Summary

Упорядочение одноклеточного TCR изоляции и поколения ретровиральных векторов для In Vitro и In Vivo выражение человека TCRs

Published: September 10, 2017
doi:

Summary

Текущий протокол сочетает в себе одну ячейку в паре человека TCR альфа и бета-цепи последовательности с рационализированы поколения ретровиральных векторов совместим с in vitro и in vivo выражения TCR.

Abstract

Хотя, было разработано несколько методов для секвенирования парных Т-клеток рецепторов (TCR) альфа и бета-цепи от одного Т-клеток, никто до настоящего времени были способствуют вниз по течению в vivo функционального анализа гетеродимерами TCR. Мы разработали более протокол, основанный на двухэтапный мультиплекс вложенные PCR, что приводит к продукт PCR, который охватывает весь переменной регионах человека TCR альфа и бета-цепи. Выявляя места уникальные ограничения и включения их в праймеры PCR, мы сделали продукт PCR совместимы с прямым югу клонирования в шаблон антиретровирусные вектор. Результате антиретровирусного лечения конструкции кодирует химерных человека/мышь TCR с мыши Внутриклеточный домен, который функциональных клеток мыши или в в естественных условиях моделей мышей. В целом протокол, описанные здесь сочетает клеток человека одной паре TCR альфа и бета-цепи идентификации с обтекаемый поколения ретровиральных векторов, легко могут быть приспособлены для выражения TCR in vitro и in vivo . Видео и сопроводительные материалы призваны дать весьма подробное описание Одноячеистый PCR, таким образом, чтобы критические шаги можно избежать последовали и потенциальные ловушки. Кроме того мы предоставляем подробное описание клонирования шаги, необходимые для создания вектора выражения. Как только освоил, вся процедура от одной ячейки к TCR выражение сортировки может быть выполнена в течение короткого периода продолжительностью две недели.

Introduction

Т-клеточных рецепторов (TCR) диктует решение судьбы Т-клеток во время разработки, установившемся/гомеостаза и антигенной стимуляции в периферии1,2,3. Недавнее расширение глубоких технологий виртуализации обнаружила ранее underappreciated TCR разнообразия в антиген Т-клеток конкретных ответов. TCR разнообразия предполагает потенциал для функционально широкий Т-клеток ответов. Для того, чтобы интегрировать анализ репертуар последовательности TCR с TCR функциональных анализов, последовательности подходов должны быть призваны быть совместимы с экспериментальных систем и в естественных условиях модели используются для последующего функционального анализа выберите TCRs. Мы разработали эффективный подход для человека TCR последовательности изоляцию и рационализированы югу клонирования в совместимы с TCR выражение HLA-очеловеченное мышей4вектор TCR шаблон химерных человека и мыши. Изоляции соответствующего альфа и бета-цепи гетеродимерная TCRs требует амплификации PCR обеих цепей из одной клетки. Хотя, несколько одноклеточных TCR клонирования протоколы были разработаны и использованы, никто до настоящего времени были легко совместим с высокой пропускной способностью обтекаемый прямого клонирования неизвестных Vα/Vβ TCRs в ретровиральных векторов необходимых для повторного выражения в естественных условиях 4,5,6,7. Предыдущие исследования использовали два основных подхода, либо выборочно дополнить ограниченную часть TCR, достаточных для экстраполяции последовательность, или усилить весь TCR последовательности4,5,6 , 7. ниже по течению функционального анализа последовательностей TCR, полученные через первый подход требует дорогостоящих в silico Ассамблеи и de novo строительство TCR. В то время как второй подход обеспечивает полную последовательность TCR, регионе человека постоянно не совместим с в vivo выражение клонированного TCRs в моделях мыши. Наш подход разработан специально для совместимости с в vivo функционального анализа TCRs в моделях мыши. Мы разработали эффективный и рациональный Одноячеистый PCR протокол, который позволяет для прямого югу клонирования PCR фрагментов в векторные выражения шаблона.

Наш подход использует весьма чувствительной реакции PCR мультиплекс вложенных, которая выполняется в два этапа. В первый мультиплекс реакции шаг бассейн 40 праймеров для всех V-бета-цепи и бассейн 44 праймеров для все, что V-альфа-цепи используются для усиления TCR альфа или бета-TCR без предварительного знания о последовательности (Таблица 1). Форвард грунт имеет адаптер последовательность, которая включена в 5′ продукта PCR. Обратный грунт на основе постоянной региона TCR. Мы определили места уникальные ограничения, которые отсутствуют от человека переменной или перекрестка TCR регионов и включили их в обновленным TCRα и TCRβ грунты (рис. 1). В втором вложенных реакции грунт, определенных для адаптера последовательности и вложенного обратного грунт в регионе постоянно используются для дальнейшего усиления TCR цепи с повышенной точностью (Таблица 1, рис. 1). После изоляции одной ячейки, два раунда ПЦР (первая реакция с бассейном праймеров Vα и Vβ и второй с праймерами адаптер) результат ПЦР продукта, который может быть непосредственно югу клонирован в шаблон антиретровирусные вектор. Окончательный TCR конструкция будет кодировать в одном открытом чтения рамке (ORF), человека переменной регионах, в сочетании с постоянной регионов мыши соединены «самостоятельно расщепления» последовательности белка, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A последовательность была использована в нескольких системах и были тщательно протестированы специально для выражения TCRs8,9,10,11. Хотя, после перевода, придает большую часть останков P2A последовательности C-конечная альфа-цепи соединены гибкими компоновщик, в то время как последовательность сигнала цепи бета-версия имеет дополнительные пролина, эта модификация не пагубно влияет на функции TCR. Регионе постоянный мыши используется в конструкции вместо человека во избежание потенциальных изменены взаимодействий с сигнальных компонентов нисходящего потока при вновь выразил в клетки мыши. Один ORF приведет к стехиометрическим отдельные выражения альфа и бета-цепи9,11. Текущий протокол основан на реагенты и подходы, которые широко доступны и призвана осуществляться на рациональной и эффективной основе. Хотя специально для анализа TCRs от самореактивных Т-клеток, причастны аутоиммунный диабет мы использовали этот метод, мы ожидаем, что этот протокол может быть широко применяется для идентификации и функциональной оценки человеческого TCRs для аутоиммунная epitopes, рака эпитопов или ответы на патогенные микроорганизмы и вакцин.

Protocol

1. определять популяции клеток T интерес. Примечание: антигена конкретных распространения в сочетании с красителем деление клеток (например, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира, CFSE) могут использоваться для изоляции Т-клеток, основанный на их распространение в ответ на ант…

Representative Results

Эффективность реакции PCR мультиплекс вложенные проверяется на шаге 3.2.7 (рис. 2), запустив из 5мкл второй реакции на геле агарозы. В среднем эффективность усиления TCR-бета, как ожидается, составит около 80%, в то время как эффективность реакции TCR альфа обычно…

Discussion

В текущем протоколе мы описываем эффективный метод для одной ячейки TCR амплификации и последующей югу клонирования парных TCR альфа и бета-цепи в шаблон антиретровирусные выражение вектор. Хотя, были разработаны несколько Одноячеистый PCR протоколы, никто до настоящего времени были совм?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование финансировалось JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, Ада 7-14-JF-07, низ 5 Р30 DK079638-05 пилот PJ и Роберт и Дженис McNair фонда.

Мы благодарим Сандра пена и Andrene Макдональд за пациента вербовки, Самуэль Blum для оказания технической помощи, д-р Джордж Makedonas за дар антител и управления для оптимизации ПЦР ДНК.

Materials

CFSE  eBioscience  65-0850-84 5 μM
anti-human CD4 (OKT4) BV421 Biolegend  317433 2 μg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 Biolegend  317336 2 μg/mL
anti-mouse CD3 AF647 Biolegend  100322 2.5 μg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU   VWR 97068-158 0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit  Invirtogen  4368814 9 U (RT enzyme) 
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL Invirtogen  AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U VWR PAM3008 1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate Phenix MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film  ThermoFisher  4306311
UltraPure Agarose  Invirtogen  15510-027
SnaBI New England Biolabs  R0130 15 U (insert) 30 U (vector)
SacII New England Biolabs  R0157 40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI New England Biolabs  R3589S 40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI New England Biolabs  R0519 40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP) New England Biolabs  M0290S 10 U
Quick ligase  New England Biolabs  M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems  Promega  A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems  Promega  A7640
DNA clean & concentrator-25 kit Genesee Scientific  11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit Genesee Scientific  11-306A
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells  ThermoFisher  18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) Mirus  MIR2300
BD FACS Aria II (sorter) BD
BD Fortessa (flow cytometer) BD 

References

  1. Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
  2. Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
  3. Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
  4. Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
  5. Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
  6. Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
  7. Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
  8. Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
  9. Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
  10. Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
  11. Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
  12. Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
  13. James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
  14. Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
  15. Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
  16. Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
  17. Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).

Play Video

Cite This Article
Sprouse, M. L., Blahnik, G., Lee, T., Tully, N., Benarjee, P., James, E. A., Redondo, M. J., Bettini, M. L., Bettini, M. Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs. J. Vis. Exp. (127), e55379, doi:10.3791/55379 (2017).

View Video