Упорядочение одноклеточного TCR изоляции и поколения ретровиральных векторов для In Vitro и In Vivo выражение человека TCRs
Summary
Текущий протокол сочетает в себе одну ячейку в паре человека TCR альфа и бета-цепи последовательности с рационализированы поколения ретровиральных векторов совместим с in vitro и in vivo выражения TCR.
Abstract
Хотя, было разработано несколько методов для секвенирования парных Т-клеток рецепторов (TCR) альфа и бета-цепи от одного Т-клеток, никто до настоящего времени были способствуют вниз по течению в vivo функционального анализа гетеродимерами TCR. Мы разработали более протокол, основанный на двухэтапный мультиплекс вложенные PCR, что приводит к продукт PCR, который охватывает весь переменной регионах человека TCR альфа и бета-цепи. Выявляя места уникальные ограничения и включения их в праймеры PCR, мы сделали продукт PCR совместимы с прямым югу клонирования в шаблон антиретровирусные вектор. Результате антиретровирусного лечения конструкции кодирует химерных человека/мышь TCR с мыши Внутриклеточный домен, который функциональных клеток мыши или в в естественных условиях моделей мышей. В целом протокол, описанные здесь сочетает клеток человека одной паре TCR альфа и бета-цепи идентификации с обтекаемый поколения ретровиральных векторов, легко могут быть приспособлены для выражения TCR in vitro и in vivo . Видео и сопроводительные материалы призваны дать весьма подробное описание Одноячеистый PCR, таким образом, чтобы критические шаги можно избежать последовали и потенциальные ловушки. Кроме того мы предоставляем подробное описание клонирования шаги, необходимые для создания вектора выражения. Как только освоил, вся процедура от одной ячейки к TCR выражение сортировки может быть выполнена в течение короткого периода продолжительностью две недели.
Introduction
Т-клеточных рецепторов (TCR) диктует решение судьбы Т-клеток во время разработки, установившемся/гомеостаза и антигенной стимуляции в периферии1,2,3. Недавнее расширение глубоких технологий виртуализации обнаружила ранее underappreciated TCR разнообразия в антиген Т-клеток конкретных ответов. TCR разнообразия предполагает потенциал для функционально широкий Т-клеток ответов. Для того, чтобы интегрировать анализ репертуар последовательности TCR с TCR функциональных анализов, последовательности подходов должны быть призваны быть совместимы с экспериментальных систем и в естественных условиях модели используются для последующего функционального анализа выберите TCRs. Мы разработали эффективный подход для человека TCR последовательности изоляцию и рационализированы югу клонирования в совместимы с TCR выражение HLA-очеловеченное мышей4вектор TCR шаблон химерных человека и мыши. Изоляции соответствующего альфа и бета-цепи гетеродимерная TCRs требует амплификации PCR обеих цепей из одной клетки. Хотя, несколько одноклеточных TCR клонирования протоколы были разработаны и использованы, никто до настоящего времени были легко совместим с высокой пропускной способностью обтекаемый прямого клонирования неизвестных Vα/Vβ TCRs в ретровиральных векторов необходимых для повторного выражения в естественных условиях 4,5,6,7. Предыдущие исследования использовали два основных подхода, либо выборочно дополнить ограниченную часть TCR, достаточных для экстраполяции последовательность, или усилить весь TCR последовательности4,5,6 , 7. ниже по течению функционального анализа последовательностей TCR, полученные через первый подход требует дорогостоящих в silico Ассамблеи и de novo строительство TCR. В то время как второй подход обеспечивает полную последовательность TCR, регионе человека постоянно не совместим с в vivo выражение клонированного TCRs в моделях мыши. Наш подход разработан специально для совместимости с в vivo функционального анализа TCRs в моделях мыши. Мы разработали эффективный и рациональный Одноячеистый PCR протокол, который позволяет для прямого югу клонирования PCR фрагментов в векторные выражения шаблона.
Наш подход использует весьма чувствительной реакции PCR мультиплекс вложенных, которая выполняется в два этапа. В первый мультиплекс реакции шаг бассейн 40 праймеров для всех V-бета-цепи и бассейн 44 праймеров для все, что V-альфа-цепи используются для усиления TCR альфа или бета-TCR без предварительного знания о последовательности (Таблица 1). Форвард грунт имеет адаптер последовательность, которая включена в 5′ продукта PCR. Обратный грунт на основе постоянной региона TCR. Мы определили места уникальные ограничения, которые отсутствуют от человека переменной или перекрестка TCR регионов и включили их в обновленным TCRα и TCRβ грунты (рис. 1). В втором вложенных реакции грунт, определенных для адаптера последовательности и вложенного обратного грунт в регионе постоянно используются для дальнейшего усиления TCR цепи с повышенной точностью (Таблица 1, рис. 1). После изоляции одной ячейки, два раунда ПЦР (первая реакция с бассейном праймеров Vα и Vβ и второй с праймерами адаптер) результат ПЦР продукта, который может быть непосредственно югу клонирован в шаблон антиретровирусные вектор. Окончательный TCR конструкция будет кодировать в одном открытом чтения рамке (ORF), человека переменной регионах, в сочетании с постоянной регионов мыши соединены «самостоятельно расщепления» последовательности белка, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A последовательность была использована в нескольких системах и были тщательно протестированы специально для выражения TCRs8,9,10,11. Хотя, после перевода, придает большую часть останков P2A последовательности C-конечная альфа-цепи соединены гибкими компоновщик, в то время как последовательность сигнала цепи бета-версия имеет дополнительные пролина, эта модификация не пагубно влияет на функции TCR. Регионе постоянный мыши используется в конструкции вместо человека во избежание потенциальных изменены взаимодействий с сигнальных компонентов нисходящего потока при вновь выразил в клетки мыши. Один ORF приведет к стехиометрическим отдельные выражения альфа и бета-цепи9,11. Текущий протокол основан на реагенты и подходы, которые широко доступны и призвана осуществляться на рациональной и эффективной основе. Хотя специально для анализа TCRs от самореактивных Т-клеток, причастны аутоиммунный диабет мы использовали этот метод, мы ожидаем, что этот протокол может быть широко применяется для идентификации и функциональной оценки человеческого TCRs для аутоиммунная epitopes, рака эпитопов или ответы на патогенные микроорганизмы и вакцин.
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущем протоколе мы описываем эффективный метод для одной ячейки TCR амплификации и последующей югу клонирования парных TCR альфа и бета-цепи в шаблон антиретровирусные выражение вектор. Хотя, были разработаны несколько Одноячеистый PCR протоколы, никто до настоящего времени были совм?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, Ада 7-14-JF-07, низ 5 Р30 DK079638-05 пилот PJ и Роберт и Дженис McNair фонда.
Мы благодарим Сандра пена и Andrene Макдональд за пациента вербовки, Самуэль Blum для оказания технической помощи, д-р Джордж Makedonas за дар антител и управления для оптимизации ПЦР ДНК.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
