS et examine sous un microscope composé à 1 000 X et 400 X grossissement, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : ADN électrophorèse d’ADN de sperme en. Trois échantillons d’ADN extrait de sperme Moineau s’exécuter sur un gel avec une échelle d’ADN. Noter la présence de bandes distinctes, indiquant avec succès extraction d’ADN de haute qualité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Moineau domestique (Passer domesticus) | Bruant (Spizella passerina) | Roselin familier (Haemorhous mexicanus) | Merle d’Amérique (Turdus migratorius) | Pigeon biset (Columba livia) | |
| Nombre d’échantillons prélevés | 156 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Nombre d’échantillons extraits | 90 | 3 | 2 | 2 | 2 |
| Taux de réussite de collection sperme | 98 % | 75 % | 100 % | 67 % | 67 % |
Tableau 1 : espèces et échantillons collectés et extraits à ce jour. Au moment de la publication, les échantillons ont été traités en utilisant le protocole décrit de 4 espèces de passereaux et 1 columbid. Taux de réussite de collection sperme désigne le pourcentage de chacun dont un échantillon a été obtenu avec succès sur le nombre total a tenté.
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Discussion
Nous décrivons une méthode simple et fiable de collecte de sperme de petits et moyens oiseaux en état actif sexuellement et d’extraire l’ADN des spermatozoïdes aviaire.
Le protocole d’extraction d’ADN sperme décrit est modifié par rapport à un kit par souci de simplicité, mais a été affiné pour une utilisation sur sperme aviaire. Spermatozoïdes résistent à la lyse par extraction standard produits chimiques9,13, et les échantillons de sperme prélevés de passereaux sont assez faibles (généralement quelques microlitres). Ces facteurs présentent des défis qui sont surmontés en utilisant une concentration appropriée de la TNT et en incubation à 65 ° C. En utilisant cette méthode, nous avons constamment isolé des quantités d’ADN utilisables pour l’analyse de qPCR sperme longueur des télomères (généralement entre 40 à 250 ng/µL, selon le volume de l’éjaculat).
TNT a déjà été utilisé pour extraire l’ADN des spermatozoïdes aviaire en combinaison avec une réaction de phénol/chloroforme13. Réactions de phénol/chloroforme sont efficaces pour isoler l’ADN, mais ils demandent beaucoup plus de temps, sont plus dangereux et nécessitent une hotte aspirante. Une restriction notable de notre protocole d’extraction est qu’il n’a été réussi lorsqu’il est utilisé avec une marque et le type de kit d’extraction, peut-être en raison du faible volume de l’échantillon de départ. Échantillons de sperme très petites (moins de 1 µL) ou des échantillons avec une densité de spermatozoïdes faibles peuvent empêcher avec succès extraction d’ADN en raison de l’insuffisante ADN présent dans l’échantillon, mais nous n’avons pas rencontré ce problème lorsque le massage cloacal s’effectue sur les oiseaux en état de se reproduire . Pour éviter ce problème, massage cloacale peut être répété immédiatement pour recueillir les éjaculats multiples qui peuvent être mises en commun pour l’extraction.
Massage cloacale a été utilisé pendant des décennies et nombreuses espèces1,4,5,6,7,15,16,17et est un moyen rapide et efficace de collecte de sperme d’oiseaux dans de nombreux cas. Pour les études concernant des oiseaux sauvages ou non formés qui peuvent être capturés, il est plus efficace que les méthodes de collecte qui dépendent de convaincre un oiseau mâle pour s’accoupler avec un élément et déposer sa semence volontiers4. Une autre méthode de collecte de sperme est par dissection des testicules ou seminal glomera, mais ce n’est pas une option à des fins de conservation ou d’échantillonnage répété4,14. La principale limite de massage cloacal est la difficulté dans l’apprentissage de la technique sans démonstration. Les descriptions textuelles sont souvent insuffisantes pour comprendre et apprendre à mettre en œuvre le processus. En illustrant cloacale massage en détail, nous espérons réduire les temps d’apprentissage et la difficulté pour ceux qui souhaitent apprendre la technique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous remercions aide précoce avec massage cloacal, Jose Noguera et Jeffrey Kittilson pour laboratoire appuyer. Ce travail a été soutenu par un prix de ND EPSCoR FAR0022429 à BJH. Frais de publication ont été généreusement financés par le département des Sciences biologiques de NDSU.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
References
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