Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

تبسيط خلية مفردة تكر العزلة وتوليد نواقل فيروسات النسخ العكسي في المختبر و في فيفو التعبير لتكرس البشرية

doi: 10.3791/55379 Published: September 10, 2017

Summary

يجمع البروتوكول الحالي خلية مفردة إقران البشرية تكر ألفا وبيتا سلسلة التسلسل مع تبسيط جيل نواقل النسخ العكسي متوافقة مع التعبير تكر في المختبر و في فيفو .

Abstract

على الرغم من ذلك، تم تطوير العديد من الأساليب لتسلسل سلاسل ألفا وبيتا مستقبلات (تكر) إقران تي خلية من خلايا تي واحد، وحتى الآن لم يكن أي تفضي إلى المصب في فيفو التحليل الوظيفي تكر هيتيروديميرس. لقد وضعنا بروتوكولا محسنة استناداً خطوتين متداخلة متعدد بكر، الذي ينتج منتج PCR تمتد عبر مناطق متغير بأكملها من السلاسل البشرية تكر ألفا وبيتا. بتحديد مواقع قيود فريدة من نوعها وإدماجها في كبسولة تفجير بكر، قدمنا المنتج بكر متوافقة مع مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. بناء النسخ العكسي الناتجة بترميز تشيميريك الإنسان/ماوس تكر مع مجال ماوس داخل الخلايا، والتي وظيفية في الخلايا الماوس أو في فيفو نماذج الماوس. عموما، البروتوكول هو موضح هنا يجمع بين خلية بشرية واحدة إقران تكر ألفا وبيتا سلسلة الهوية مع الجيل مبسطة من نواقل فيروسات النسخ العكسي القابلة للتكييف وفقا لتعبير تكر في المختبر و في فيفو . الفيديو والمواد المصاحبة مصممة لإعطاء وصف مفصلة للغاية لخلية مفردة بكر، حتى تكون الخطوات الحاسمة المزالق المحتملة ويتبع تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لاستنساخ الخطوات الضرورية لإنشاء ناقل التعبير. وبمجرد أن يتقن، يمكن أداء الإجراء بأكمله من خلية مفردة الفرز للتعبير تكر في فترة أسبوعين قصيرة.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويملي مستقبلات خلية تي (تكر) خلية T مصير قرار أثناء وضع وحالة مستقرة/التوازن والتحفيز مستضدي في هامش1،،من23. التوسع الأخير في أعماق تسلسلها على تكنولوجيات كشفت عن تنوع تكر التقدير سابقا ضمن استجابات محددة T الخلية مستضد. التنوع تكر يوحي بإمكانية لاستجابات واسعة وظيفيا T الخلية. بغية إدماج تحليل مرجع تسلسل تكر مع الاختبارات الوظيفية تكر، نهج التسلسل ينبغي أن تصمم لتكون متوافقة مع النظم التجريبية و في فيفو النماذج المستخدمة لتحليل وظيفي اللاحقة لتحديد تكرس. ولدينا وضع نهج فعال لعزل تسلسل تكر البشرية وتبسيط الاستنساخ الفرعي في تشيميريك الإنسان/ماوس تكر ناقل قالب متوافق مع التعبير تكر في الفئران أنسنة هلا4. يتطلب عزلة سلاسل ألفا وبيتا المقابلة من هيتيروديميريك تكرس التضخيم بكر كلا سلاسل من خلية واحدة. وعلى الرغم من عدة بروتوكولات الاستنساخ تكر خلية واحدة تم تطويرها واستخدامها، حتى الآن لم بسهولة متوافق مع الفائق مبسطة مباشرة استنساخ غير معروف Vα/Vβ "تكرس" إلى نواقل فيروسات النسخ العكسي اللازمة لإعادة التعبير الحية 4،5،،من67. وقد استخدمت الدراسات السابقة نهجين رئيسيين، أما بشكل انتقائي تضخيم جزء محدود من تكر كافية لاستقراء التسلسل، أو لتضخيم أكمله تكر تسلسل4،5،6 , 7-التحليل الوظيفي المصب تكر تسلسلات التي تم الحصول عليها عن طريق النهج الأول يتطلب مكلفة في السيليكون الجمعية و حيثياته بناء تكر. بينما يوفر النهج الثاني تكر التسلسل الكامل، منطقة ثابتة البشرية غير متوافق مع التعبير في فيفو لتكرس المستنسخة في نماذج الماوس. نهجنا مصممة خصيصا لتكون متوافقة مع فيفو التحليل الوظيفي لتكرس في نماذج الماوس. قمنا بتطوير خلية واحدة فعالة ومبسطة [بكر] بروتوكول يسمح بمباشرة دون استنساخ PCR الشظايا في ناقلات التعبير قالب.

ويستخدم نهجنا حساسة للغاية متداخلة متعدد بكر رد فعل الذي يتم تنفيذه في خطوتين. في أول رد فعل متعدد خطوة تجمع 40 كبسولة تفجير محددة لجميع سلاسل بيتا الخامس وبركة 44 كبسولة تفجير محددة لكافة سلاسل ألفا الخامس تستخدم لتضخيم تكر-ألفا أو بيتا تكر دون علم مسبق بالتسلسل (الجدول 1). التمهيدي إلى الأمام بتسلسل محول، التي أدمجت في 5 ' المنتج PCR. وتستند التمهيدي عكس المنطقة المستمر من تكر. وقد حددنا مواقع القيود الفريدة التي غائبة عن متغير البشرية أو مناطق تقاطع تكر، وأدرجت هذه إلى إعادة تصميمها حديثا TCRα و TCRβ الإشعال (الشكل 1). في رد فعل متداخلة الثانية، تستخدم تمهيدي محددة لتسلسل محول وتمهيدي عكس متداخلة داخل المنطقة المستمر كذلك تضخيم سلاسل تكر مع زيادة خصوصية (الجدول 1، الشكل 1). بعد عزل خلية مفردة، تقريب اثنين من بكر (الرد الأول مع مجموعة الإشعال Vα و Vβ، والثانية مع محول الإشعال) يؤدي إلى منتج PCR التي يمكن أن تكون مباشرة دون استنساخ داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية. سوف ترميز بناء تكر النهائية، في إطار واحد قراءة مفتوحة (ORF)، المناطق متغير البشرية جنبا إلى جنب مع المناطق الماوس ثابتة متصلة بواسطة تسلسل البروتين 'كليافينج الذاتي'، P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. التسلسل P2A قد استخدمت في نظم متعددة، وقد تم اختبارها على نطاق واسع على وجه التحديد للتعبير عن تكرس8،9،،من1011. وعلى الرغم من بعد ترجمة معظم بقايا تسلسل P2A يعلق على ج-المحطة ألفا سلسلة متصلة بواسطة رابط مرنة، في حين تتابع الإشارات سلسلة بيتا برولين إضافية، هذا التعديل ليس له أي تأثير ضار على وظيفة تكر. يستخدم منطقة الماوس ثابتة في البناء بدلاً من الإنسان لتجنب التفاعلات المتغيرة المحتملة مع مكونات مما يشير إلى المصب عند إعادة المعرب عنها في الخلايا الماوس. ORF واحد سيؤدي إلى المقايسة التعبير منفصلة من ألفا وبيتا سلاسل9،11. البروتوكول الحالي يستند إلى الكواشف والنهج التي تتوفر على نطاق واسع، وهي مصممة على أن يتم بطريقة مبسطة وفعالة. على الرغم من أن التحديد أننا استخدمنا هذا الأسلوب للاعتداء تكرس من خلايا تي ذاتية التفاعل المتورطين في مرض السكري المناعة الذاتية، ونحن نتوقع أن هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على نطاق واسع لتحديد وتقييم وظيفي محدد للبشرية تكرس المناعة الذاتية [ابيتوبس] أو [ابيتوبس] سرطان أو الردود على مسببات الأمراض واللقاحات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-تحديد السكان خلية T للفائدة-

ملاحظة: مستضد الانتشار محددة في تركيبة مع صبغ انقسام الخلية (مثل كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر، كفسي) يمكن استخدامها لعزل خلايا تي استناداً إلى انتشارها في الاستجابة للتحفيز مستضدي. إذا بدءاً من ببمكس، توسع في 7 أيام في المختبر يجب أن تكون كافية لتحديد مستضد محدد كفسي سكانية منخفضة 12-

  1. ببمكس ميكس 1:1 مع الخلايا المطابقة MHC علبة التغذية بالورق، والتسمية مع 5 ميكرومتر كفسي انقسام الخلية صبغ.
  2. الثقافة
  3. لوحة 2-2.5 × 10 5 خلايا كل بئر في جولة 96-جيدا-قاع اللوحة في 200 ميليلتر 10% FCS كاملة ربمي الإعلام.
    ملاحظة: يتضمن ربمي كاملة ل مم 2-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 ميكرومتر ذاكرة غير الأساسية الأحماض الأمينية، 5 مم هيبيس، 5.5 × 10 − 5 وحدات من 2-mercaptoethanol، 100 ش مل − 1 البنسلين و 100 ميكروغرام مل − 1 ستربتوميسين-
  4. تحفز الخلايا مع 25 ميكرومتر الببتيد مستضد.
  5. في اليوم الرابع للثقافة، بعناية إزالة واستبدال 100 ميليلتر من وسائل الإعلام-
    ملاحظة: نهجاً أكثر أمثل لتحديد الخلية تي محددة مستضد هو استخدام الببتيد-هلا tetramers 13. تلوين تيترامير تسمح بتقييم المتزامن لخصوصية مستضد، فضلا عن تقييد هلا.

2. قم بإعداد نوع خلية مفردة.

  1. إجراء كافة الإجراءات في غطاء أو مجال معين مجاناً قالب تضخيم. الكوة الكواشف لتفادي التلوث، تنظيف جميع أسطح العمل، وإذا كان ذلك ممكناً، المعدات مع 10 ٪ التبييض قبل الإعداد PCR. استخدام تصفية نصائح والكاشفات الحرة رناسي والدناز والبلاستيك في كل بكر وناقل الاستنساخ الخطوات. ويمكن الاطلاع على الكواشف الرئيسية في الجدول للمواد-
    ملاحظة: رد فعل PCR متعدد حساسة للغاية، ويمكن أن يؤدي انخفاض مستويات التلوث في تضخيم المنتج.
  2. توليد مزيج الرئيسي النسخ العكسي عن طريق الجمع بين 10 × RT رد فعل المخزن المؤقت، دنتبس X 25، 9 RT يو الإنزيم، 0.01 ٪ تريتون العاشر، 0.7 "رناسي ش" المانع، و 383 نيوتن متر لكل التمهيدي RT-تكر (المدرجة في الجدول 1) في خزان بيبيتينج عقيمة. لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، للتعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج. انظر الجدول 2 لتفاعل المكونات والمبالغ لكل بئر.
  3. لوحة
  4. تحضير مجموعة بكر 96-جيدا للخلية الفرز حسب بيبيتينج ميليلتر 6 من مزيج الرئيسي النسخ العكسي كل جيدا مع ماصة متعددة القنوات. تبقى لوحة على الجليد أو في كتلة باردة.
  5. تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة الخلايا علامات السطحية (مثل خلايا CD4 و CD3، أو CD8 و CD3، كل منهما في 2 ميكروغرام/مل، في تركيبة مع صبغ انقسام الخلية أو تلطيخ تيترامير)-
  6. "تي فرز" الخلايا في أحد الخلية الواحدة جيدا، تخطي في الصف الثاني عشر، الذي سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبية.
    ملاحظة: كفاءة هذا النوع يعتمد على جمع الدقيق لوحة المحاذاة ضمن حامل لوحة، فضلا عن الحفاظ على الخلايا ولوحات عند درجة حرارة منخفضة قبل رد الفعل كدنا. ينبغي إبقاء مجموعة لوحات على الجليد في جميع الأوقات، فيما عدا أثناء الفرز، وعندما كانت ثابتة داخل لوحة التبريد. وفارزات ليست جميعها مجهزة بحامل لوحة تنظيم درجة حرارة؛ ومع ذلك، ينصح بشدة باستخدام إحدى. منذ الفرز وعادة ما يأخذ حوالي 10-15 دقيقة للوحة الواحدة، هناك زيادة احتمال تدهور الجيش الملكي النيبالي في حالة عدم الاحتفاظ باللوحة عند درجة حرارة منخفضة.
  7. كعنصر إيجابي، إضافة عدد أكبر من الخلايا (خلايا 100) يدوياً مع ماصة لأحد الآبار في هذه المرحلة. بدلاً من ذلك، عزلت سابقا الجيش الملكي النيبالي من الخلايا المجمعة يمكن استخدامها كعنصر إيجابي في 10 نانوغرام كل بئر-
    ملاحظة: "الماصة؛" مراقبة تنقية الحمض النووي الريبي بالدقة والعناية لتفادي التلوث عبر الآبار والنتائج الإيجابية الكاذبة الأخرى.
  8. ختم اللوحة مع الفيلم لاصقة، وتدور إلى أسفل في 1000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
  9. فورا نسخ الحمض النووي الريبي لكدنا التي تفرخ لوحة عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، و 85 درجة مئوية للحد الأدنى 10
    ملاحظة: لضمان كفاءة PCR تفاعل، من المستحسن إجراء PCR أول رد فعل في نفس اليوم. بدلاً من ذلك، يمكن الاحتفاظ لوحات يدون في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.

3. أداء متعدد-متداخلة بكر

ملاحظة: إعداد جميع يمزج الرئيسي في منطقة نظيفة خالية من القالب لتجنب التلوث.

  1. إعادة كل متغير المنطقة التمهيدي إلى 100 ميكرومتر مع الدناز ورناسي الحرة H 2 o. بعد ذلك، ضم 20 ميليلتر من كل من الإشعال 44 لإنشاء تجمع التمهيدي الخامس-ألفا. لتوليد الخامس-بيتا ضم تجمع التمهيدي 20 ميليلتر من كل من الإشعال الخامس-بيتا 40 بالإضافة إلى 80 ميليلتر من الدناز ورناسي مجاناً ح 2 التمهيدي سين تسلسل المدرجة في الجدول 1. بمجرد تجميع، هو تركيز كل التمهيدي في المزيج ميكرومتر 2.3.
  2. إعادة تشكيل الإشعال المنطقة المستمر إلى 100 ميكرومتر حل الأسهم مع الدناز ورناسي مجاناً ح 2 ديلوت O. الإشعال المنطقة المستمر إلى 10 ميكرون العامل الحل وقاسمه للاستخدام-
  3. إعداد يمزج رئيسية منفصلة اثنين تكر-ألفا وبيتا تكر التضخيم. توليد يمزج الرئيسي عن طريق الجمع بين 5 X المخزن المؤقت، 80 ميكرومتر دنتبس، 3% [دمس]، 2 ميكرومتر تجمع التمهيدي (التركيز النهائي من 46 شمال البحر الأبيض المتوسط لكل التمهيدي)، 200 نانومتر تكر ثابت المنطقة عكس التمهيدي و 1 "يو دنا" بوليميريز الدناز ورناسي مجاناً ح 2 س (الجدول 2 < /قوي >). لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، بغية التعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج.
    ملاحظة: تستند الحسابات النهائية حجم بكر 25 ميليلتر الواحد جيدا، حيث هو 22.5 ميليلتر مزيج PCR الرئيسية جنبا إلى جنب مع قالب كدنا ميليلتر 2.5.
  4. تبقى اللوحة مع كدنا على الجليد أو في كتلة باردة. استخدام القنوات المتعددة إلى "الماصة؛" ميليلتر 22.5 من رد فعل تكر-بيتا في لوحة بكر 96-بئر جديدة. ثم استخدم القنوات المتعددة لتحويل 2.5 ميليلتر من كدنا إلى لوحة بكر.
  5. استخدام القنوات المتعددة إلى "الماصة؛" ميليلتر 22.5 ألفا تكر رد الفعل مباشرة إلى اللوحة التي تحتوي على ما تبقى من كدنا.
  6. ختم اللوحات مع مادة لاصقة ودوامه بلطف وتدور إلى أسفل في 1000 غ س لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
  7. تشغيل تفاعل PCR متعدد مع دورات التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 34 من 20 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 54 ° C، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 7 دقيقة في 72 درجة مئوية.
  8. القيام برد فعل PCR متداخلة بحجم نهائي في 25 ميليلتر، استخدام 2.5 ميليلتر من خليط PCR متعدد كقالب.
    1. إعادة تشكيل الإشعال الداخلية ومحول إلى 100 ميكرومتر مع الدناز ورناسي مجاناً ح 2 O. جعل 10 ميكرون مختبرين للأسهم العامل.
    2. إعداد يمزج رئيسية منفصلة اثنين ampl تكر-ألفا وبيتا تكرإيفيكيشن. مزيج 5 × المخزن المؤقت، 25 X DNTP، 3% [دمس]، شمال البحر الأبيض المتوسط 200 محول إلى الأمام التمهيدي، 200 نانومتر عكس التمهيدي متداخلة، 1 "ش دنا" بوليميريز، وبوليميراز الدنا وخالية من نوكلياسي ح 2 س لوحدة تخزين نهائي من 22.5 ميليلتر (الجدول 2). لكل لوحة 96-جيدا، وتشكل ما يكفي المزيج الرئيسي لردود فعل إضافية 10 (مجموع 106)، للتعويض عن فقدان السائل أثناء بيبيتينج.
      ملاحظة: باستخدام تفاعل PCR الثانية 5 X PCR المخزن المؤقت التي تحتوي على صبغ التحميل لتيسير [اغروس] هلام تحميل.
    3. باستخدام القنوات المتعددة، "الماصة؛" يمزج الرئيسي لردود فعل تكر-ألفا وبيتا تكر في ميليلتر 22.5 كل بئر في لوحات بكر 96-بئر جديدة اثنين.
    4. إضافة قالب تفاعل PCR متعدد في ميليلتر 2.5 كل بئر-
      ملاحظة: تبقى بكر أول رد فعل ينبغي مختومة، وتخزينها في-20 درجة مئوية لتكون بمثابة مصدر لقالب إضافية، إذا كان ذلك ضروريا (انظر الخطوة ملاحظة 4.3).
    5. ختم لوحات، بلطف ودوامه، وتدور إلى أسفل في ز 1000 x لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
    6. تشغيل تفاعل PCR متداخلة مع دورات التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية تليها دورات 34 من 20 s عند 95 درجة مئوية، 30 s في 56 درجة مئوية، و 1 دقيقة في 72 درجة مئوية، تليها 7 دقيقة في 72 درجة مئوية.
    7. تشغيل 5 ميليلتر من رد النهائي بها على 1% [اغروس] هلام المحتوية على اثيديوم بروميد (بما في ذلك الآبار المراقبة السلبية والإيجابية).
      ملاحظة: يجب تشغيل الفرقة المتوقعة في حوالي 500 bp الحجم. فعل سبيل مثال يظهر في الشكل 2-
    8. تطهير ما تبقى من رد الفعل الثاني (20 ميليلتر) استخدام تنسيق 96-بئر بكر تنقية طقم الوتي مع 15 ميليلتر من 70 درجة مئوية ح 2 س كل بئر وأداء سانغر التسلسل. استخدام المناسبة تكر-ألفا أو بيتا تكر محول إلى الأمام التمهيدي للتسلسل (الجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تحليل تسلسل مع البرمجيات immunogenetics متاح على شبكة الإنترنت-

4. دون استنساخ سلاسل PCR ألفا وبيتا-

ملاحظة: مجموعة الإشعال إلى الأمام التي استخدمت في أول رد فعل، والإشعال عكس في تفاعل PCR الثانية تستخدم لإدراج مواقع التقييد. ولذلك، منتجات PCR سلسلة ألفا وبيتا التي يتم الحصول عليها على استعداد ليكون التسلسل الفرعي المستنسخة داخل قالب المتجهة للفيروسات الرجعية ( الشكل 1).

منتجات
  1. دايجست بكر المنقي من بيتا متداخلة التفاعل مع بستبي ومفيي (الجدول 3)-
    ملاحظة: لا تتجاوز 5 ميكروغرام إدراج.
  2. في نفس الوقت، هضم ناقل القالب مع بستبي ومفيي (الجدول 3). استخدام 1-2 ميكروغرام ناقل القالب الواحد تكر. تشغيل ناقلات هضمها على [اغروس] هلام، وعزل الفرقة أكبر (~ 7500 bp). تنقية الموجه مع هلام طقم تنقية الحمض النووي-
    ملاحظة: أثناء هضم إنزيم التقييد، منطقة قالب متغير تكر-بيتا مورين إزالة، والسماح لإضافة منطقة متغير البشرية تكر-بيتا-
  3. تنقية منتجات PCR هضمها باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR.
    ملاحظة: التحقق من قدرة تنقية الحمض النووي من الأعمدة المضمنة في المجموعة؛ استخدام عدة أعمدة إذا لزم الأمر. الحد الأدنى لإدراج المنقاة اللازمة لرد فعل ربط نجاح هو 50 نانوغرام في تركيز الحد أدنى من 10 نانوغرام/ميليلتر. إذا لم يكن إدراج المنقي الكمية كافية لربط نجاح، يمكن أن تتكرر تفاعل PCR الثانية-
  4. علاج ناقل القالب مع إنزيم CIP يو 10 ح 1 في 37 درجة مئوية لمنع ربط الذاتي، تليها المنظمة الحرارة لمدة 10 دقائق في 75 ° جيم تنقية الحمض النووي مع مجموعة تنقية بكر (الجدول 3)-
  5. ليجت تكر-بيتا إدراج ومتجهة باستخدام الحمض النووي ليجاسى في إجمالي 20 ميليلتر في 6 الزائدة المولى للإدراج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: في المجموع، رد فعل ربط ينبغي أن تتضمن حوالي 150 نانوغرام من الحمض النووي (الجدول 3)-
  6. للتحولات، مزيج ميليلتر 8 من رد فعل ربط مع ميليلتر 80 المختصة كيميائيا الخلايا DH5α القولونية (جدول المواد) واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 صدمتها الحرارة 42 درجة مئوية ميليلتر إضافة 500 س. 45 سوبر مرق الأمثل مع المتوسطة قمع (S.O.C.) كاتابوليتي ويهز ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية.
  7. لوحة من 250 ميليلتر من ثقافة البكتيرية على الأمبيسلّين التي تحتوي على لوحة أجار ليسوجيني مرق (رطل). احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح ~ 16) في 37 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي اختيار المستعمرات البكتيرية، ويكبر في المتوسط 3 مل رطل تتضمن الأمبيسلّين بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد استخدام أدوات تنقية بلازميد الحمض النووي-
  9. تأكيد
  10. الإدراج الناجح للسلسلة بيتا بخلاصة التجارب صغيرة مع تقييد الإنزيمات بستبي ومفيي. في وحدة تخزين 12 رد فعل مجموع ميليلتر، الجمع بين 200-500 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي وميليلتر 0.25 لكل إنزيم 10 X إنزيم العازلة (الجدول 3). تشغيل رد فعل الخروج على 1% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد لتأكيد حجم الفرقة إدراج (~ 500 bp).
  11. بعد تأكيد وجود الإدراج، تسلسل المقطع تكر-بيتا في الموجه استخدام التمهيدي عكس آيريس (الجدول 1).
  12. عقب تأكيد تسلسل من إدراج تكر-بيتا، القيام بعملية مماثلة للإدراج إقليم متغير ألفا. هضم منتجات بكر المنقي من رد فعل متداخلة ألفا، وإدراج بيتا تكر الذي تم إنشاؤه حديثا تحتوي على ناقل، مع سنابي وساسيي.
    ملاحظة: أثناء هضم إنزيم التقييد، منطقة قالب متغير تكر-ألفا موريني إزالة، والسماح لإضافة منطقة متغير تكر-ألفا البشري-
  13. ألفا
  14. ليجاتي إدراج في ناقلات تكر ترميز المطابق بيتا متغير المنطقة استخدام الحمض النووي ليجاسى في إجمالي 20 ميليلتر في فائض المولى 6 الإدراج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: في المجموع، رد فعل ربط ينبغي أن تتضمن حوالي 150 نانوغرام من الحمض النووي (الجدول 3)-
  15. للتحولات، مزيج ميليلتر 8 من رد فعل ربط مع ميليلتر 80 المختصة كيميائيا الخلايا DH5α القولونية (جدول المواد) واحتضان على الجليد للحد الأدنى 30 صدمتها الحرارة 42 درجة مئوية عن 45 س. إضافة 500 ميليلتر S.O.C. المتوسطة ويهز ل 1.5 ح في 37 درجة مئوية.
  16. لوحة من 250 ميليلتر من ثقافة البكتيرية على الأمبيسلّين التي تحتوي على لوحة أجار ليسوجيني مرق (رطل). احتضان لوحة بين عشية وضحاها (ح ~ 16) في 37 درجة مئوية.
  17. في اليوم التالي اختيار المستعمرات البكتيرية، ويكبر في المتوسط 3 مل رطل تتضمن الأمبيسلّين بين عشية وضحاها. عزل الحمض النووي بلازميد استخدام أدوات تنقية بلازميد الحمض النووي-
  18. تأكيد
  19. الإدراج الناجح لسلسلة ألفا بخلاصة التجارب صغيرة مع إنزيمات التقييد سنابي وساسيي. في وحدة تخزين إجمالي رد فعل ميليلتر 12 الجمع بين 200-500 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي وميليلتر 0.25 لكل إنزيم 10 x إنزيم العازلة (الجدول 3). تشغيل رد فعل الخروج على 1% [اغروس] هلام يحتوي على اثيديوم بروميد لتأكيد حجم الفرقة إدراج (~ 500 bp).
  20. بعد تأكيد وجود الإدراج، تسلسل المقطع تكر-ألفا في الموجه استخدام التمهيدي MSCV2 إلى الأمام (الجدول 1).
  21. بمجرد التحقق من صحة تسلسل السلسلة ألفا، من التحقق من إدراج تكر كاملة بالتسلسل مع تكر-بيتا-عكس وعكس IRES التمهيدي (الجدول 1).

5. تحقق من تكر الخلية السطحية التعبير وخصوصية.

ملاحظة: يتم استخدام الخلايا HEK293T لاختبار نجاح تكر سلسلة باريالحرس الوطني وخلية سطح التعبير ( الشكل 3A) 8. الببتيد-MHC تيترامير تلطيخ يمكن أيضا إجراؤها على transfected الخلايا HEK293T لاختبار للاحتفاظ بخصوصية مستضدي وظيفة تكر عزل الجينات ( الشكل 3B).

°
  1. صفيحة من الخلايا HEK293T في لوحات زراعة الأنسجة 12-جيدا في 1 × 10 5 خلايا كل بئر في 1 مل كاملة دميم وسائل الإعلام التي تحتوي على 5 ٪ السفح، والثقافة بين عشية وضحاها في 37 لوحة جيم إلى خلايا كافية عينت آبار منفصلة لكل تكر جديدة ، التحكم التحكم قالب تكر ناقل، وناقل CD3 فقط، تكر ناقل فقط، وغير transfected جيدا.
    ملاحظة: تعداء بالكامل ماوس قالب تكر المتجهات (نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف-بميا) في تركيبة مع mCD3εγδζ-بميج ناقل، وناقل نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف بميا وحدها، وناقلات mCD3εγδζ-بميج وحدها تستخدم كعناصر إيجابية وأخرى سلبية.
    ملاحظة: دميم كاملة تحتوي على 2 مم ل الجلوتامين، 1 مم بيروفات صوديوم، 100 ميكرومتر الأحماض الأمينية الأساسية عدم، 5 ملم حبيس المخزن المؤقت، 5.5 × 10 -5 وحدات من 2-mercaptoethanol، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين-
  2. في اليوم التالي، ترانسفيكت الخلايا مع 1 ميكروغرام تشيميريك ح/نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف-بميا متجه، 1 ميكروغرام الماوس CD3εγδζ-بمسكفيي-التجارة والنقل (بميج) ناقلات وكاشف تعداء المستندة إلى الحويصلية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  3. لكل تكر، إضافة كاشف تعداء ميليلتر 6 إلى 100 ميليلتر درجة حرارة الغرفة، دميم خالية من المصل. باختصار من دوامة، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
  4. منفصل 1.5 مل أنابيب الجمع بين 1 ميكروغرام من ناقلات بميا تكر 1 ميكروغرام الماوس ناقل CD3εγδζ-بمسكفي-التجارة والنقل (بميج)، أو 1 ميكروغرام لكل ناقل منفصلة لعناصر التحكم.
  5. إضافة
  6. دروبويسي، حل الكاشف/دميم تعداء للأنابيب التي تحتوي على ناقل الحمض النووي. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
  7. إضافة
  8. دروبويسي، حل الكاشف/دميم/الحمض النووي تعداء الخلايا HEK293T. اضغط برفق لوحة لمزيج. احتضان في 37 درجة مئوية ل 24 h.
  9. ح بعد 24 استبدال وسائط الإعلام، وإبقاء الخلايا في ثقافة إضافية 24 حاء
  10. إزالة خلايا من اللوحة بواسطة بيبيتينج قوية، ووصمة عار الخلايا مع الماوس المضادة CD3 جسم (2.5 ميكروغرام/مل) التحقق من سطح التعبير عن تشيميريك-تكر بالتدفق الخلوي-
  11. بوابة
  12. من أجل مقارنة التعبير CD3 بين الخلايا التي تم transfected إلى مستوى مماثل، تحليل الخلايا معربا عن مستوى عال مماثلة من جزيئات مراسل الفلورسنت (التجارة والنقل ل CD3 المعقدة، وأميتريني لناقلات التعبير تكر). على الوجه الأمثل، ينبغي أن بوابات التحليل على بروتينات فلورية خضراء + أميتريني + الخلايا ضمن 10 4 إلى 10 5 الفلورسنت كثافة ( الشكل 3A).
    ملاحظة: يجب أن يكون مستوى التعبير CD3 في الخلايا transfected مع بناء تشيميريك قابلة للمقارنة لناقل التحكم الماوس (القالب الأصلي) ( الشكل 3A). ناقلات تكر الفيروسات التراجعية التي تم إنشاؤها متوافقة مع نظم في فيفو التعبير كما هو موضح سابقا 4-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتم فحص كفاءة تفاعل PCR متعدد-متداخلة في خطوة 3.2.7 (الشكل 2) قبل نفاد 5µL رد الفعل الثاني على [اغروس] هلام. متوسط كفاءة التضخيم تكر-بيتا من المتوقع بنحو 80 في المائة، بينما فعالية رد فعل تكر-ألفا عادة ما تكون أقل، في حوالي 50%4. يمكن أن تستخدم فقط إقران سلاسل تكر-ألفا وبيتا تكر تكر التعبير؛ ومع ذلك، يمكن أن التسلسل جميع منتجات PCR الحصول على معلومات المرجع والتسلسل تكر.

إسكات الجينات سيسمح فقط سلسلة بيتا تكر واحدة التعبير عنها في خلية T معينة. ومع ذلك، خلية T قادرة على إعادة ترتيب سلسلة فا تكر ثاني، وحوالي 25% خلايا T سوف تعرب عن تكر-فا في الإطار ثاني سلسلة 14. ومن المتوقع أن تكون نسبة بعض سلاسل ألفا تكر معزولة ألفا الثانوي بدلاً من سلسلة ألفا "الصحيح". سلسلة ألفا الثانوية غالباً ما ليس شريكا ربط أمثل مع سلسلة تكر-بيتا؛ ونتيجة لذلك، فمن المتوقع أن تكرس المستنسخة ليست كلها ستشكل مستقر المعقدة وصريح على سطح الخلية. ولذلك، السليم تكر سلسلة الأقران والخلية السطحية يحتوي التعبير لتأكيد ترانسفيكتينج HEK293T الخلايا (الشكل 3A).

Figure 1
الشكل 1 . بكر متداخلة متعدد مبسطة وتطوير بنية الفيروس من الخلايا T واحد. جولتين من PCR يؤدي إلى تضخيم تكر المقابلة سلاسل ألفا وبيتا. تسمح المواقع تقييد جزءا لا يتجزأ في الإشعال دون استنساخ مبسطة وتوليد الإنسان/ماوس ناقل تشيميريك للتعبير في الخلايا الماوس. يمكن استخدام قالب ماوس ناقل للتبديل بسهولة خارج مناطق الماوس متغير للبشرية وتوليد تشيميريك الإنسان/ماوس تكر الفيروسات التراجعية ناقل متوافق مع التعبير في الخلايا الماوس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . مثال لخلية مفردة في PCR. متعدد المتداخلة [بكر] تضخيم الخلية تي مستقبلات ألفا وبيتا سلاسل من الخلايا تي البشرية واحد فرز في لوح واحد 96-جيدا. يظهر هي المقابلة (العلوي والسفلي) [بكر] منتوجات من خلية مفردة تضخيم تكر بيتا وتكر سلاسل ألفا من البشر ببمكس. NC-لا قالب التحكم، PC-مراقبة إيجابية. بواسطة تشغيل جزء صغير من رد فعل على [اغروس] هلام (5 ميليلتر)، يؤكد كفاءة التفاعلات خلية مفردة بكر سلسلة ألفا وبيتا قبل المنتج بكر التسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تحقق خلية السطحية تشيميريك تكر التعبير وخصوصية. ماوس HEK293T (A) خلية تم transfected مع تكر أو ماوس الإنسان تكر تشيميريك في تركيبة مع الماوس CD3εγδζ. وتم قياس الخلايا السطحية تكر التعبير مع الأجسام المضادة mCD3ε. النابضة الاستراتيجية: أولاً، عن طريق بوابة التحليل في أميتريني وبروتينات فلورية خضراء مزدوجة الخلايا إيجابية (G2). وفي حالة عناصر ناقل واحد النابضة قد تستند الأسفار واحد (G1). ثانيا، يتم تحليل الخلايا من G1 و G2 لمستوى التعبير CD3ε. (ب) تكر خصوصية تؤكده تيترامير تلطيخ الخلايا 293T مع DRB1 * 0401:GAD115-تيترامير 127. عن طريق بوابة التحليل على بروتينات فلورية خضراء + أميتريني + CD3ε + الخلايا، كما هو موضح في (A). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجينات المستهدفة التوجيه التمهيدي التسلسل
عكس النسخ
كدنا تراك أجكتجاككاكاجككج
كدنا TRBC1 جااتككتتكتكتجاككاتج
كدنا TRBC2 جككتكتجاتككتتكتكت
تكر تفاعل PCR ألفا 1
TRAV1-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجتجججاجكتتككتكتكتاتجتت
TRAV1-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجتجججاجتتتككتكتتاتجتتك
TRAV2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتتجكاجاجكاكتكتج
TRAV3 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجككتكتجكاكككاتكتكج
TRAV4 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجكاجتجكجاجاجتجاتك
TRAV5 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاكاتتجكتجاتتتكجتك
TRAV6 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجتكاتككتججاجتجتت
TRAV7 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاجاتجكجاجاككتجتك
TRAV8-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتككتجتجكتكاتاككاجتجك
TRAV8-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتككتجكتجكتكجتككك
TRAV8-3 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتككتجاجكتاتكككاكتج
TRAV8-7 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتكتاجتجتكاتكتجكتجكت
TRAV9-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاتكتكتككاجاككاجكج
TRAV9-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاكتاتكتككاجكتاجتاتكتكتجاتاكتك
TRAV10 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجااااجكاتكتجاكجاككتكتج
TRAV12-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاتاتككتجاجاجتتتاكتجتجاتكك
TRAV12-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاتجااتككتجاجاجتتتاكتاجتجاتكك
TRAV12-3 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاتجااتككتجاجاجتتتاكتجتج
TRAV13-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاكاتككاتكجاجكتجتاتتاتاتكك
TRAV13-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكاجكاتكجاجكتتاتت
TRAV14 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجتكاكتتكتاجككتجكتجاجتج
TRAV16 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجكككاكككتكاتكتكاجتج
td > TRAV17 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجااكتكتككتججاجتجتكتتج TRAV18 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتجتكتجكتككتجكتكاج TRAV19 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتجاكتجككاجككتجتجاج TRAV20 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاااتجتجاجتجتجكاتك TRAV21 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاكككتكتججككتج TRAV22 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاجاتاتججاجكتكتجكت TRAV23 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاكاجاتكتاجاجكاتكاتتتتاج TRAV24 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاجاتككتتجكاجكك TRAV25 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتاكتكاتكاكاتكاتجتجتكتات TRAV26-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجكتجتجكاجاجتاكتج TRAV26-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجتجتجاكاجكاتاكتجتاكتكك TRAV27 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجتككتجااتكتككجتجتكك TRAV29 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجككاتجكتككتجججج TRAV30 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاكتكتككتجااجتجكتتكاج TRAV34 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاكتجتكتجكاجتاكتككتاج TRAV35 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكتككتجاكاتتاتاتاتكتجتج TRAV36 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاتجاجتجتككاكاجكتتاكتاجك TRAV38-1 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاكاكجاجتاجكتجكتجتجج TRAV38-2 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجكاتجكككتجكتككت TRAV39 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاجاجكتاكتاجكاتجاتكتجتج TRAV40 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجاكتككتكتكتجاكتتكتاتكتجا TRAV41 إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتجتجاجاتككجكاتتتتج الأموال الخارجية عكس كاجاكاجاكتجتكاكتجاتتاجاجتكتك تفاعل PCR تكربيتا 1 TRBV2 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاتاككتجكتكجتاتجكتج TRBV3-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكتجكاجكتككتكتج TRBV4-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكتجكاجكتجكتكتج TRBV5-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكتككاجكتجكتكتجت TRBV5-3 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججككككججكتكك TRBV5-4 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكككتججكتككتكت TRBV5-8 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججاكككاجكتككتكتكت TRBV6-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجكاتكججكتككتجتجك TRBV6-2 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجككتكججكتككتجتج TRBV6-4 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجاتكاجكتككتجتجكتجتج TRBV6-6 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجكاتكاجككتككتجتجكتج TRBV7-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاكاجكتككتكتجك TRBV7-2 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاككاجكتككتكتكت TRBV7-3 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاككاجكتككتكتج TRBV7-6 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاككاجتكتككتاتجكتج TRBV7-7 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججتاككاجتكتككتاتجكتجج TRBV7-9 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاككاجككتككتكتج TRBV9 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكتكاجكتككتكتجكت TRBV10-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاكجاجكتكتكتكتاتج TRBV10-2 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاككاجكتكتكتكتاتج TRBV10-3 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكاكاجتجتكتكتاتجتج TRBV11-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجكاككاجكتكتكتجكتج TRBV11-3 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججتاككاجكتككتكتجكتج TRBV12-3 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاكتككتجاككتكتجكتجت TRBV12-4 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاكتككتجاكككتكتجكتج TRBV12-5 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجككاككاجكتككتكتج TRBV13 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجكتاجتككتجاككتجككتجاكتك TRBV14 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجتتككاجكتكتكاجتتاجتجت TRBV15 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججتككتججكتكتككاكت TRBV16 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجكككاتاتكاككتجكاتكا TRBV17د >إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاتاتكتجكتككتكتجكتج TRBV18 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاكاككاجاجتاكتكتجكتجتجك TRBV19 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاجكاككاجتجكتكتجكتج TRBV20 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجكتجكتجكتكتجكتجكتكت TRBV24-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجككتكككتجكتكتكتكتج TRBV25-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجاكتاتكاجكتككتكتجكتاكاتج TRBV27 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججكككككاجكتككتج TRBV28 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتججاتكاجكتككتكتجتكج TRBV29-1 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجكتجاجتكتكتجكتككتكتككت TRBV30 إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتجكتكتجكتكتكتككتجكككت الخارجية تربك عكس جتجككاجكاكاككاجتجتج تكر تفاعل PCR ألفا 2 الأموال الداخلية عكس كاجكتجتاكاككجكجججتكاججتكتج محول تراف إلى الأمام كجتكاجكاجاتجككتاكجتاتج بيتا تكر بكر الرد 2 تربك الداخلية عكس كتكتجكتكتجاتغتكجاكاكاجكجاككتكج محول تربف إلى الأمام كاجاجاكجكاتاكجاجاتكاتجاتج ترتيب الإشعال بمسكف الثاني إلى الأمام ككتككتكتككتككاتككجكك تكربيتا عكس جككاجكاكاكجاججتاجكك آيريس عكس آكجكاكاككجككتاتكك * تشير الأحرف الحالة الأدنى ضمن تسلسل التمهيدي إلى إنزيم التقييد أدرجت قطع مواقع

الجدول 1: عكس النسخ، وبكر، والإشعال التسلسل.

الخطوة 2، 2 المبالغ لكل بئر
RT-PCR تفاعل (6μL) (ميكروليتر)
المخزن المؤقت x 10 0.6
2 x دنتب 0.24
تريتون 10% X 0.06
3 محددة تكر الإشعال (ea 10 ملم). عصام 0.23. (x 3 = 0.69)
إنزيم 0.18
مثبط رناسي 0.28
NF(nuclease-free) H2O 3.95
الخطوة 3.1
رد فعل PCR 1 (25μL) (ميكروليتر) ب تفاعل PCR 1 (25μL) (ميكروليتر)
5 x العازلة 5 5 x العازلة 5
دنتب (10 مم) 1 دنتب (10 مم) 1
[دمس] 0.75 [دمس] (3%) 0.75
حمام سباحة (و التمهيدي) (2.3μM) 0.3 تجمع ب (و التمهيدي) (2.3μM) 0.5
كتاب R خارجية (10uM) 0.6 ب الخارجية البحث التمهيدي (10μM) 1
بوليميراز الدنا 0.2 يذهب [تق] [بولمرس] 0.2
RT-PCR كدنا 2.5 RT-PCR كدنا 2.5
NF-ح2س 14.65 NF-ح2س 14.05
الخطوة 3، 8
[بكر] رد فعل 2-الشيء نفسه بالنسبة وب (25μL) (ميكروليتر)
5 x العازلة 5
دنتب (10 مم) 1
[دمس] 0.75
محول و التمهيدي (10μM) 1
الداخلية R التمهيدي (10μM) 1
بوليميراز الدنا 0.2
بكر ركسن 1 المنتج 2.5
NF-ح2س 13.55

الجدول 2. عكس النسخ وردود الفعل PCR.

خطوات 4.2 و 4.3
تربف دايجست الرد (50μL) (ميكروليتر) نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف بميا ناقلات دايجست (500μL) (ميكروليتر)
الحمض النووي (~ 20μg) الحمض النووي (~ 20μg)
مفيي 2 مفيي 20
بستبي 2 بستبي 20
10 × المخزن المؤقت 5 10 × المخزن المؤقت 50
ح2س ح2س
الخطوة 4، 4
رد فعل المركز الدولي للبطاطا (100μL) (ميكروليتر) DNA(~1.5mg)
> هضمها & تنقية الحمض النووي متجه 84 10 × المخزن المؤقت 10 المركز الدولي للبطاطا الإنزيم 6 الخطوة 4، 5 ربط الرد (20μL) (ميكروليتر) ناقل يهضم سيبيد الحمض النووي (يبلغ مجموع المبلغ إدراج وناقلات ~ 150ng) إدراج الحمض النووي (وصول المولى 6 المتجهات) 2 × ليجاسى المخزن المؤقت 10 الإنزيم ليجاسى 1 ح2س الخطوة 4.9 اختبار خلاصة الرد (12μL) (ميكروليتر) الحمض النووي (100--300ng) 1 مفيي 0.25 بستبي 0.25 10 × المخزن المؤقت 1.2 ح2س 9.3 الخطوة 4.11 طراف خلاصة الرد (60μL) (ميكروليتر) التي تحتوي على بيتا--نظام مراقبة تكنولوجيا القذائف بميا ناقلات دايجست (120μL) DNA(~1.5μg) الحمض النووي (~ مقدار 3 μg) سنابي 3 مفيي 6 ساسي 2 بستبي 4 10 × المخزن المؤقت 6 10 × المخزن المؤقت 10 ح2س ح2س

الجدول 3. ناقل الاستنساخ ردود الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في البروتوكول الحالي، يصف لنا طريقة فعالة لخلية مفردة تكر التضخيم واللاحقة دون استنساخ تكر إقران سلاسل ألفا وبيتا في ناقل للفيروسات التراجعية تعبير قالب. على الرغم من ذلك، وقد وضعت عدة بروتوكولات بكر خلية مفردة، وحتى الآن لم يكن أي متوافقة مع فورا دون استنساخ إلى متجه تعبير. في معظم الحالات، يتم تضخيمه تسلسل جزئية تشمل مناطق CDR3 اختلافاً كبيرا، مع تسلسل ما يكفي لاستقراء المنطقة المتغيرة. هذا أصغر حجم المنتج بكر يدعم كفاءة بكر أعلى، ولكن يستلزم حيثياته تكر الجيني التجميعي للدراسات الفنية. البروتوكول الحالي يحافظ على كفاءة المنشورة سابقا تركز على CDR3 وحيد الخلية تكر تسلسل البروتوكولات، وفي الوقت نفسه الغلة amplicon أطول تتضمن كل متغير المنطقة مناسبة للاستنساخ. ولذلك، قد النظام المذكور زيادة مرونة في إعطاء تسلسل كمي، فضلا عن إخراج الوظيفية.

حسب المسألة العلمية الموجهة، يمكن أن تختلف المصدر وخصوصية من خلايا تي التي تم تحليلها. ومع ذلك، إذا كان الهدف النهائي من هذا المشروع هو تحليل الدالة تكر في فيفو ، من الضروري أن تعرف تقييد هلا خلايا تي معزولة. البروتوكول الحالي قد صممت خصيصا لتكون متوافقة مع التعبير في فيفو تكر في أنسنة هلا الفئران. العديد من هذه الفئران تم إنشاؤها، وهي الآن متاحة تجارياً، بما في ذلك هلا-A2.1، HLA DQ8 (هلا DQA1 * DQB1 هلا 301، * 302)، هلا-DQ6 (DQA1 * تغ، HLADQB1 * 0602)، HLA DR4 (DRB1 * امتثل)، هلا DR1 (DRA * 0101، DRB1 * 0101)، هلا-A11 (A * 11:01/ك)، هلا-B2705، هلا-A24، والسلالات المحورة وراثيا هلا-ب * 0702. يمكن الجمع بين هذا البروتوكول بنجاح مع البروتوكول المنشورة سابقا للفيروسات التراجعية نخاع العظام وساطة التعبير الخلايا الجذعية البشرية تكرس4،،من1516. ونحن نتوقع أن تكر أنسنة ريتروجينيك النظام المطبق ومفيدة للغاية لتحليل وظيفي لتكرس البشرية في مختلف المناعة الذاتية، السرطان، ونماذج المعدية.

خلية مفردة الحالي بروتوكول بكر يصف الخطوات الحاسمة ويعطي الاقتراحات اللازمة لنجاح التضخيم إقران تكر-ألفا وبيتا تكر تسلسل. هو الخطوة الأولى الحاسمة أداء في الوقت المناسب من النسخ كدنا، والجولة الأولى اللاحقة لبكر متعدد. ينبغي إجراء جميع الخطوات التي تنطوي عليها في الوقت مناسب، وإبقاء جميع الكواشف والخلايا على الجليد لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي وكدنا. ثانيا، نظراً لأن البروتوكول يهدف إلى أن تكون حساسة للغاية لمستويات منخفضة من القالب، عرضه للتلوث. ولذلك، لا بد العمل في منطقة خالية من قالب، بعيداً عن تضخيم PCR المنتجات أو تكر ناقل الاستنساخ. ينبغي استخدام غرفة منفصلة أو غطاء لإعداد كدنا وردود الفعل PCR. ينبغي إضافة قالب من بكر أول رد فعل في منطقة مختلفة من حيث إعداد بكر. فمن المستحسن أن تستخدم مجموعة منفصلة من الكواشف الكوتيد لتجارب بكر خلية مفردة.

وقد الأمثل هذا البروتوكول على وجه التحديد استخدام الكواشف المدرجة في الجدول للمواد، وأي تبديل في الكواشف سوف تتطلب التحسين إضافية. يمكن تعديل تحديد محددة مستضد الخلايا الأولية لاستخدام tetramers الببتيد-MHC. تلوين تيترامير تسمح بتقييم المتزامن لخصوصية مستضد، فضلا عن تقييد هلا. ويمكن اعتبار أساليب بديلة للكشف عن مستضد تفاعلية، مثل upregulation علامات التنشيط المبكر أو إفراز السيتوكينات الالتهابية في غياب الكواشف تيترامير. على سبيل المثال، يمكن الجمع بين خصوصية المزدوج الانصهار أجسام محددة مستضد الخلايا T و IFNγ مع عزل حبة المغناطيسي لإثراء مستضد رد الفعل IFNγ المنتجة للخلايا.

بينما بناء الإنسان/الماوس تشيميريك المبينة في البروتوكول أن يضمن التوافق مع خلايا الفأر، مستوى توافقه مع CD3 البشرية المعقدة غير معروف. على الرغم من أن اختبار ليس رسميا من قبلنا، آخرين قد أظهرت أنه يمكن التعبير عن تشيميريك بنيات تكر مع مناطق ثابتة مورين على سطح الخلايا الليمفاوية البشرية17. يشير هذا إلى أن مورين تكر المناطق ثابتة يمكن أن تدعم التفاعل مع البشرية CD3 إشارات معقدة. ومع ذلك، إذا كان الهدف التعبير عن تكرس المحددة في الخلايا البشرية الأولية أو خطوط الخلايا البشرية، مثل الخلايا جوركات، قد يكون نهجاً أكثر أمثل لاستخدام بناء الإنسان الكامل. يمكن أن يتحقق هذا بمبادلة مورين مناطق ثابتة داخل الموجه مع مناطق ثابتة البشرية.

إذا كانت منطقة متغير تكر محددة تحتوي على أحد مواقع تقييد استخدامها لاستنساخ، تكر ينبغي إدراجه في ناقل مكوك وتحور بعد ذلك استخدام عدة الطفرات موقع موجها للحث على تغيير النوكليوتيدات صمت داخل القيد قطع الموقع. نهج بديل توليف حيثياته المنطقة تكر متغير لمصلحة تعديل لاستبعاد الموقع القيود غير المرغوب فيها.

القيد الرئيسي من هذا الأسلوب هو عدم القدرة على القضاء على تضخيم سلاسل ألفا 'هيولى' الثانوية. الجينات تكر-ألفا لا تذهب من خلال استبعاد الاليلي مثل الجينات تكر-بيتا، وبالتالي سوف يعبر عن نسبة كبيرة من خلايا تي سلسلة ألفا 'هيولى' ثانوية14. [بكر] بروتوكول وصف النتائج فقط في تضخيم واحد تكر سلسلة ألفا، ولكن إذا كانت السلسلة ألفا تضخيم هو سلسلة ألفا 'هيولى' أنه لا يجوز زوج مع سلسلة بيتا تضخيم. ولذلك، من الضروري اختبار تكر التعبير سطح الخلية في الخلايا HEK293T التأكد من إقران سلسلة ناجحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذه الدراسة من JDRF 1-FAC-2014-243-A-N، أدا 7-14-جي-07، والمعاهد الوطنية للصحة 5 P30 DK079638-05 الطيار بيتاجول، وروبرت ومؤسسة ماكنير جانيس.

ونشكر ساندرا بينا وماكدونالد أندريني للتوظيف المريض، وصمويل بلوم للمساعدة التقنية، والدكتور جورج ماكيدوناس للهدية من الأجسام المضادة ومراقبة الحمض النووي يستخدم للتحسين PCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFSE  eBioscience  65-0850-84 5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421 Biolegend  317433 2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 Biolegend  317336 2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647 Biolegend  100322 2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU   VWR 97068-158 0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit  Invirtogen  4368814 9 U (RT enzyme) 
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL Invirtogen  AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U VWR PAM3008 1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate Phenix MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film  ThermoFisher  4306311
UltraPure Agarose  Invirtogen  15510-027
SnaBI New England Biolabs  R0130 15 U (insert) 30 U (vector)
SacII New England Biolabs  R0157 40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI New England Biolabs  R3589S 40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI New England Biolabs  R0519 40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP) New England Biolabs  M0290S 10 U
Quick ligase  New England Biolabs  M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems  Promega  A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems  Promega  A7640
DNA clean & concentrator-25 kit Genesee Scientific  11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit Genesee Scientific  11-306A
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells  ThermoFisher  18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) Mirus  MIR2300
BD FACS Aria II (sorter) BD
BD Fortessa (flow cytometer) BD 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2, (5), 309-322 (2002).
  2. Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8, (10), 788-801 (2008).
  3. Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153, (4), 785-796 (2013).
  4. Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. (2016).
  5. Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31, (4), 643-653 (2009).
  6. Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121, (1), 288-295 (2011).
  7. Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19, (11), 1542-1546 (2013).
  8. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22, (5), 589-594 (2004).
  9. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5, (5), 627-638 (2005).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136, (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, (3), 191-197 (2006).
  12. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283, (1-2), 173-183 (2003).
  13. James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
  14. Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16, (4), 423-429 (2001).
  15. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
  16. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, (10), 1837-1840 (2013).
  17. Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66, (17), 8878-8886 (2006).
تبسيط خلية مفردة تكر العزلة وتوليد نواقل فيروسات النسخ العكسي <em>في المختبر </em>و <em>في فيفو</em> التعبير لتكرس البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sprouse, M. L., Blahnik, G., Lee, T., Tully, N., Benarjee, P., James, E. A., Redondo, M. J., Bettini, M. L., Bettini, M. Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs. J. Vis. Exp. (127), e55379, doi:10.3791/55379 (2017).More

Sprouse, M. L., Blahnik, G., Lee, T., Tully, N., Benarjee, P., James, E. A., Redondo, M. J., Bettini, M. L., Bettini, M. Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs. J. Vis. Exp. (127), e55379, doi:10.3791/55379 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter