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Immunology and Infection

简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外和体内表达人类 TCRs

Published: September 10, 2017 doi: 10.3791/55379
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 3, 2, 4, 1, 1
1Department of Pediatrics, Section of Diabetes and Endocrinology, McNair Medical Institute, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital, 2Benaroya Research Institute at Virginia Mason, 3Center for Human Immunobiology, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital, 4Department of Pediatrics, Section of Diabetes and Endocrinology, Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital

Summary

当前的协议结合了单细胞配对人类 TCR α和β链测序与与体外和体内TCR 表达相兼容的反转录病毒载体的生成。

Abstract

虽然, 有几种方法的排序的配对 t 细胞受体 (TCR) α和β链从单一 t 细胞已经开发, 迄今没有有利于下游体内功能分析的 TCR heterodimers。我们已经开发了一个改进的协议的基础上 two-step 多重嵌套 pcr, 这导致一个 pcr 产品横跨整个可变区域的人类 TCR α和β链。通过确定独特的限制点, 并将它们纳入 pcr 引物, 我们已经使 pcr 产品与直接 sub-cloning 与模板逆转录病毒载体相兼容。由此产生的逆转录病毒构建编码一个嵌合的人/鼠 TCR 与鼠标的细胞内域, 这是功能在鼠标细胞或在体内鼠标模型。总的来说, 这里描述的协议结合了人类单细胞配对 TCR α和β链识别与简化的逆转录病毒载体易于适应体外和体内TCR 表达。视频和伴随的材料被设计为对单细胞 PCR 的高度详细的描述, 因此关键的步可以被跟随和潜在的陷阱避免。此外, 我们还提供了生成表达载体所需的克隆步骤的详细描述。一旦掌握, 从单细胞排序到 TCR 表达的整个过程可以在短短的两周内完成。

Introduction

t 细胞受体 (TCR) 指示 t 细胞命运决定在发展期间, 稳态/稳态, 和抗原刺激的外围1,2,3。最近的深度测序技术的扩展揭示了先前未被低估的抗原特异 T 细胞反应中的 TCR 多样性。TCR 多样性表明了功能广泛的 T 细胞反应的潜力。为了将 TCR 序列剧目分析与 TCR 功能分析相结合, 测序方法应设计为与实验系统兼容, 并用于后续的功能性研究的体内模型。TCRs我们已经开发了一个有效的方法, 人类 TCR 序列隔离和简化 sub-cloning 成嵌合体的人/小鼠 TCR 模板载体与 TCR 表达的 HLA-人性化的老鼠4。heterodimeric TCRs 的相应α和β链的分离需要从单个细胞中扩增两个链。虽然, 已经开发和利用了几个单细胞的 TCR 克隆协议, 但迄今为止, 没有一个能够很容易地与高通量简化的 Vα/Vβ TCRs 的直接克隆相兼容, 成为重新体内的反转录病毒载体 4、5、6、7。以前的研究采用了两种主要方法, 要么是有选择地放大 TCR 的有限部分足以推断序列, 要么放大整个 TCR 序列4,5,6,7. 通过第一种方法获得的 TCR 序列的下游功能分析需要昂贵的在硅片中程序集和de 从头构造 TCR。虽然第二种方法提供完整的 TCR 序列, 但人的恒定区域与在鼠标模型中克隆的 TCRs 的在体内表达不兼容。我们的方法是专门设计为与在体内的功能分析 TCRs 在小鼠模型中兼容。我们开发了一个高效和简化的单细胞 pcr 协议, 允许直接 sub-cloning pcr 片段到模板表达载体。

我们的方法采用了一个高度敏感的多重嵌套 PCR 反应, 这是两个步骤执行。在第一个复用反应步骤中, 所有 v-β链的40引物的池, 以及所有 v 型α链专用的44个引物池, 用于放大 TCR-α或 TCR-beta, 而无需事先了解序列 (表 1)。前引物有一个适配器序列, 这是纳入 PCR 产品的 5 "。反向底漆基于 TCR 的恒定区域。我们已经确定了在人类变量或连接 TCR 区域中不存在的唯一限制站点, 并将它们合并到新重新设计的 TCRα和 TCRβ引物 (图 1) 中。在第二个嵌套反应中, 使用在恒定区域内的适配器序列和嵌套反向底漆的底漆, 用于进一步放大 TCR 链, 增加特异性 (表 1,图 1)。单细胞分离后, 两轮 pcr (第一反应与池的 Vα和 Vβ引物, 第二次与适配器引物) 产生的 pcr 产品, 可以直接 sub-cloned 到模板逆转录病毒载体。最后的 TCR 结构将编码, 在一个单一的开放阅读框架, 人的可变区域结合的小鼠恒定区域连接的 ' self-cleaving ' 蛋白序列, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A 序列已在多个系统中使用, 并已被广泛测试, 专门用于表达 TCRs8、9、10、11。虽然, 在翻译以后多数 P2A 序列仍然附有由一个灵活的链接器连接的阿尔法链子的 C 末端, 而 beta 链信号序列有另外的脯氨酸, 这种修改对 TCR 作用没有有害作用。在构造中使用鼠标常量区域, 而不是人类, 以避免 re-expressed 在鼠标单元格中时与下游信号组件的潜在改变的交互。单一的, 将导致化学计量独立表达α和β链9,11。目前的协议是基于广泛可用的试剂和方法, 并且设计为以流线型和高效的方式进行。虽然我们已经明确地使用这项技术来检测 TCRs 从反应 T 细胞牵连自身免疫性糖尿病, 我们预计, 该协议可以广泛适用于识别和功能评估的人 TCRs 具体自身免疫表位, 肿瘤抗原表位, 或对病原体和疫苗的反应。

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Protocol

1. 确定感兴趣的 T 细胞群体.

注意: 抗原特异增殖与细胞分裂染料 (如羧基琥珀酰亚胺酯, CFSE) 可用于分离 T 细胞的基础上, 其增殖反应抗原刺激。如果从 PBMCs 开始, 7 天的 体外 扩展应该足以识别抗原特异的 CFSE 低种群 12 。

  1. 将 PBMCs 1:1 与 MHC 匹配的进纸单元混合, 并使用5和 #181 的标签; M CFSE 细胞分裂染料.
  2. 板 2-2. 5 x 10 5 每个井在 96-井圆底培养板中的每个单元格200和 #181; L 10% FCS 完整的 RPMI 介质.
    注: 完整的 RPMI 含有2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 不必要的氨基酸, 5 毫米 HEPES, 5.5 和 #215; 10 和 #8722; 5 单位 2-基, 100 U mL 和 #8722; 1 青霉素和100和 #181; g mL 和 #8722; 1 链霉素
  3. 用 25 #181; M 肽抗原刺激细胞.
  4. 在第四天的文化, 小心删除和更换100和 #181; L 的媒体.
    注: 抗原特异 T 细胞识别的一种更为优化的方法是使用肽 HLA 体 13 。聚丙烯染色允许同时评估抗原特异性以及 HLA 限制.

2。设置单个单元格排序.

  1. 执行引擎盖或指定区域中的所有过程, 没有放大的模板。分的试剂, 以避免污染, 清洁所有的工作表面, 如果可行, 设备与10% 漂白剂之前, PCR 设置。使用过滤提示, 核糖核酸和 dnasei 免费试剂和塑料在所有的 PCR 和载体克隆步骤。关键试剂可以在 材料表 中找到.
    注意: 多重 PCR 反应是高度敏感的, 低水平的污染会导致产品的放大.
  2. 通过将 10x rt 反应缓冲、25X DNTPs、9 u rt 酶、0.01% 海卫 x、0.7 u 核糖核酸抑制剂和 383 nM 的每个 rt TCR 底漆 (列于 表 1 ) 中, 在无菌移油藏中生成反向转录主混合。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移。请参见 表 2 , 以了解反应组件和每井的金额.
  3. 准备一个96孔 PCR 收集板的细胞分类由移6和 #181; L 的反向转录主混合每井与多通道吸管。把盘子放在冰上或放在寒冷的街区.
  4. 将带有抗体的细胞标记为细胞表面标志物 (如 CD4 和 CD3, 或 CD8 和 CD3, 分别在2和 #181; g/毫升, 结合细胞分裂染料或聚丙烯染色).
  5. 对每个单元格中的 T 单元格进行排序, 跳过第十二行, 这将作为一个负控制.
    注意: 排序的效率将取决于在板持有人的精确收集板对齐, 以及保持在一个较低的温度下的细胞和板块在 cDNA 反应之前。收集板应保持在冰的时刻, 除了在排序, 当他们固定在冷却板。并非所有机都装有温度调节板架;但是, 强烈建议使用一种。由于该类通常需要约 10-15 分钟每盘, 有一个增加的潜力, RNA 退化, 如果该板块不保持在低温.
  6. 作为一个正向控制, 在这个阶段用吸管将大量的细胞 (100 细胞) 手动添加到其中的一个井中。另外, 以前分离的 RNA 从汇集的细胞可以使用作为正面控制在 10 ng 每井.
    注: 为了避免其他井的交叉污染和假阳性结果, 移液管精确、小心地纯化了 RNA.
  7. 用胶膜封板, 在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
  8. 将 RNA 转录到25和 #176; c 为 10 min、37和 #176; c 为 45 min、85和 #176; c 为 10 min.
    注意: 为了保证有效的 pcr 反应, 建议在同一天进行第一次 pcr 反应。另外, 转录板可以保存在-80 和 #176; C 最多2月.

3。执行多重嵌套 PCR

注意: 准备所有的主混合在一个干净的无模板区, 以避免污染.

  1. 将每个可变区域底漆重新重建为100和 #181; M 与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 O。接下来, 结合20和 #181; L 每个44引物生成 V 型α入门池。生成 v 型β-beta 入门池结合20和 #181; l 每 40 v 型β底漆加上80和 #181; l dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 底漆序列在 表 1 中列出。一旦汇集, 每引物的集中在混合是2.3 和 #181; m.
  2. 将常量区域底漆重建为100和 #181; m 库存解决方案与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 将常量区域底漆稀释到10和 #181; m 工作解决方案和分使用.
  3. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β放大。通过合并5X 缓冲区来生成主混合80和 #181; m dNTPs, 3% 亚砜, 2 和 #181; m 底漆池 (每个底漆的最终浓度 46 nm), 200 nm TCR-恒定区域反转底漆, 1 U DNA 聚合酶, dnasei 和核糖核酸自由 H 2 O ( 表2/强 >)。为每96个井板, 构成足够的主混合为10另外的反应 (共计 106), 为了补偿液体损失在移期间.
    注: 计算依据的是25和 #181 的最终 pcr 量; 每个井, 22.5 和 #181; i. pcr 组合与2.5 和 #181; l cDNA 模板.
  4. 在冰上或在冷块中保留该板的 cDNA。使用多通道, 以吸管22.5 和 #181; L TCR β反应到一个新的96井 PCR 板。然后使用多通道传输2.5 和 #181; L cDNA 进入 PCR 板.
  5. 使用多通道吸管22.5 和 #181; L TCR α反应直接进入含有其余的 cDNA 的板块.
  6. 用粘合剂将板材密封, 轻轻涡旋, 然后在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
  7. 运行多重 PCR 反应与以下周期: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在54和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
  8. 在25和 #181 的最终容量中进行嵌套 pcr 反应; 使用2.5 和 #181; 采用多重 pcr 混合的 l 作为模板。
    1. 将内部和适配器的底漆重新制作为100和 #181; m 与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 10 和 #181; 等分为工作库存.
    2. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β ampl分类.混合5X 缓冲器, 25X DNTP, 3% 亚砜, 200 nm 前向适配器底漆, 200 nm 反向嵌套底漆, 1 U dna 聚合酶, 和 dna 聚合酶和无核酸的 H 2 O 为最后的容量22.5 和 #181; L ( 表 2 )。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移.
      注: 在第二 pcr 反应中使用 5X pcr 缓冲含有负载染料, 以方便琼脂糖凝胶负载.
    3. 使用多通道, 吸管的主混合为 TCR α和 TCR β反应在22.5 和 #181; L 每井成两个新的 96-井 PCR 板.
    4. 在2.5 和 #181 添加多重 PCR 反应模板; 每井.
      注: 其余第一个 PCR 反应应密封, 并存储在-20 和 #176; C 作为附加模板的源, 如果需要 (请参见 步骤4.3 注意 ).
    5. 密封板, 轻轻涡, 并在 1000 x g 旋转下来5分钟, 在4和 #176; C.
    6. 运行带有以下循环的嵌套 PCR 反应: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在56和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
    7. 运行5和 #181; L 最后的反应, 在1% 琼脂糖凝胶含有溴溴 (包括负和阳性控制井).
      注: 预计波段应运行约 500 bp 大小。 图 2 中显示了一个示例反应.
    8. 纯化第二反应的其余部分 (20 和 #181; l) 使用96井格式 PCR 纯化试剂盒, 洗与15和 #181; l 70 和 #176; C H 2 O 每井, 并执行桑格测序。使用适当的 TCR-α或 TCR-β适配器前向引物进行测序 ( 表 1 ).
      注意: 可以使用在线免疫软件分析序列.

4。亚克隆α和β PCR 链.

注: 第一反应中使用的正向引物的池, 第二个 PCR 反应中的反向引物用于合并限制部位。因此, 所获得的α和β链 PCR 产品可以按顺序 sub-cloned 到模板反转录病毒载体 ( 图 1 ).

  1. 使用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 从 beta 嵌套反应中摘录纯化的 PCR 产品.
    注: 请勿超过 5 #181; g 插入.
  2. 并行, 用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 来消化模板向量。使用1-2 和 #181; g 的模板向量每 TCR。在琼脂糖凝胶上运行的消化载体, 并隔离较大的波段 (〜 7500 bp)。用凝胶 DNA 纯化试剂盒净化载体.
    注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR-β变区被删除, 允许增加人类 TCR-β变量区域.
  3. 使用 pcr 纯化试剂盒提纯经消化的 pcr 产物.
    注: 验证套件中所含列的 DNA 纯化能力;必要时使用多个列。成功结扎反应所需的纯化插入物的最小用量为 50 ng, 最低浓度为 10 ng/和 #181;如果纯化的插入量是不足够的成功结扎, 第二个 PCR 反应可以重复.
  4. 将模板向量与 10 U CIP 酶用于1小时的37和 #176; c 以防止 self-ligation, 其次是热失活10分钟, 在75和 #176; c. 用 PCR 纯化试剂盒提纯 DNA ( 表 3 ).
  5. 结扎 TCR-β插入和向量, 使用 DNA 连接在20和 #181; L 总体积在6摩尔, 超过30分钟的插入物在室温下.
    注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
  6. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 表 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 为四十五年代. 添加500和 #181; 我超级物抑制 (soc) 培养基的最佳肉汤, 在37和 #176 时摇动1.5 小时; C.
  7. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
  8. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
  9. 确认通过 small-scale 测试-摘要成功插入 beta 链, 并使用限制酶 BstbI 和 MfeI。在12和 #181; l 总反应量, 结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10X 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
  10. 在确认插入的存在后, 使用 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 序列化向量的 TCR-beta 部分.
  11. TCR-beta 插入的顺序确认后, 执行类似的过程以插入 alpha 变量区域。从α嵌套反应中提炼纯化的 PCR 产物, 以及新生成的 TCR-β插入载体, 其中含有 SnaBI 和 SacII.
    注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR α变区被移除, 允许增加人类的 TCR-α变量区域.
  12. 结扎在20和 #181 中使用 DNA 连接对相应的 beta 变量区域进行编码, 并将其插入到 TCR 向量中; 在室温下, 6 摩尔的总体积超过30分钟的插入量.
    注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
  13. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 表 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 四十五年代. 添加500和 #181; 我 soc在37和 #176 时为1.5 小时的介质和抖动; C.
  14. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
  15. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
  16. 确认将α链成功插入的 small-scale 测试摘要与限制酶 SnaBI 和 SacII。在12和 #181; l 总反应容量结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10x 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
  17. 在确认插入的存在后, 使用 MSCV2-forward 入门 ( 表 1 ) 将向量的 TCR-alpha 部分序列化.
  18. 一旦验证了 alpha 链序列, 请通过 TCR-β-反转和 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 的顺序验证完整的 TCR 插入.

5。验证 TCR 细胞表面的表达和特异性.

注意: HEK293T 单元用于测试成功的 TCR 链ng 和单元格表面表达式 ( 图 3A ) 8 。多肽 MHC 聚丙烯染色也可以对转染的 HEK293T 细胞进行测试的保留抗原特异性后 TCR 基因分离 ( 图 3B ).

  1. 将12个组织培养皿中的 HEK293T 细胞在1毫升的 1 x 10 5 细胞中, 在5% 和 #176 的完整 DMEM 介质中包含37个 FCS 和区域性; c. 板出足够的细胞为每个新的 TCR 指定单独的井, 控制模板 TCR 矢量, 仅 CD3 向量, 控制 TCR 向量, non-transfected.
    注: 用完整的鼠标模板 TCR 载体转染 (纶) 与 mCD3 和 #949 结合; #947; #948; #950; pMIG 向量, 单纶向量, mCD3 #949; #947; #948; #950;-pMIG 矢量单独被用作正负控制.
    注: 完整的 DMEM 包含2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 非必需氨基酸, 5 毫米 HEPES 缓冲, 5.5 x 10 -5 单位 2-基, 100 U/毫升青霉素/链霉素.
  2. 第二天, 染1和 #181 的单元格; 纶向量、1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 载体, 和 liposome-based 转染试剂按照制造商的指示.
  3. 对于每个 TCR, 添加6和 #181; 将试剂转染为100和 #181; l 室温, 无血清 DMEM。短暂的旋涡, 并在室温下孵育15分钟.
  4. 在单独的1.5 毫升管中结合1和 #181; g TCR 纶向量与1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 矢量, 或1和 #181; 每个矢量的 g 分别用于控件.
  5. 滴, 将转染试剂/DMEM 溶液添加到包含矢量 DNA 的管中。室温孵育15分钟.
  6. 滴, 将转染试剂/DMEM/DNA 溶液添加到 HEK293T 细胞中。轻轻地轻敲盘子混合。孵育在37和 #176; C 为 24 h.
  7. 在24小时后替换媒体, 并将单元格保留为24小时.
  8. 通过大力移将细胞从板上移除, 并用 anti-mouse CD3 抗体 (2.5 和 #181; g/毫升) 对细胞进行染色, 以验证流式细胞术对嵌合 TCR 的表面表达.
  9. 为了比较被转染为类似水平的单元格之间的 CD3 表达式, 对表达类似高水平荧光报告分子的细胞进行分析 (GFP 为 CD3 复合体, 石为 TCR 表达载体)。优选地, 分析应该在 10 4 到 10 5 荧光强度 ( 图 3A ) 内的 GFP + 石 + 细胞上进行封闭.
    注: 在转嵌的细胞中的 CD3 表达水平应与控制鼠标 (原始模板) 矢量 ( 图 3A ) 相媲美。生成的 TCR 反转录病毒载体与先前描述的 4 中的 在体内 表达式系统兼容。

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Representative Results

在步骤 3.2.7 (图 2) 中, 通过在琼脂糖凝胶上5µL 第二反应的运行, 对多重嵌套 PCR 反应的效率进行了检查。平均 TCR-β放大率的效率预计在80% 左右, 而 TCR-α反应的效率通常较低, 约 50%4。只有配对的 TCR α和 TCR β链可以用于 TCR 表达;然而, 所有 PCR 产品都可以测序, 以获得 TCR 序列和剧目信息。

基因沉默只允许在一个给定的 T 细胞中表达单一的 TCR-β链。然而, t 细胞能够重新排列第二个 TCR α链, 约25% 的 t 细胞将表达第二帧 TCR-α链14。预计, 部分孤立的 TCR α链将是次级α, 而不是 "正确" 的α链。次级阿尔法链往往不是一个最佳的绑定伙伴与 TCR 贝塔链;因此, 预计并非所有克隆的 TCRs 将形成一个稳定的复杂和细胞表面表达。因此, 必须通过染 HEK293T 细胞 (图 3A) 确认正确的 TCR 链配对和细胞表面表达。

Figure 1
图 1.优化的多重巢式 PCR 和逆转录病毒构建从单 T 细胞。两轮 PCR 结果放大了相应的 TCR α和β链。嵌入到底漆中的限制站点允许在小鼠细胞中简化 sub-cloning 和生成人/鼠嵌合的载体。模板鼠标矢量可用于方便地为人类切换出可变的鼠标区域, 生成嵌合的人/小鼠 TCR 逆转录病毒载体, 与小鼠细胞中的表达兼容。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.单细胞 PCR 的例子.多重巢式 PCR 扩增 t 细胞受体β和α链从单一的人 t 细胞排序成一个96孔板。显示的是相应的 (顶部和底部) PCR 产品从单细胞放大 TCR β和 TCR α链从人类 PBMCs. NC-无模板控制, PC 阳性控制。通过在琼脂糖凝胶 (5 µL) 上运行反应的一小部分, 在 pcr 产物测序之前确认了单细胞α和β链 pcr 反应的效率.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.细胞表面嵌合 TCR 表达和特异性的验证.(a) HEK293T 细胞转染鼠 TCR 或人/鼠嵌合 TCR 与小鼠 CD3εγδζ。用 anti-mCD3ε抗体测定细胞表面 TCR 表达。门控策略: 首先, 对石和 GFP 双阳性细胞 (G2) 进行了分析。在单矢量控制的情况下, 浇口必须基于单荧光 (G1)。其次, 对 G1 和 G2 的细胞进行了 CD3ε表达水平的分析。(B) TCR 特异性通过聚丙烯 DRB1*0401:GAD115-127 聚丙烯的293T 细胞染色证实。分析在 GFP+Ametrine+CD3ε + 单元格上是封闭的, 如A中所示。请单击此处查看此图的较大版本.

靶基因 底漆方向 序列
反向转录
TRAC cDNA AGCTGGACCACAGCCG
TRBC1 cDNA GAAATCCTTTCTCTTGACCATG
TRBC2 cDNA GCCTCTGGAATCCTTTCTCT
TCR α PCR 反应1
TRAV1-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGCTTTCCTTCTCTATGTTT
TRAV1-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGTTTTCCTTCTTTATGTTTC
TRAV2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCTTTGCAGAGCACTCTGG
TRAV3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCCTCTGCACCCATCTCG
TRAV4 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAGGCAAGTGGCGAGAGTGATC
TRAV5 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTC
TRAV6 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTTT
TRAV7 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAGATGCGGAGACCTGTC
TRAV8-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGTTGCTCATACCAGTGC
TRAV8-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGCTGCTCGTCCC
TRAV8-3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGGAGCTTATCCCACTG
TRAV8-7 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCTTAGTGGTCATTCTGCTGCTT
TRAV9-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAATTCTTCTCCAGGACCAGCG
TRAV9-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAACTATTCTCCAGGCTTAGTATCTCTGATACTC
TRAV10 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTG
TRAV12-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCC
TRAV12-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCC
TRAV12-3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTG
TRAV13-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGACATCCATTCGAGCTGTATTTATATTCC
TRAV13-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCAGGCATTCGAGCTTTATTT
TRAV14 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTCACTTTCTAGCCTGCTGAAGGTG
TRAV16 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTG
td>TRAV17 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAAACTCTCCTGGGAGTGTCTTTG TRAV18 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTGTCTGCTTCCTGCTCAGG TRAV19 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAG TRAV20 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAAATGTTGGAGTGTGCATTC TRAV21 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACCCTCTTGGGCCTG TRAV22 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGAGGATATTGGGAGCTCTGCT TRAV23 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGACAAGATCTTAGGAGCATCATTTTTAG TRAV24 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCC TRAV25 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTACTCATCACATCAATGTTGGTCTTAT TRAV26-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAGGCTGGTGGCAAGAGTAACTG TRAV26-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGTTGGTGACAAGCATTACTGTACTCC TRAV27 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGTCCTGAAATTCTCCGTGTCC TRAV29 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCCATGCTCCTGGGGG TRAV30 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACTCTCCTGAAAGTGCTTTCAG TRAV34 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACTGTTCTGCAAGTACTCCTAGG TRAV35 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTTGAACATTTATTAATAATCTTGTGG TRAV36 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAGTGTCCACAGGCTTTACTAGC TRAV38-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGACACGAGTTAGCTTGCTGTGGG TRAV38-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCATGCCCTGGCTTCCT TRAV39 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGAAGCTACTAGCAATGATTCTGTGG TRAV40 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAACTCCTCTCTGGACTTTCTAATTCTGA TRAV41 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGTGAAGATCCGGCAATTTTTG TRAC 外部 反向 CAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAGTCTC TCRbeta PCR 反应1 TRBV2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGATACCTGGCTCGTATGCTGG TRBV3-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTGCAGGCTCCTCTG TRBV4-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTGCAGGCTGCTCTG TRBV5-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTT TRBV5-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCCGGGCTCC TRBV5-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCTGGGCTCCTCT TRBV5-8 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGACCCAGGCTCCTCTTCT TRBV6-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCATCGGGCTCCTGTGC TRBV6-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCCTCGGGCTCCTGTG TRBV6-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGAATCAGGCTCCTGTGCTGTG TRBV6-6 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCATCAGCCTCCTGTGCTG TRBV7-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACAAGGCTCCTCTGC TRBV7-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCCTCTTCT TRBV7-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCCTCTG TRBV7-6 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGTCTCCTATGCTG TRBV7-7 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTACCAGTCTCCTATGCTGGG TRBV7-9 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGCCTCCTCTG TRBV9 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCT TRBV10-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACGAGGCTCTTCTTCTATG TRBV10-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCTTCTTCTATG TRBV10-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACAAGGTTGTTCTTCTATGTG TRBV11-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCACCAGGCTTCTCTGCTG TRBV11-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTACCAGGCTCCTCTGCTG TRBV12-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACTCCTGGACCTTCTGCTGT TRBV12-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACTCCTGGACCCTCTGCTG TRBV12-5 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGCCACCAGGCTCCTCTG TRBV13 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTTAGTCCTGACCTGCCTGACTC TRBV14 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGT TRBV15 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTCCTGGGCTTCTCCACT TRBV16 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCCCAATATTCACCTGCATCA TRBV17d >提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGATATCTGGCTCCTCTGCTGG TRBV18 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACACCAGAGTACTCTGCTGTGC TRBV19 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTG TRBV20 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCT TRBV24-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGCCTCCCTGCTCTTCTTCTG TRBV25-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGACTATCAGGCTCCTCTGCTACATGG TRBV27 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCCCAGCTCCTTG TRBV28 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGAATCAGGCTCCTCTGTCG TRBV29-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTGAGTCTTCTGCTCCTTCTCCT TRBV30 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCT TRBC 外部 反向 GTGGCCAGGCACACCAGTGTG TCR α PCR 反应2 TRAC 内部 反向 CAGCTGGTACAccgcggGGTCAGGGTTCTG 柴维适配器 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATG TCR β PCR 反应2 TRBC 内部 反向 CTCTGCTTCTGATGGttcgaaCACAGCGACCTCGG TRBV 适配器 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATG 测序底漆 pMSCV 二 提出 CCTCCTCTTCCTCCATCCGCC TCRbeta 反向 GCCAAGCACACGAGGGTAGCC ires 反向 AACGCACACCGGCCTTATTCC * 小写字母在引物序列之内表明被合并的限制酵素切口站点

表 1:反转转录、PCR 和测序底漆.

步骤2。2 每井金额
rt-pcr 反应 (6μL) μ)
10x 缓冲器 0。6
2x dNTP 0.24
10% 海卫一 X 0.06
3 TCR 专用底漆 (10mM ea) 0.23 ea (x 3 = 0.69)
酶 0.18
核糖核酸抑制剂 0.28
NF (无核酸)-H2O 3.95
步骤3。1
PCR 反应 1 (25μL) μ) b PCR 反应 1 (25μL) μ)
5x 缓冲器 5 5x 缓冲器 5
dNTP (10mM) 1 dNTP (10mM) 1
砜 0.75 亚甲基亚砜 (3%) 0.75
游泳池 (F 底漆) (2.3μM) 0。3 b 池 (F 底漆) (2.3μM) 0。5
外置 R 底漆 (10uM) 0。6 b 外部 R 底漆 (10μM) 1
DNA 聚合酶 0。2 去 Taq 聚合酶 0。2
rt-pcr cDNA 2。5 rt-pcr cDNA 2。5
NF-H2O 14.65 NF-H2O 14.05
步骤3。8
PCR 反应 2-相同的 a 和 b (25μL) μ)
5x 缓冲器 5
dNTP (10mM) 1
砜 0.75
适配器 F 底漆 (10μM) 1
内 R 底漆 (10μM) 1
DNA 聚合酶 0。2
PCR rxn 1 产品 2。5
NF-H2O 13.55

表2。反转转录和 PCR 反应。

步骤4.2 和4。3
TRBV 消化反应 (50μL) μ) 纶向量文摘 (500μL) μ)
DNA (~ 20μg) DNA (~ 20μg)
MfeI 2 MfeI 20
BstbI 2 BstbI 20
10x 缓冲器 5 10x 缓冲器 50
H2O H2O
步骤4。4
CIP 反应 (100μL) μ) DNA (~ 1.5mg)
消化和 #38; 纯化的载体 DNA 84 10x 缓冲器 10 CIP 酶 6 步骤4。5 结扎反应 (20μL) μ) 消化/CIPed 载体 DNA (总插入量和矢量金额为 ~ 150 ng) 插入 DNA (6 摩尔接触矢量) 2x 连接缓冲器 10 连接酶 1 H2O 步骤4。9 试验文摘反应 (12μL) μ) DNA (100-300ng) 1 MfeI 0.25 BstbI 0.25 10x 缓冲器 1。2 H2O 9。3 步骤4.11 柴维消化反应 (60μL) μ) 含β-纶向量文摘 (120μL) DNA (~ 1.5μg) DNA (~ 3μg) SnaBI 3 MfeI 6 SacII 2 BstbI 4 10x 缓冲器 6 10x 缓冲器 10 H2O H2O

表3。矢量克隆反应。

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Discussion

在当前的协议中, 我们描述了一个有效的方法单细胞 TCR 放大和随后的 sub-cloning 配对 TCR α和β链成模板逆转录病毒表达载体。虽然, 已经开发了几个单细胞 PCR 协议, 到目前为止没有与直接 sub-cloning 兼容到表达载体。在大多数情况下, 包含高度可变的 CDR3 区域的部分序列被放大, 具有足够的序列来推断变量区域。这种较小的 pcr 产品尺寸支持更高的 pcr 效率, 但需要de 从头TCR 基因合成功能研究。当前的协议保持了以前发布的 CDR3-focused 单单元 TCR 测序协议的效率, 同时产生了一个更长的增, 包含适合于克隆的整个可变区域。因此, 所描述的系统在给出定量序列以及功能输出方面具有更大的灵活性。

根据所讨论的科学问题, 分析的 T 细胞的来源和特异性可能有所不同。但是, 如果项目的最终目标是对体内TCR 函数的分析, 则需要了解孤立 T 细胞的 HLA 限制。目前的协议已被专门设计为与在体内TCR 表达的 HLA-人性化小鼠。这些小鼠中有许多已产生, 现已商业化, 包括 HLA-A2.1、HLA-DQ8 (HLA-DQA1*301,HLA-DQB1*302)、HLA-DQ6 (DQA1*0102,HLADQB1*0602)、HLA-DR4 (DRB1*0401)、HLA-DR1 (DRA*0101、DRB1*0101)、HLA-A11 (A*11:01/K)、HLA-B2705、HLA-A24, HLA-B*0702 转基因菌株。此协议可以成功地与以前发布的协议相结合, 用于逆转录病毒介导的人类 TCRs 的骨髓干细胞表达4,15,16。我们预计, 人性化的 TCR retrogenic 系统将适用, 并非常有用的功能分析人类 TCRs 在各种自身免疫, 癌症, 和传染病模型。

目前的单细胞 PCR 协议描述的关键步骤, 并提出建议, 成功放大配对 TCR α和 TCR β序列。第一个关键步骤是及时的表现 cDNA 转录, 以及随后的第一轮多重 PCR。所有的步骤都应及时进行, 所有的试剂和细胞在冰上保存, 以防止 RNA 和 cDNA 的降解。其次, 由于该协议被设计为对模板的低级别高度敏感, 因此它非常容易受到污染。因此, 必须在无模板的区域内工作, 远离放大的 PCR 产物或 TCR 的载体克隆。应使用单独的房间或遮光罩来建立 cDNA 和 PCR 反应。第一个 pcr 反应的模板应添加在一个不同的地方, pcr 是建立。在单细胞 PCR 实验中, 宜采用一套单独的 aliquoted 试剂。

使用材料表中列出的试剂对该协议进行了专门的优化, 试剂中的任何替换都需要额外的优化。对抗原特异细胞的初步鉴定可以修改为使用多肽 MHC 体。聚丙烯染色允许同时评估抗原特异性以及 HLA 限制。在缺乏聚丙烯试剂的情况下, 可考虑检测抗原反应性的替代方法, 如早期活化标记的上调或炎症细胞因子的分泌。例如, 针对 T 细胞抗原和 IFNγ的双特异融合抗体可以与磁珠隔离结合, 以丰富抗原活性 IFNγ产生细胞。

虽然在我们的协议中描述的嵌合的人/鼠结构确保了与小鼠细胞的相容性, 但它与人类 CD3 复合体的相容程度尚不得而知。虽然没有经过我们的正式测试, 其他人已经表明, 嵌合体的 TCR 构造与小鼠恒定区域可以表达在人淋巴细胞的表面17。这表明小鼠 TCR 恒定区域可以支持与人类 CD3 信号复合体的相互作用。然而, 如果目标是表达人类原细胞或人类细胞系 (如对细胞) 中的识别 TCRs, 一个更理想的方法可能是使用一个完全人类的结构。这可以通过在向量与人类恒定区域之间交换小鼠恒定区域来完成。

如果确定的 TCR 变量区域包含用于克隆的限制站点之一, 则应将 TCR 插入到航天飞机载体中, 然后使用站点定向诱变试剂盒进行突变, 从而在限制范围内诱发无声的核苷酸变化剪切站点。另一种方法是de 从头合成的 TCR 变量区域被修改, 以排除不需要的限制站点。

这项技术的主要限制是无法消除次生 "胞质" α链的放大。TCR-α基因不像 TCR-β基因那样经过位排斥, 因此, 很大比例的 T 细胞将表达第二个 "细胞质" α链14。所描述的 PCR 协议只会导致一个 TCR α链的放大, 但是如果扩增的α链是 "细胞质" α链, 它可能不会与放大的 beta 链配对。因此, 在 HEK293T 细胞中检测 TCR 细胞表面表达, 以确保成功的链配对是势在必行的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究由 JDRF 1-2014-243-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 飞行员 PJ, 和罗伯特和珍妮丝捷基金会资助。

我们感谢桑德拉和 Andrene 麦当劳的耐心招聘, 塞缪尔. 布鲁姆为技术援助, Dr. 乔治 Makedonas 的礼物抗体和控制 DNA 用于 PCR 优化。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFSE  eBioscience  65-0850-84 5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421 Biolegend  317433 2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 Biolegend  317336 2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647 Biolegend  100322 2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU   VWR 97068-158 0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit  Invirtogen  4368814 9 U (RT enzyme) 
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL Invirtogen  AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U VWR PAM3008 1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate Phenix MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film  ThermoFisher  4306311
UltraPure Agarose  Invirtogen  15510-027
SnaBI New England Biolabs  R0130 15 U (insert) 30 U (vector)
SacII New England Biolabs  R0157 40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI New England Biolabs  R3589S 40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI New England Biolabs  R0519 40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP) New England Biolabs  M0290S 10 U
Quick ligase  New England Biolabs  M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems  Promega  A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems  Promega  A7640
DNA clean & concentrator-25 kit Genesee Scientific  11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit Genesee Scientific  11-306A
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells  ThermoFisher  18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) Mirus  MIR2300
BD FACS Aria II (sorter) BD
BD Fortessa (flow cytometer) BD 

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References

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免疫学 问题 127 t 细胞 t 细胞受体 TCR PCR 测序 逆转录病毒 单细胞 人,在体内,体外 TCR 表达
简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于<em>体外</em>和<em>体内</em>表达人类 TCRs
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