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Immunology and Infection

简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于体外体内表达人类 TCRs

doi: 10.3791/55379 Published: September 10, 2017

Summary

当前的协议结合了单细胞配对人类 TCR α和β链测序与与体外体内TCR 表达相兼容的反转录病毒载体的生成。

Abstract

虽然, 有几种方法的排序的配对 t 细胞受体 (TCR) α和β链从单一 t 细胞已经开发, 迄今没有有利于下游体内功能分析的 TCR heterodimers。我们已经开发了一个改进的协议的基础上 two-step 多重嵌套 pcr, 这导致一个 pcr 产品横跨整个可变区域的人类 TCR α和β链。通过确定独特的限制点, 并将它们纳入 pcr 引物, 我们已经使 pcr 产品与直接 sub-cloning 与模板逆转录病毒载体相兼容。由此产生的逆转录病毒构建编码一个嵌合的人/鼠 TCR 与鼠标的细胞内域, 这是功能在鼠标细胞或在体内鼠标模型。总的来说, 这里描述的协议结合了人类单细胞配对 TCR α和β链识别与简化的逆转录病毒载体易于适应体外体内TCR 表达。视频和伴随的材料被设计为对单细胞 PCR 的高度详细的描述, 因此关键的步可以被跟随和潜在的陷阱避免。此外, 我们还提供了生成表达载体所需的克隆步骤的详细描述。一旦掌握, 从单细胞排序到 TCR 表达的整个过程可以在短短的两周内完成。

Introduction

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t 细胞受体 (TCR) 指示 t 细胞命运决定在发展期间, 稳态/稳态, 和抗原刺激的外围1,2,3。最近的深度测序技术的扩展揭示了先前未被低估的抗原特异 T 细胞反应中的 TCR 多样性。TCR 多样性表明了功能广泛的 T 细胞反应的潜力。为了将 TCR 序列剧目分析与 TCR 功能分析相结合, 测序方法应设计为与实验系统兼容, 并用于后续的功能性研究的体内模型。TCRs我们已经开发了一个有效的方法, 人类 TCR 序列隔离和简化 sub-cloning 成嵌合体的人/小鼠 TCR 模板载体与 TCR 表达的 HLA-人性化的老鼠4。heterodimeric TCRs 的相应α和β链的分离需要从单个细胞中扩增两个链。虽然, 已经开发和利用了几个单细胞的 TCR 克隆协议, 但迄今为止, 没有一个能够很容易地与高通量简化的 Vα/Vβ TCRs 的直接克隆相兼容, 成为重新体内的反转录病毒载体 4567。以前的研究采用了两种主要方法, 要么是有选择地放大 TCR 的有限部分足以推断序列, 要么放大整个 TCR 序列4,5,6,7. 通过第一种方法获得的 TCR 序列的下游功能分析需要昂贵的在硅片中程序集和de 从头构造 TCR。虽然第二种方法提供完整的 TCR 序列, 但人的恒定区域与在鼠标模型中克隆的 TCRs 的在体内表达不兼容。我们的方法是专门设计为与在体内的功能分析 TCRs 在小鼠模型中兼容。我们开发了一个高效和简化的单细胞 pcr 协议, 允许直接 sub-cloning pcr 片段到模板表达载体。

我们的方法采用了一个高度敏感的多重嵌套 PCR 反应, 这是两个步骤执行。在第一个复用反应步骤中, 所有 v-β链的40引物的池, 以及所有 v 型α链专用的44个引物池, 用于放大 TCR-α或 TCR-beta, 而无需事先了解序列 (表 1)。前引物有一个适配器序列, 这是纳入 PCR 产品的 5 "。反向底漆基于 TCR 的恒定区域。我们已经确定了在人类变量或连接 TCR 区域中不存在的唯一限制站点, 并将它们合并到新重新设计的 TCRα和 TCRβ引物 (图 1) 中。在第二个嵌套反应中, 使用在恒定区域内的适配器序列和嵌套反向底漆的底漆, 用于进一步放大 TCR 链, 增加特异性 (表 1,图 1)。单细胞分离后, 两轮 pcr (第一反应与池的 Vα和 Vβ引物, 第二次与适配器引物) 产生的 pcr 产品, 可以直接 sub-cloned 到模板逆转录病毒载体。最后的 TCR 结构将编码, 在一个单一的开放阅读框架, 人的可变区域结合的小鼠恒定区域连接的 ' self-cleaving ' 蛋白序列, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)8。P2A 序列已在多个系统中使用, 并已被广泛测试, 专门用于表达 TCRs891011。虽然, 在翻译以后多数 P2A 序列仍然附有由一个灵活的链接器连接的阿尔法链子的 C 末端, 而 beta 链信号序列有另外的脯氨酸, 这种修改对 TCR 作用没有有害作用。在构造中使用鼠标常量区域, 而不是人类, 以避免 re-expressed 在鼠标单元格中时与下游信号组件的潜在改变的交互。单一的, 将导致化学计量独立表达α和β链9,11。目前的协议是基于广泛可用的试剂和方法, 并且设计为以流线型和高效的方式进行。虽然我们已经明确地使用这项技术来检测 TCRs 从反应 T 细胞牵连自身免疫性糖尿病, 我们预计, 该协议可以广泛适用于识别和功能评估的人 TCRs 具体自身免疫表位, 肿瘤抗原表位, 或对病原体和疫苗的反应。

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Protocol

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1. 确定感兴趣的 T 细胞群体.

注意: 抗原特异增殖与细胞分裂染料 (如羧基琥珀酰亚胺酯, CFSE) 可用于分离 T 细胞的基础上, 其增殖反应抗原刺激。如果从 PBMCs 开始, 7 天的 体外 扩展应该足以识别抗原特异的 CFSE 低种群 12

  1. 将 PBMCs 1:1 与 MHC 匹配的进纸单元混合, 并使用5和 #181 的标签; M CFSE 细胞分裂染料.
  2. 板 2-2. 5 x 10 5 每个井在 96-井圆底培养板中的每个单元格200和 #181; L 10% FCS 完整的 RPMI 介质.
    注: 完整的 RPMI 含有2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 不必要的氨基酸, 5 毫米 HEPES, 5.5 和 #215; 10 和 #8722; 5 单位 2-基, 100 U mL 和 #8722; 1 青霉素和100和 #181; g mL 和 #8722; 1 链霉素
  3. 用 25 #181; M 肽抗原刺激细胞.
  4. 在第四天的文化, 小心删除和更换100和 #181; L 的媒体.
    注: 抗原特异 T 细胞识别的一种更为优化的方法是使用肽 HLA 体 13 。聚丙烯染色允许同时评估抗原特异性以及 HLA 限制.

2。设置单个单元格排序.

  1. 执行引擎盖或指定区域中的所有过程, 没有放大的模板。分的试剂, 以避免污染, 清洁所有的工作表面, 如果可行, 设备与10% 漂白剂之前, PCR 设置。使用过滤提示, 核糖核酸和 dnasei 免费试剂和塑料在所有的 PCR 和载体克隆步骤。关键试剂可以在 材料表 中找到.
    注意: 多重 PCR 反应是高度敏感的, 低水平的污染会导致产品的放大.
  2. 通过将 10x rt 反应缓冲、25X DNTPs、9 u rt 酶、0.01% 海卫 x、0.7 u 核糖核酸抑制剂和 383 nM 的每个 rt TCR 底漆 (列于 表 1 ) 中, 在无菌移油藏中生成反向转录主混合。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移。请参见 表 2 , 以了解反应组件和每井的金额.
  3. 准备一个96孔 PCR 收集板的细胞分类由移6和 #181; L 的反向转录主混合每井与多通道吸管。把盘子放在冰上或放在寒冷的街区.
  4. 将带有抗体的细胞标记为细胞表面标志物 (如 CD4 和 CD3, 或 CD8 和 CD3, 分别在2和 #181; g/毫升, 结合细胞分裂染料或聚丙烯染色).
  5. 对每个单元格中的 T 单元格进行排序, 跳过第十二行, 这将作为一个负控制.
    注意: 排序的效率将取决于在板持有人的精确收集板对齐, 以及保持在一个较低的温度下的细胞和板块在 cDNA 反应之前。收集板应保持在冰的时刻, 除了在排序, 当他们固定在冷却板。并非所有机都装有温度调节板架;但是, 强烈建议使用一种。由于该类通常需要约 10-15 分钟每盘, 有一个增加的潜力, RNA 退化, 如果该板块不保持在低温.
  6. 作为一个正向控制, 在这个阶段用吸管将大量的细胞 (100 细胞) 手动添加到其中的一个井中。另外, 以前分离的 RNA 从汇集的细胞可以使用作为正面控制在 10 ng 每井.
    注: 为了避免其他井的交叉污染和假阳性结果, 移液管精确、小心地纯化了 RNA.
  7. 用胶膜封板, 在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
  8. 将 RNA 转录到25和 #176; c 为 10 min、37和 #176; c 为 45 min、85和 #176; c 为 10 min.
    注意: 为了保证有效的 pcr 反应, 建议在同一天进行第一次 pcr 反应。另外, 转录板可以保存在-80 和 #176; C 最多2月.

3。执行多重嵌套 PCR

注意: 准备所有的主混合在一个干净的无模板区, 以避免污染.

  1. 将每个可变区域底漆重新重建为100和 #181; M 与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 O。接下来, 结合20和 #181; L 每个44引物生成 V 型α入门池。生成 v 型β-beta 入门池结合20和 #181; l 每 40 v 型β底漆加上80和 #181; l dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 底漆序列在 表 1 中列出。一旦汇集, 每引物的集中在混合是2.3 和 #181; m.
  2. 将常量区域底漆重建为100和 #181; m 库存解决方案与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 将常量区域底漆稀释到10和 #181; m 工作解决方案和分使用.
  3. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β放大。通过合并5X 缓冲区来生成主混合80和 #181; m dNTPs, 3% 亚砜, 2 和 #181; m 底漆池 (每个底漆的最终浓度 46 nm), 200 nm TCR-恒定区域反转底漆, 1 U DNA 聚合酶, dnasei 和核糖核酸自由 H 2 O ( 表2/强 >)。为每96个井板, 构成足够的主混合为10另外的反应 (共计 106), 为了补偿液体损失在移期间.
    注: 计算依据的是25和 #181 的最终 pcr 量; 每个井, 22.5 和 #181; i. pcr 组合与2.5 和 #181; l cDNA 模板.
  4. 在冰上或在冷块中保留该板的 cDNA。使用多通道, 以吸管22.5 和 #181; L TCR β反应到一个新的96井 PCR 板。然后使用多通道传输2.5 和 #181; L cDNA 进入 PCR 板.
  5. 使用多通道吸管22.5 和 #181; L TCR α反应直接进入含有其余的 cDNA 的板块.
  6. 用粘合剂将板材密封, 轻轻涡旋, 然后在 1000 x g 处旋转5分钟, 在4和 #176; C.
  7. 运行多重 PCR 反应与以下周期: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在54和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
  8. 在25和 #181 的最终容量中进行嵌套 pcr 反应; 使用2.5 和 #181; 采用多重 pcr 混合的 l 作为模板。
    1. 将内部和适配器的底漆重新制作为100和 #181; m 与 dnasei 和核糖核酸自由 H 2 o. 10 和 #181; 等分为工作库存.
    2. 准备两个单独的主混合 TCR-α和 TCR-β ampl分类.混合5X 缓冲器, 25X DNTP, 3% 亚砜, 200 nm 前向适配器底漆, 200 nm 反向嵌套底漆, 1 U dna 聚合酶, 和 dna 聚合酶和无核酸的 H 2 O 为最后的容量22.5 和 #181; L ( 表 2 )。对于每96个井板, 组成足够的主混合10额外的反应 (共 106), 以弥补液体损失在移.
      注: 在第二 pcr 反应中使用 5X pcr 缓冲含有负载染料, 以方便琼脂糖凝胶负载.
    3. 使用多通道, 吸管的主混合为 TCR α和 TCR β反应在22.5 和 #181; L 每井成两个新的 96-井 PCR 板.
    4. 在2.5 和 #181 添加多重 PCR 反应模板; 每井.
      注: 其余第一个 PCR 反应应密封, 并存储在-20 和 #176; C 作为附加模板的源, 如果需要 (请参见 步骤4.3 注意 ).
    5. 密封板, 轻轻涡, 并在 1000 x g 旋转下来5分钟, 在4和 #176; C.
    6. 运行带有以下循环的嵌套 PCR 反应: 5 分钟在95和 #176; c 和34周期二十年代在95和 #176; c, 三十年代在56和 #176; c, 1 min 在72和 #176; c, 7 min 在72和 #176; c.
    7. 运行5和 #181; L 最后的反应, 在1% 琼脂糖凝胶含有溴溴 (包括负和阳性控制井).
      注: 预计波段应运行约 500 bp 大小。 图 2 中显示了一个示例反应.
    8. 纯化第二反应的其余部分 (20 和 #181; l) 使用96井格式 PCR 纯化试剂盒, 洗与15和 #181; l 70 和 #176; C H 2 O 每井, 并执行桑格测序。使用适当的 TCR-α或 TCR-β适配器前向引物进行测序 ( 表 1 ).
      注意: 可以使用在线免疫软件分析序列.

4。亚克隆α和β PCR 链.

注: 第一反应中使用的正向引物的池, 第二个 PCR 反应中的反向引物用于合并限制部位。因此, 所获得的α和β链 PCR 产品可以按顺序 sub-cloned 到模板反转录病毒载体 ( 图 1 ).

  1. 使用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 从 beta 嵌套反应中摘录纯化的 PCR 产品.
    注: 请勿超过 5 #181; g 插入.
  2. 并行, 用 BstbI 和 MfeI ( 表 3 ) 来消化模板向量。使用1-2 和 #181; g 的模板向量每 TCR。在琼脂糖凝胶上运行的消化载体, 并隔离较大的波段 (〜 7500 bp)。用凝胶 DNA 纯化试剂盒净化载体.
    注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR-β变区被删除, 允许增加人类 TCR-β变量区域.
  3. 使用 pcr 纯化试剂盒提纯经消化的 pcr 产物.
    注: 验证套件中所含列的 DNA 纯化能力;必要时使用多个列。成功结扎反应所需的纯化插入物的最小用量为 50 ng, 最低浓度为 10 ng/和 #181;如果纯化的插入量是不足够的成功结扎, 第二个 PCR 反应可以重复.
  4. 将模板向量与 10 U CIP 酶用于1小时的37和 #176; c 以防止 self-ligation, 其次是热失活10分钟, 在75和 #176; c. 用 PCR 纯化试剂盒提纯 DNA ( 表 3 ).
  5. 结扎 TCR-β插入和向量, 使用 DNA 连接在20和 #181; L 总体积在6摩尔, 超过30分钟的插入物在室温下.
    注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
  6. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 为四十五年代. 添加500和 #181; 我超级物抑制 (soc) 培养基的最佳肉汤, 在37和 #176 时摇动1.5 小时; C.
  7. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
  8. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
  9. 确认通过 small-scale 测试-摘要成功插入 beta 链, 并使用限制酶 BstbI 和 MfeI。在12和 #181; l 总反应量, 结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10X 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
  10. 在确认插入的存在后, 使用 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 序列化向量的 TCR-beta 部分.
  11. TCR-beta 插入的顺序确认后, 执行类似的过程以插入 alpha 变量区域。从α嵌套反应中提炼纯化的 PCR 产物, 以及新生成的 TCR-β插入载体, 其中含有 SnaBI 和 SacII.
    注: 在限制酶消化期间, 模板小鼠 TCR α变区被移除, 允许增加人类的 TCR-α变量区域.
  12. 结扎在20和 #181 中使用 DNA 连接对相应的 beta 变量区域进行编码, 并将其插入到 TCR 向量中; 在室温下, 6 摩尔的总体积超过30分钟的插入量.
    注: 总的说, 结扎反应应包含约 150 ng 的 DNA ( 表 3 ).
  13. 用于转换, 混合8和 #181; 80 和 #181 的结扎反应 l; 具有化学能力的 大肠杆菌 DH5 和 #945; 细胞 (材料的 ) 和在冰上孵育30分钟的热休克在42和 #176; C 四十五年代. 添加500和 #181; 我 soc在37和 #176 时为1.5 小时的介质和抖动; C.
  14. 将250和 #181; 在含有性汤 (LB) 琼脂板的氨苄西林中培养细菌。在37和 #176 的夜间 (约16小时) 孵育盘; C.
  15. 第二天选择细菌菌落, 并在一夜之间在含有氨苄西林的3毫升培养基中生长。用 dna 质粒纯化试剂盒分离质粒 dna.
  16. 确认将α链成功插入的 small-scale 测试摘要与限制酶 SnaBI 和 SacII。在12和 #181; l 总反应容量结合200-500 和 #181; g 质粒 DNA, 0.25 和 #181; 每种酶的 l, 和10x 酶缓冲 ( 表 3 )。运行的反应1% 琼脂糖凝胶含有溴溴, 以确认大小的插入带 (〜 500 bp).
  17. 在确认插入的存在后, 使用 MSCV2-forward 入门 ( 表 1 ) 将向量的 TCR-alpha 部分序列化.
  18. 一旦验证了 alpha 链序列, 请通过 TCR-β-反转和 IRES 反向底漆 ( 表 1 ) 的顺序验证完整的 TCR 插入.

5。验证 TCR 细胞表面的表达和特异性.

注意: HEK293T 单元用于测试成功的 TCR 链ng 和单元格表面表达式 ( 图 3A ) 8 。多肽 MHC 聚丙烯染色也可以对转染的 HEK293T 细胞进行测试的保留抗原特异性后 TCR 基因分离 ( 图 3B ).

  1. 将12个组织培养皿中的 HEK293T 细胞在1毫升的 1 x 10 5 细胞中, 在5% 和 #176 的完整 DMEM 介质中包含37个 FCS 和区域性; c. 板出足够的细胞为每个新的 TCR 指定单独的井, 控制模板 TCR 矢量, 仅 CD3 向量, 控制 TCR 向量, non-transfected.
    注: 用完整的鼠标模板 TCR 载体转染 (纶) 与 mCD3 和 #949 结合; #947; #948; #950; pMIG 向量, 单纶向量, mCD3 #949; #947; #948; #950;-pMIG 矢量单独被用作正负控制.
    注: 完整的 DMEM 包含2毫米 l-谷氨酰胺, 1 毫米丙酮酸钠, 100 和 #181; M 非必需氨基酸, 5 毫米 HEPES 缓冲, 5.5 x 10 -5 单位 2-基, 100 U/毫升青霉素/链霉素.
  2. 第二天, 染1和 #181 的单元格; 纶向量、1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 载体, 和 liposome-based 转染试剂按照制造商的指示.
  3. 对于每个 TCR, 添加6和 #181; 将试剂转染为100和 #181; l 室温, 无血清 DMEM。短暂的旋涡, 并在室温下孵育15分钟.
  4. 在单独的1.5 毫升管中结合1和 #181; g TCR 纶向量与1和 #181; g 鼠标 CD3 和 #949; #947; #948; #950;-pMSCVII-GFP (pMIG) 矢量, 或1和 #181; 每个矢量的 g 分别用于控件.
  5. 滴, 将转染试剂/DMEM 溶液添加到包含矢量 DNA 的管中。室温孵育15分钟.
  6. 滴, 将转染试剂/DMEM/DNA 溶液添加到 HEK293T 细胞中。轻轻地轻敲盘子混合。孵育在37和 #176; C 为 24 h.
  7. 在24小时后替换媒体, 并将单元格保留为24小时.
  8. 通过大力移将细胞从板上移除, 并用 anti-mouse CD3 抗体 (2.5 和 #181; g/毫升) 对细胞进行染色, 以验证流式细胞术对嵌合 TCR 的表面表达.
  9. 为了比较被转染为类似水平的单元格之间的 CD3 表达式, 对表达类似高水平荧光报告分子的细胞进行分析 (GFP 为 CD3 复合体, 石为 TCR 表达载体)。优选地, 分析应该在 10 4 到 10 5 荧光强度 ( 图 3A ) 内的 GFP + 石 + 细胞上进行封闭.
    注: 在转嵌的细胞中的 CD3 表达水平应与控制鼠标 (原始模板) 矢量 ( 图 3A ) 相媲美。生成的 TCR 反转录病毒载体与先前描述的 4 中的 在体内 表达式系统兼容。

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Representative Results

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在步骤 3.2.7 (图 2) 中, 通过在琼脂糖凝胶上5µL 第二反应的运行, 对多重嵌套 PCR 反应的效率进行了检查。平均 TCR-β放大率的效率预计在80% 左右, 而 TCR-α反应的效率通常较低, 约 50%4。只有配对的 TCR α和 TCR β链可以用于 TCR 表达;然而, 所有 PCR 产品都可以测序, 以获得 TCR 序列和剧目信息。

基因沉默只允许在一个给定的 T 细胞中表达单一的 TCR-β链。然而, t 细胞能够重新排列第二个 TCR α链, 约25% 的 t 细胞将表达第二帧 TCR-α链14。预计, 部分孤立的 TCR α链将是次级α, 而不是 "正确" 的α链。次级阿尔法链往往不是一个最佳的绑定伙伴与 TCR 贝塔链;因此, 预计并非所有克隆的 TCRs 将形成一个稳定的复杂和细胞表面表达。因此, 必须通过染 HEK293T 细胞 (图 3A) 确认正确的 TCR 链配对和细胞表面表达。

Figure 1
图 1.优化的多重巢式 PCR 和逆转录病毒构建从单 T 细胞。两轮 PCR 结果放大了相应的 TCR α和β链。嵌入到底漆中的限制站点允许在小鼠细胞中简化 sub-cloning 和生成人/鼠嵌合的载体。模板鼠标矢量可用于方便地为人类切换出可变的鼠标区域, 生成嵌合的人/小鼠 TCR 逆转录病毒载体, 与小鼠细胞中的表达兼容。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.单细胞 PCR 的例子.多重巢式 PCR 扩增 t 细胞受体β和α链从单一的人 t 细胞排序成一个96孔板。显示的是相应的 (顶部和底部) PCR 产品从单细胞放大 TCR β和 TCR α链从人类 PBMCs. NC-无模板控制, PC 阳性控制。通过在琼脂糖凝胶 (5 µL) 上运行反应的一小部分, 在 pcr 产物测序之前确认了单细胞α和β链 pcr 反应的效率.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.细胞表面嵌合 TCR 表达和特异性的验证.(a) HEK293T 细胞转染鼠 TCR 或人/鼠嵌合 TCR 与小鼠 CD3εγδζ。用 anti-mCD3ε抗体测定细胞表面 TCR 表达。门控策略: 首先, 对石和 GFP 双阳性细胞 (G2) 进行了分析。在单矢量控制的情况下, 浇口必须基于单荧光 (G1)。其次, 对 G1 和 G2 的细胞进行了 CD3ε表达水平的分析。(B) TCR 特异性通过聚丙烯 DRB1*0401:GAD115-127 聚丙烯的293T 细胞染色证实。分析在 GFP+Ametrine+CD3ε + 单元格上是封闭的, 如A中所示。请单击此处查看此图的较大版本.

靶基因 底漆方向 序列
反向转录
TRAC cDNA AGCTGGACCACAGCCG
TRBC1 cDNA GAAATCCTTTCTCTTGACCATG
TRBC2 cDNA GCCTCTGGAATCCTTTCTCT
TCR α PCR 反应1
TRAV1-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGCTTTCCTTCTCTATGTTT
TRAV1-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTGGGGAGTTTTCCTTCTTTATGTTTC
TRAV2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCTTTGCAGAGCACTCTGG
TRAV3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCCTCTGCACCCATCTCG
TRAV4 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAGGCAAGTGGCGAGAGTGATC
TRAV5 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGACATTTGCTGGATTTTCGTTC
TRAV6 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGTCATTCCTGGGAGGTGTTT
TRAV7 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAGATGCGGAGACCTGTC
TRAV8-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGTTGCTCATACCAGTGC
TRAV8-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGCTGCTCGTCCC
TRAV8-3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTGGAGCTTATCCCACTG
TRAV8-7 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCTTAGTGGTCATTCTGCTGCTT
TRAV9-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAATTCTTCTCCAGGACCAGCG
TRAV9-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAACTATTCTCCAGGCTTAGTATCTCTGATACTC
TRAV10 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAAAAGCATCTGACGACCTTCTTG
TRAV12-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATATCCTTGAGAGTTTTACTGGTGATCC
TRAV12-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTAGTGATCC
TRAV12-3 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAATCCTTGAGAGTTTTACTGGTG
TRAV13-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGACATCCATTCGAGCTGTATTTATATTCC
TRAV13-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCAGGCATTCGAGCTTTATTT
TRAV14 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGTCACTTTCTAGCCTGCTGAAGGTG
TRAV16 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGCCCACCCTCATCTCAGTG
td>TRAV17 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAAACTCTCCTGGGAGTGTCTTTG TRAV18 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTGTCTGCTTCCTGCTCAGG TRAV19 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTGACTGCCAGCCTGTTGAG TRAV20 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAAATGTTGGAGTGTGCATTC TRAV21 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACCCTCTTGGGCCTG TRAV22 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGAGGATATTGGGAGCTCTGCT TRAV23 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGACAAGATCTTAGGAGCATCATTTTTAG TRAV24 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGAAGAATCCTTTGGCAGCC TRAV25 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTACTCATCACATCAATGTTGGTCTTAT TRAV26-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAGGCTGGTGGCAAGAGTAACTG TRAV26-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGTTGGTGACAAGCATTACTGTACTCC TRAV27 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGTCCTGAAATTCTCCGTGTCC TRAV29 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCCATGCTCCTGGGGG TRAV30 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACTCTCCTGAAAGTGCTTTCAG TRAV34 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGAGACTGTTCTGCAAGTACTCCTAGG TRAV35 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGCTCCTTGAACATTTATTAATAATCTTGTGG TRAV36 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGATGAAGTGTCCACAGGCTTTACTAGC TRAV38-1 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGACACGAGTTAGCTTGCTGTGGG TRAV38-2 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGCATGCCCTGGCTTCCT TRAV39 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAAGAAGCTACTAGCAATGATTCTGTGG TRAV40 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGAACTCCTCTCTGGACTTTCTAATTCTGA TRAV41 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATGGTGAAGATCCGGCAATTTTTG TRAC 外部 反向 CAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAGTCTC TCRbeta PCR 反应1 TRBV2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGATACCTGGCTCGTATGCTGG TRBV3-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTGCAGGCTCCTCTG TRBV4-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTGCAGGCTGCTCTG TRBV5-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTCCAGGCTGCTCTGTT TRBV5-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCCGGGCTCC TRBV5-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCTGGGCTCCTCT TRBV5-8 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGACCCAGGCTCCTCTTCT TRBV6-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCATCGGGCTCCTGTGC TRBV6-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCCTCGGGCTCCTGTG TRBV6-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGAATCAGGCTCCTGTGCTGTG TRBV6-6 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCATCAGCCTCCTGTGCTG TRBV7-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACAAGGCTCCTCTGC TRBV7-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCCTCTTCT TRBV7-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCCTCTG TRBV7-6 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGTCTCCTATGCTG TRBV7-7 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTACCAGTCTCCTATGCTGGG TRBV7-9 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGCCTCCTCTG TRBV9 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCTTCAGGCTCCTCTGCT TRBV10-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACGAGGCTCTTCTTCTATG TRBV10-2 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACCAGGCTCTTCTTCTATG TRBV10-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCACAAGGTTGTTCTTCTATGTG TRBV11-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCACCAGGCTTCTCTGCTG TRBV11-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTACCAGGCTCCTCTGCTG TRBV12-3 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACTCCTGGACCTTCTGCTGT TRBV12-4 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACTCCTGGACCCTCTGCTG TRBV12-5 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGCCACCAGGCTCCTCTG TRBV13 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTTAGTCCTGACCTGCCTGACTC TRBV14 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGTTTCCAGGCTTCTCAGTTTAGTGT TRBV15 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGTCCTGGGCTTCTCCACT TRBV16 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCCCAATATTCACCTGCATCA TRBV17d >提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGATATCTGGCTCCTCTGCTGG TRBV18 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGACACCAGAGTACTCTGCTGTGC TRBV19 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGAGCAACCAGGTGCTCTGCTG TRBV20 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTGCTGCTTCTGCTGCTTCT TRBV24-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGCCTCCCTGCTCTTCTTCTG TRBV25-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGACTATCAGGCTCCTCTGCTACATGG TRBV27 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGCCCCCAGCTCCTTG TRBV28 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGGGAATCAGGCTCCTCTGTCG TRBV29-1 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTGAGTCTTCTGCTCCTTCTCCT TRBV30 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATGCTCTGCTCTCTCCTTGCCCT TRBC 外部 反向 GTGGCCAGGCACACCAGTGTG TCR α PCR 反应2 TRAC 内部 反向 CAGCTGGTACAccgcggGGTCAGGGTTCTG 柴维适配器 提出 CGGTTCAGCAGGAATGCCtacgtaATG TCR β PCR 反应2 TRBC 内部 反向 CTCTGCTTCTGATGGttcgaaCACAGCGACCTCGG TRBV 适配器 提出 CAGAAGACGGCATACGAGATcaattgATG 测序底漆 pMSCV 二 提出 CCTCCTCTTCCTCCATCCGCC TCRbeta 反向 GCCAAGCACACGAGGGTAGCC ires 反向 AACGCACACCGGCCTTATTCC * 小写字母在引物序列之内表明被合并的限制酵素切口站点

表 1:反转转录、PCR 和测序底漆.

步骤2。2 每井金额
rt-pcr 反应 (6μL) μ)
10x 缓冲器 0。6
2x dNTP 0.24
10% 海卫一 X 0.06
3 TCR 专用底漆 (10mM ea) 0.23 ea (x 3 = 0.69)
0.18
核糖核酸抑制剂 0.28
NF (无核酸)-H2O 3.95
步骤3。1
PCR 反应 1 (25μL) μ) b PCR 反应 1 (25μL) μ)
5x 缓冲器 5 5x 缓冲器 5
dNTP (10mM) 1 dNTP (10mM) 1
0.75 亚甲基亚砜 (3%) 0.75
游泳池 (F 底漆) (2.3μM) 0。3 b 池 (F 底漆) (2.3μM) 0。5
外置 R 底漆 (10uM) 0。6 b 外部 R 底漆 (10μM) 1
DNA 聚合酶 0。2 去 Taq 聚合酶 0。2
rt-pcr cDNA 2。5 rt-pcr cDNA 2。5
NF-H2O 14.65 NF-H2O 14.05
步骤3。8
PCR 反应 2-相同的 a 和 b (25μL) μ)
5x 缓冲器 5
dNTP (10mM) 1
0.75
适配器 F 底漆 (10μM) 1
内 R 底漆 (10μM) 1
DNA 聚合酶 0。2
PCR rxn 1 产品 2。5
NF-H2O 13.55

表2。反转转录和 PCR 反应。

步骤4.2 和4。3
TRBV 消化反应 (50μL) μ) 纶向量文摘 (500μL) μ)
DNA (~ 20μg) DNA (~ 20μg)
MfeI 2 MfeI 20
BstbI 2 BstbI 20
10x 缓冲器 5 10x 缓冲器 50
H2O H2O
步骤4。4
CIP 反应 (100μL) μ) DNA (~ 1.5mg)
消化和 #38; 纯化的载体 DNA 84 10x 缓冲器 10 CIP 酶 6 步骤4。5 结扎反应 (20μL) μ) 消化/CIPed 载体 DNA (总插入量和矢量金额为 ~ 150 ng) 插入 DNA (6 摩尔接触矢量) 2x 连接缓冲器 10 连接酶 1 H2O 步骤4。9 试验文摘反应 (12μL) μ) DNA (100-300ng) 1 MfeI 0.25 BstbI 0.25 10x 缓冲器 1。2 H2O 9。3 步骤4.11 柴维消化反应 (60μL) μ) 含β-纶向量文摘 (120μL) DNA (~ 1.5μg) DNA (~ 3μg) SnaBI 3 MfeI 6 SacII 2 BstbI 4 10x 缓冲器 6 10x 缓冲器 10 H2O H2O

表3。矢量克隆反应。

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Discussion

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在当前的协议中, 我们描述了一个有效的方法单细胞 TCR 放大和随后的 sub-cloning 配对 TCR α和β链成模板逆转录病毒表达载体。虽然, 已经开发了几个单细胞 PCR 协议, 到目前为止没有与直接 sub-cloning 兼容到表达载体。在大多数情况下, 包含高度可变的 CDR3 区域的部分序列被放大, 具有足够的序列来推断变量区域。这种较小的 pcr 产品尺寸支持更高的 pcr 效率, 但需要de 从头TCR 基因合成功能研究。当前的协议保持了以前发布的 CDR3-focused 单单元 TCR 测序协议的效率, 同时产生了一个更长的增, 包含适合于克隆的整个可变区域。因此, 所描述的系统在给出定量序列以及功能输出方面具有更大的灵活性。

根据所讨论的科学问题, 分析的 T 细胞的来源和特异性可能有所不同。但是, 如果项目的最终目标是对体内TCR 函数的分析, 则需要了解孤立 T 细胞的 HLA 限制。目前的协议已被专门设计为与在体内TCR 表达的 HLA-人性化小鼠。这些小鼠中有许多已产生, 现已商业化, 包括 HLA-A2.1、HLA-DQ8 (HLA-DQA1*301,HLA-DQB1*302)、HLA-DQ6 (DQA1*0102,HLADQB1*0602)、HLA-DR4 (DRB1*0401)、HLA-DR1 (DRA*0101、DRB1*0101)、HLA-A11 (A*11:01/K)、HLA-B2705、HLA-A24, HLA-B*0702 转基因菌株。此协议可以成功地与以前发布的协议相结合, 用于逆转录病毒介导的人类 TCRs 的骨髓干细胞表达4,15,16。我们预计, 人性化的 TCR retrogenic 系统将适用, 并非常有用的功能分析人类 TCRs 在各种自身免疫, 癌症, 和传染病模型。

目前的单细胞 PCR 协议描述的关键步骤, 并提出建议, 成功放大配对 TCR α和 TCR β序列。第一个关键步骤是及时的表现 cDNA 转录, 以及随后的第一轮多重 PCR。所有的步骤都应及时进行, 所有的试剂和细胞在冰上保存, 以防止 RNA 和 cDNA 的降解。其次, 由于该协议被设计为对模板的低级别高度敏感, 因此它非常容易受到污染。因此, 必须在无模板的区域内工作, 远离放大的 PCR 产物或 TCR 的载体克隆。应使用单独的房间或遮光罩来建立 cDNA 和 PCR 反应。第一个 pcr 反应的模板应添加在一个不同的地方, pcr 是建立。在单细胞 PCR 实验中, 宜采用一套单独的 aliquoted 试剂。

使用材料表中列出的试剂对该协议进行了专门的优化, 试剂中的任何替换都需要额外的优化。对抗原特异细胞的初步鉴定可以修改为使用多肽 MHC 体。聚丙烯染色允许同时评估抗原特异性以及 HLA 限制。在缺乏聚丙烯试剂的情况下, 可考虑检测抗原反应性的替代方法, 如早期活化标记的上调或炎症细胞因子的分泌。例如, 针对 T 细胞抗原和 IFNγ的双特异融合抗体可以与磁珠隔离结合, 以丰富抗原活性 IFNγ产生细胞。

虽然在我们的协议中描述的嵌合的人/鼠结构确保了与小鼠细胞的相容性, 但它与人类 CD3 复合体的相容程度尚不得而知。虽然没有经过我们的正式测试, 其他人已经表明, 嵌合体的 TCR 构造与小鼠恒定区域可以表达在人淋巴细胞的表面17。这表明小鼠 TCR 恒定区域可以支持与人类 CD3 信号复合体的相互作用。然而, 如果目标是表达人类原细胞或人类细胞系 (如对细胞) 中的识别 TCRs, 一个更理想的方法可能是使用一个完全人类的结构。这可以通过在向量与人类恒定区域之间交换小鼠恒定区域来完成。

如果确定的 TCR 变量区域包含用于克隆的限制站点之一, 则应将 TCR 插入到航天飞机载体中, 然后使用站点定向诱变试剂盒进行突变, 从而在限制范围内诱发无声的核苷酸变化剪切站点。另一种方法是de 从头合成的 TCR 变量区域被修改, 以排除不需要的限制站点。

这项技术的主要限制是无法消除次生 "胞质" α链的放大。TCR-α基因不像 TCR-β基因那样经过位排斥, 因此, 很大比例的 T 细胞将表达第二个 "细胞质" α链14。所描述的 PCR 协议只会导致一个 TCR α链的放大, 但是如果扩增的α链是 "细胞质" α链, 它可能不会与放大的 beta 链配对。因此, 在 HEK293T 细胞中检测 TCR 细胞表面表达, 以确保成功的链配对是势在必行的。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究由 JDRF 1-2014-243-N, ADA 7-14-JF-07, NIH 5 P30 DK079638-05 飞行员 PJ, 和罗伯特和珍妮丝捷基金会资助。

我们感谢桑德拉和 Andrene 麦当劳的耐心招聘, 塞缪尔. 布鲁姆为技术援助, Dr. 乔治 Makedonas 的礼物抗体和控制 DNA 用于 PCR 优化。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CFSE  eBioscience  65-0850-84 5 mM
anti-human CD4 (OKT4) BV421 Biolegend  317433 2 mg/mL
anti-human CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5 Biolegend  317336 2 mg/mL
anti-mouse CD3 AF647 Biolegend  100322 2.5 mg/mL
Recombinant RNAse inhibitor biotech grd 2.5KU   VWR 97068-158 0.7 U
Applied Biosystems High capaity cDNA RT kit  Invirtogen  4368814 9 U (RT enzyme) 
NF-H2O: Nuclease-free water 1000mL Invirtogen  AM9932
Gotaq DNA polymerase 2500U VWR PAM3008 1 U
96 Well Half Skirt PCR Plate Phenix MPX-96M2
MicroAmp Clear Adhesive Film  ThermoFisher  4306311
UltraPure Agarose  Invirtogen  15510-027
SnaBI New England Biolabs  R0130 15 U (insert) 30 U (vector)
SacII New England Biolabs  R0157 40 U (insert) 80 U (vector)
MfeI New England Biolabs  R3589S 40 U (insert) 80 U (vector)
BstBI New England Biolabs  R0519 40 U (insert) 80 U (vector)
Calf Intestinal Phosphatase (CIP) New England Biolabs  M0290S 10 U
Quick ligase  New England Biolabs  M2200S
Wizard Plus minipreps DNA purification systems  Promega  A1460
Wizard Plus midipreps DNA purification systems  Promega  A7640
DNA clean & concentrator-25 kit Genesee Scientific  11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit Genesee Scientific  11-306A
QIAquick gel extraction kit Qiagen 28704
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104
Subcloning Efficiency DH5a Competent Cells  ThermoFisher  18265017
Transit LT-1 Reagent 1mL (transfection reagent) Mirus  MIR2300
BD FACS Aria II (sorter) BD
BD Fortessa (flow cytometer) BD 

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References

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简化的单细胞 TCR 分离和逆转录病毒载体的生成, 用于<em>体外</em>和<em>体内</em>表达人类 TCRs
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Sprouse, M. L., Blahnik, G., Lee, T., Tully, N., Benarjee, P., James, E. A., Redondo, M. J., Bettini, M. L., Bettini, M. Streamlined Single Cell TCR Isolation and Generation of Retroviral Vectors for In Vitro and In Vivo Expression of Human TCRs. J. Vis. Exp. (127), e55379, doi:10.3791/55379 (2017).More

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