Strømlinjeformet enkeltcelle TCR isolasjon og generasjon Retroviral vektorer for In Vitro og i Vivo uttrykk for menneskelige TCRs
Summary
Det gjeldende protokoll kombinerer enkeltcelle sammen menneskelige TCR alfa og beta kjede sekvensering med strømlinjeformet generasjon retroviral vektorer kompatibel med i vitro og vivo TCR uttrykk.
Abstract
Selv om flere metoder for sekvensering av parvise T-celle reseptor (TCR) alfa og beta kjettinger fra enkelt T-celler er utviklet, har ingen så langt vært bidrar til nedstrøms i vivo funksjonell analyse av TCR heterodimerer. Vi har utviklet en forbedret protokoll basert på en to-trinns multiplex-nestede PCR, som resulterer i et PCR-produkt som spenner over hele variabel regioner av en menneskelig TCR alfa og beta kjeder. Ved å identifisere unike begrensning nettsteder og innlemme dem i PCR primere, har vi gjort PCR produktet kompatibel med direct sub kloning i malen retroviral vektoren. Den resulterende retroviral konstruere koder en chimeric menneskelige/mus TCR med et mus intracellulær domene, som fungerer i musen celler eller i vivo musen modeller. Samlet kombinerer protokollen beskrevet her menneskelig enkeltcelle sammen TCR alfa og beta kjede identifikasjon med strømlinjeformet generasjon retroviral vektorer lett tilpasses i vitro og vivo TCR uttrykk. Videoen og det medfølgende materialet er utformet for å gi en svært detaljert beskrivelse av enkeltcelle PCR, slik at kritiske trinnene blir fulgt og potensielle fallgruver unngått. I tillegg gir vi en detaljert beskrivelse av kloning trinnene nødvendig å generere uttrykk vektoren. Når mestret, kan hele prosedyren fra enkelt celle sortering TCR uttrykket utføres i en kort to-ukers periode.
Introduction
T-celle reseptor (TCR) tilsier T celle skjebne beslutning under utvikling, steady state/homeostase og antigen stimulering i periferien1,2,3. Siste utvidelsen av dype sekvensering teknologi har avdekket en tidligere underappreciated TCR mangfold i antigen-spesifikke T celle svar. TCR mangfold antyder et potensial for funksjonelt bred T celle svar. For å integrere TCR sekvens repertoar analysen med TCR funksjonelle analyser, bør sekvensering tilnærminger være utformet å være kompatibel med eksperimentelle systemer og i vivo modeller benyttet for påfølgende funksjonell analyse av velger TCRs. Vi har utviklet en effektiv fremgangsmåte for menneskelig TCR sekvens isolasjon og strømlinjeformet sub kloning i en chimeric menneskelige/mus TCR mal vektor kompatibel med TCR uttrykk i HLA-humanized mus4. Isolasjon av tilsvarende alfa og beta kjeder av heterodimeric TCRs krever PCR forsterkning av både kjeder fra én enkelt celle. Selv om flere encellede TCR kloning protokoller har vært utviklet og benyttet, har ingen så langt vært lett kompatibel med høy gjennomstrømming strømlinjeformet direkte kloning av ukjent Vα/Vβ TCRs i retroviral vektorer nødvendig for re uttrykket i vivo 4,5,6,7. Tidligere studier har benyttet to store tilnærminger, enten å selektivt forsterke en begrenset del av TCR tilstrekkelig å ekstrapolere sekvensen, eller å forsterke det hele TCR sekvens4,5,6 , 7. nedstrøms funksjonell analyse av TCR sekvenser Hentet via første tilnærmingen krever kostbar i sili montering og de novo byggingen av TCR. Mens den andre tilnærmingen gir komplett TCR sekvensen, er menneskelige konstant regionen ikke kompatibel med i vivo uttrykk for de klonede TCRs musen modeller. Vår tilnærming er spesielt designet for å være kompatibel med i vivo funksjonell analyse av TCRs musen modeller. Vi utviklet en effektiv og strømlinjeformet enkeltcelle PCR-protokoll som tillater direkte sub kloning av PCR i malen uttrykk vektor.
Vår tilnærming benytter en svært følsom multiplex-nestede PCR reaksjon som utføres i to trinn. I den første multiplex reaksjonen trinn en pool av 40 primere gjelder alle V-beta kjedene og en pool av 44 primere bestemt for alle V-alfa kjedene brukes til å forsterke TCR-alpha- eller TCR-beta uten forutgående kunnskap om sekvensen (tabell 1). Fremover Primeren har en adapter-rekkefølge, som er innlemmet i den 5′ PCR produktet. Omvendt primer er basert på konstant regionen TCR. Vi har identifisert unik begrensning områder som er borte fra menneskelige variabel eller krysset TCR regioner og innarbeidet dette i nydesignede TCRα og TCRβ primere (figur 1). I den andre nestede reaksjonen brukes en primer spesifikke for adapter sekvensen og en nestet omvendt primer i konstant regionen til å ytterligere forsterke TCR kjeder med økt spesifisitet (tabell 1, figur 1). Etter enkeltcelle isolasjon, to runder med PCR (første reaksjon med en pool av både Vα og Vβ primere, og andre med adapter primere) resultere i et PCR-produkt som kan være direkte sub klonet i malen retroviral vektoren. Den endelige TCR konstruere kan kode, i en enkelt åpent lesing ramme (ORF), menneskelige variabel regioner kombinert med musen konstant regioner forbundet med ‘selv cleaving’ protein sekvensen, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. Den P2A sekvensen er brukt i flere systemer, og er blitt omfattende testet for uttrykket TCRs8,9,10,11. Selv etter oversettelse mesteparten av P2A rekkefølge restene knyttet til C-terminus av alpha kjeden koblet av et fleksibelt linker, mens beta kjeden signal sekvensen har en ekstra proline, denne endringen påvirker ikke skadelig TCR funksjon. Musen konstant regionen brukes i konstruksjonen i stedet for menneskelig for å unngå potensielle endret interaksjon med nedstrøms signalnettverk komponenter når nytt uttrykt i musen celler. Den eneste ORF vil føre stoichiometric separat uttrykk i alfa og beta kjeder9,11. Gjeldende protokollen er basert på reagenser og tilnærminger som er allment tilgjengelig, og er utformet som skal utføres i en strømlinjeformet og effektiv måte. Selv om vi har spesielt brukt denne teknikken til analysen TCRs fra self-reactive T celler innblandet i autoimmune diabetes, forventer vi at denne protokollen kan være allment gjeldende for identifikasjon og funksjonelle vurdering av menneskelig TCRs spesifikke for autoimmune epitopes, kreft epitopes eller svar til patogener og vaksiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I den gjeldende protokollen beskriver vi en effektiv metode for enkelt celle TCR forsterkning og påfølgende sub kloning av sammenkoblede TCR alfa og beta kjeder i en mal retroviral uttrykk vektor. Selv om flere enkeltcelle PCR protokoller er utviklet, har ingen så langt vært kompatibel med umiddelbar sub kloning i et uttrykk vektor. I de fleste tilfeller, er en delvis sekvens omfatter den svært variabel CDR3 områder forsterket, med nok orden å ekstrapolere variable regionen. Denne mindre PCR produktet størrelse s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, og The Robert og Janice McNair Foundation.
Vi takker Sandra Pena og Andrene McDonald for pasient rekruttering, Samuel Blum for teknisk assistanse, Dr. George Makedonas for gave antistoffer og kontroll DNA brukes for PCR optimalisering.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
