Strömlinjeformad enda Cell TCR isolering och generering av retrovirala vektorer för In Vitro och In Vivo uttryck för mänskliga TCRs
Summary
De nuvarande protokollet kombinerar enda cell ihop mänskliga TCR alfa och beta kedja sekvensering med strömlinjeformad generation av retrovirala vektorer kompatibel med in vitro- och in-vivo TCR uttryck.
Abstract
Även om flera metoder för sekvensering av Parade T-cell receptor (TCR) alfa och beta kedjor från enstaka T celler har utvecklats, har ingen hittills varit bidrar till nedströms i vivo funktionell analys av TCR heterodimerer. Vi har utvecklat ett förbättrat protokoll baserat på en två-stegs multiplex-kapslad PCR, vilket resulterar i en PCR produkt som sträcker sig över hela variabla regioner av en mänsklig TCR alfa och beta kedjor. Genom att identifiera unika begränsning platser och införliva dem i PCR primers, har vi gjort PCR-produkten kompatibel med direkt sub kloning i den mallen retrovirala vektorn. Den resulterande retrovirala bygga kodar en chimär mänskliga/mus TCR med en mus intracellulära domän, som är funktionella i mus celler eller i vivo musmodeller. Sammantaget kombinerar i protokollet som beskrivs här människors enda cell ihopkopplade TCR alfa och beta kedja identifiering med strömlinjeformad generation retrovirala vektorer lätt anpassningsbar för in vitro- och in-vivo TCR uttryck. Videon och det åtföljande materialet är utformade för att ge en mycket detaljerad beskrivning av den enda cellen PCR, så att de kritiska steg kan följas och potentiella fallgropar undvikas. Dessutom ger vi en detaljerad beskrivning av kloning stegen som krävs för att generera uttryck vektorn. När behärskar, kunde hela förfarandet från enda cell sortering till TCR uttryck utföras i en kort två-veckors period.
Introduction
T-cell receptorn (TCR) dikterar T cells öde beslut under utveckling, steady-state/homeostas och antigen stimulering i periferin1,2,3. Senaste utbyggnaden av djupa sekvensering teknik har avslöjat en tidigare underskattad TCR mångfald inom antigen specifika T-cell svar. TCR mångfald tyder på en potential för funktionellt breda T-cell svar. För att integrera TCR sekvens repertoar analysen med TCR funktionella analyser, bör sekvensering metoder utformas för att vara kompatibel med experimentella system och i vivo modeller utnyttjas för efterföljande funktionell analys av Välj TCRs. Vi har utvecklat en effektiv strategi för mänskliga TCR sekvens isolering och strömlinjeformad sub kloning i en chimär mänskliga/mus TCR mall vektor kompatibel med TCR uttryck i HLA-humaniserad möss4. Isolering av motsvarande alfa och beta kedjor av heterodimeriskt TCRs kräver PCR-amplifiering av båda kedjor från en enda cell. Även om flera encelliga TCR kloning protokoll har utvecklats och utnyttjas, har ingen hittills varit enkelt kompatibelt med hög genomströmning strömlinjeformad direkt kloning av okänd Vα/Vβ TCRs in retrovirala vektorer nödvändigt för nytt uttryck i vivo 4,5,6,7. Tidigare studier har använt två huvudinriktningar, antingen att selektivt förstärka en begränsad del av TCR tillräckligt att extrapolera sekvensen eller att förstärka hela TCR sekvens4,5,6 , 7. nedströms funktionell analys av TCR sekvenser erhålls via det första synsättet kräver kostsamma i silico församlingen och de novo byggandet av TCR. Medan det andra synsättet ger komplett TCR sekvensen, är mänsklig konstant regionen inte kompatibel med i vivo uttryck för de klonade TCRs i musmodeller. Vårt förhållningssätt är särskilt utformade för att vara kompatibel med i vivo funktionell analys av TCRs i musmodeller. Vi utvecklat en effektiv och strömlinjeformad enda cell PCR-protokoll som möjliggör direkt sub kloning av PCR-fragmenten i mallen uttryck vektorn.
Vår strategi använder tredjeparts en mycket känslig multiplex-kapslad PCR-reaktion som utförs i två steg. I den första multiplex reaktionen kliver en pool av 40 primers specifika för alla V-beta kedjor och en pool av 44 primers specifika för alla V-alpha kedjorna används för att förstärka den TCR-alpha eller TCR-beta utan kunskapen om sekvensen (tabell 1). Framåt primern har en adapter sekvens, som är införlivad i 5′ av PCR-produkten. Reverse primer är baserad på den konstant regionen av TCR. Vi har identifierat unik begränsning webbplatser som är frånvarande från mänskliga variabel eller korsningen TCR regioner, och införlivat dessa i nydesignade TCRα och TCRβ primers (figur 1). I den andra kapslade reaktionen används en primer som är specifik för den adapter sekvensen och kapslade reverse primer inom regionen konstant att ytterligare förstärka TCR kedjorna med ökad specificitet (tabell 1, figur 1). Efter enstaka cell isolering, två rundor av PCR (första reaktion med en pool av både Vα och Vβ primers, dels med adapter grundfärger) resultera i en PCR produkt som kan klonas direkt sub in mallen retrovirala vektorn. Den slutliga TCR-konstruktionen kommer att koda, i en enda öppen behandling ram (ORF), mänskliga variabla regioner kombinerat med musen konstanta regioner ansluten av en ‘själv proteinspjälkande’ proteinsekvens, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8. P2A sekvensen har använts i flera system och har testats specifikt för uttrycket av TCRs8,9,10,11. Även om, efter översättning som de flesta av P2A sekvens förblir kopplad till C-terminus av alfakedjan ansluten av en flexibel länkare, medan beta kedja signal sekvensen har en ytterligare prolin, denna ändring har ingen negativ effekt på TCR funktion. Mus konstant regionen används i konstruktionen istället för mänskliga för att undvika potentiella förändrad interaktioner med nedströms signalering komponenter när re uttryckt i mus celler. Den enda ORF leder stökiometriska separat uttryck för alpha och beta kedjor9,11. Det nuvarande protokollet baseras på reagenser och metoder som är allmänt tillgängliga och är avsedd att utföras på ett rationellt och effektivt sätt. Även om vi har specifikt används denna teknik till assay TCRs från självreaktiva T-celler inblandade i autoimmun diabetes, räknar vi med att detta protokoll kan vara allmänt tillämpliga för identifiering och funktionell bedömning av mänskliga TCRs specifika för autoimmuna epitoper, cancer epitoper eller Svaren till patogener och vacciner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det nuvarande protokollet beskriver vi en effektiv metod för enstaka cell TCR amplifiering och efterföljande sub kloning av Parade TCR alfa och beta kedjor i en mall retrovirala uttryck vektor. Även om flera enstaka cell PCR-protokoll har utvecklats, ha ingen hittills varit förenligt med omedelbar sub kloning i ett uttryck vektor. I de flesta fall förstärks delsekvens omfattar de mycket varierande CDR3 regionerna, med tillräckligt sekvens att extrapolera variabla regionen. Denna mindre PCR-Produktstorlek stöder…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats av JDRF 1-FAC-2014-243-A-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 PILOT PJ, och The Robert och Janice McNair Foundation.
Vi tackar Sandra Pena och Andrene McDonald för patient rekrytering, Samuel Blum för tekniskt bistånd, Dr. George Makedonas för gåvan av antikroppar och kontroll DNA som används för PCR-optimering.
Materials
| CFSE | eBioscience | 65-0850-84 | 5 μM |
| anti-human CD4 (OKT4) BV421 | Biolegend | 317433 | 2 μg/mL |
| anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 317336 | 2 μg/mL |
| anti-mouse CD3 AF647 | Biolegend | 100322 | 2.5 μg/mL |
| Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU | VWR | 97068-158 | 0.7 U |
| Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit | Invirtogen | 4368814 | 9 U (RT enzyme) |
| NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL | Invirtogen | AM9932 | |
| Gotaq DNA polymerase 2500U | VWR | PAM3008 | 1 U |
| 96 Well Half Skirt PCR Plate | Phenix | MPX-96M2 | |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | ThermoFisher | 4306311 | |
| UltraPure Agarose | Invirtogen | 15510-027 | |
| SnaBI | New England Biolabs | R0130 | 15 U (insert) 30 U (vector) |
| SacII | New England Biolabs | R0157 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| MfeI | New England Biolabs | R3589S | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| BstBI | New England Biolabs | R0519 | 40 U (insert) 80 U (vector) |
| Calf Intestinal Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | 10 U |
| Quick ligase | New England Biolabs | M2200S | |
| Wizard Plus minipreps DNA purification systems | Promega | A1460 | |
| Wizard Plus midipreps DNA purification systems | Promega | A7640 | |
| DNA clean & concentrator-25 kit | Genesee Scientific | 11-304C | |
| ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit | Genesee Scientific | 11-306A | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells | ThermoFisher | 18265017 | |
| Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) | Mirus | MIR2300 | |
| BD FACS Aria II (sorter) | BD | ||
| BD Fortessa (flow cytometer) | BD |
References
- Germain, R. N. T-cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol. 2 (5), 309-322 (2002).
- Singer, A., Adoro, S., Park, J. H. Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice. Nat Rev Immunol. 8 (10), 788-801 (2008).
- Tubo, N. J., et al. Single naive CD4+ T cells from a diverse repertoire produce different effector cell types during infection. Cell. 153 (4), 785-796 (2013).
- Sprouse, M. L., et al. Rapid identification and expression of human TCRs in retrogenic mice. J Immunol Methods. , (2016).
- Lennon, G. P., et al. T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a tightly regulated, cell-autonomous event. Immunity. 31 (4), 643-653 (2009).
- Dash, P., et al. Paired analysis of TCRalpha and TCRbeta chains at the single-cell level in mice. J Clin Invest. 121 (1), 288-295 (2011).
- Kobayashi, E., et al. A new cloning and expression system yields and validates TCRs from blood lymphocytes of patients with cancer within 10 days. Nat Med. 19 (11), 1542-1546 (2013).
- Szymczak, A. L., et al. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single ‘self-cleaving’ 2A peptide-based retroviral vector. Nat Biotechnol. 22 (5), 589-594 (2004).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. T-cell receptor retrogenic mice: a rapid, flexible alternative to T-cell receptor transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3 (3), 191-197 (2006).
- Mannering, S. I., et al. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J Immunol Methods. 283 (1-2), 173-183 (2003).
- James, E. A., LaFond, R., Durinovic-Bello, I., Kwok, W. Visualizing antigen specific CD4+ T cells using MHC class II tetramers. J Vis Exp. (25), (2009).
- Corthay, A., Nandakumar, K. S., Holmdahl, R. Evaluation of the percentage of peripheral T cells with two different T cell receptor alpha-chains and of their potential role in autoimmunity. J Autoimmun. 16 (4), 423-429 (2001).
- Lee, T., Shevchenko, I., Sprouse, M. L., Bettini, M., Bettini, M. L. Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice. J Vis Exp. (113), (2016).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8 (10), 1837-1840 (2013).
- Cohen, C. J., Zhao, Y., Zheng, Z., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. Enhanced antitumor activity of murine-human hybrid T-cell receptor (TCR) in human lymphocytes is associated with improved pairing and TCR/CD3 stability. Cancer Res. 66 (17), 8878-8886 (2006).
