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Medicine

Aβ के निरपेक्ष मात्रा Published: March 21, 2017 doi: 10.3791/55386
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2,3, 1,2
1Institute of Neuroscience and Physiology, Department of Psychiatry and Neurochemistry, The Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, Sahlgrenska University Hospital, 2Clinical Neurochemistry Laboratory, Sahlgrenska University Hospital, 3UCL Institute of Neurology, Queen Square

Introduction

अल्जाइमर रोग (ई) मनोभ्रंश का सबसे आम रूप है और करीब 35 लाख लोगों के लिए दुनिया भर में 1 को प्रभावित करता है। रोग व्यापक रूप से ई रोगजनन के मूल में झूठ बोलने के लिए माना जाता है की नयूरोपथोलोगिकल पहचान hyperphosphorylated ताउ प्रोटीन 2 के intracellular neurofibrillary tangles और बाह्य सजीले टुकड़े एकत्रित amyloid बीटा (Aβ) पेप्टाइड्स 3 से मिलकर कर रहे हैं। इस के साथ लाइन में, बायोमार्कर से विवो में पट्टिका विकृति के आकलन हाल ही में ई 4 के लिए अनुसंधान नैदानिक मानदंडों में शामिल किया गया है। Aβ 1-42 की सीएसएफ माप के लिए, कई immunoassays उपलब्ध हैं और कई नैदानिक प्रयोगशालाओं 5 में इस्तेमाल कर रहे हैं। सीएसएफ में Aβ 1-42 की एकाग्रता लगभग 50% संज्ञानात्मक सामान्य बुजुर्गों की तुलना में ई रोगियों में कम है, बीआर में सजीले टुकड़े में पेप्टाइड के बयान को दर्शाती हैऐन 6, 7।

ये मुख्य रूप से बायोमार्कर immunoassays (यानी, एंटीबॉडी आधारित तकनीक) का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं, लेकिन इन assays मैट्रिक्स प्रभाव 8 से प्रभावित किया जा सकता है। विभिन्न प्रौद्योगिकी प्लेटफार्मों पर immunoassays और परख मानकीकरण 9 की कमी का उपयोग करते हैं, 10 मुश्किल 11, 12 वैश्विक कट-ऑफ सांद्रता की शुरूआत करता है। एक विश्लेषणात्मक मान्य आरएमपी अलग परख प्लेटफार्मों की वर्दी अंशांकन अनुमति होगी, आदर्श विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों भर में बेहतर तुलनीयता में और समग्र माप परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कारकों के बेहतर नियंत्रण में जिसके परिणामस्वरूप।

Aβ 1-42 की पूर्ण मात्रा का ठहराव विकसित नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विधि का उपयोग एंटीबॉडी आधारित techn के साथ जुड़े मुद्दों के कई काबूiques। विधि, में प्रयोगशाला चिकित्सा traceability के लिए संयुक्त समिति (JCTLM डेटाबेस पहचान संख्या C11RMP9), द्वारा एक आरएमपी के रूप में सूचीबद्ध Aβ 1-42 के पूर्ण एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए एक प्रमाणित संदर्भ सामग्री (सीआरएम) में सीएसएफ Aβ 1 अनुरूप करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा तकनीक और विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों भर -42 माप। वर्णित कार्यप्रवाह चिकित्सा के अन्य क्षेत्रों के भीतर पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए उम्मीदवार संदर्भ विधियों के विकास के लिए प्रासंगिकता का होना चाहिए।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल प्रत्येक Aβ पेप्टाइड के लिए 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के साथ कम से कम 50 μL की aliquots, सामग्री शुरू करने के रूप में, की आवश्यकता है। Aβ पेप्टाइड्स 20% acetonitrile (ACN) और 4% केंद्रित अमोनिया समाधान विआयनीकृत पानी में (वी / वी) में भंग कर दिया और 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

सावधानी: सुरक्षा जानकारी के लिए 1 टेबल देखें।

1. समाधान की तैयारी

  1. ACN के 20 एमएल और विआयनीकृत पानी में केंद्रित अमोनिया की 4 एमएल (~ 25%) गिराए द्वारा 20% ACN और 4% की 100 एमएल विआयनीकृत पानी (वी / वी) में केंद्रित अमोनिया समाधान तैयार है। विआयनीकृत पानी के साथ 100 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। ताजा दैनिक बनाओ।
  2. 50 एमएल की अंतिम मात्रा को विआयनीकृत पानी में guanidine-हाइड्रोक्लोराइड के 26.08 ग्राम भंग करके 5 एम guanidine-हाइड्रोक्लोराइड के 50 एमएल तैयार करें। 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और ताजा मासिक बनाते हैं।
  3. (विआयनीकृत पानी में 4% फॉस्फोरिक एसिड के 200 एमएल तैयार v /v) विआयनीकृत पानी में केंद्रित फॉस्फोरिक एसिड (~ 85%) का 9.4 एमएल गिराए। विआयनीकृत पानी के साथ 200 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। फ्रिज में स्टोर और ताजा साप्ताहिक बनाते हैं।
  4. ACN के 37.5 एमएल और विआयनीकृत पानी में केंद्रित अमोनिया के 5 एमएल (~ 25%) गिराए द्वारा विआयनीकृत पानी में 75% ACN के 50 एमएल और 10% केंद्रित अमोनिया समाधान (वी / वी) तैयार करें। विआयनीकृत पानी के साथ 50 एमएल के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। ताजा दैनिक बनाओ।
  5. Calibrators, नियमित नैदानिक ​​विश्लेषण से de-पहचान बचे हुए नमूनों से प्राप्त करने के लिए गला लें मानव सीएसएफ के कम से कम 2.5 एमएल।
  6. कृत्रिम सीएसएफ 150 मिमी ना, 3.0 मिमी कश्मीर, 1.4 मिमी सीए, 0.8 मिमी मिलीग्राम, 1.0 मिमी पी, और विआयनीकृत पानी में 155 मिमी सीएल युक्त तैयार है और 4 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए गोजातीय सीरम albumin जोड़ें। केवल 1 एमएल विश्लेषण के अनुसार की जरूरत है, लेकिन एक बड़ी मात्रा में तैयार करते हैं, यह विभाज्य, और भविष्य में उपयोग के लिए दुकान।

2. Calibrators की तैयारी

  1. 4 माइक्रोग्राम के 0.5 एमएल तैयार / एमएल 15 NAβ 1-42 एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 20% ACN और 4% केंद्रित अमोनिया की 0.46 एमएल / एमएल 15 NAβ 142 50 ग्राम के 40 μL जोड़कर पेप्टाइड। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  2. एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 20% ACN और 4% केंद्रित अमोनिया की 1.95 एमएल 4 माइक्रोग्राम / एमएल 15 NAβ 142 के 50 μL जोड़कर 100 एनजी / एमएल 15 NAβ 1-42 पेप्टाइड के 2 एमएल तैयार करें। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  3. प्रत्येक समाधान तालिका 2 में संकेत की मात्रा के मिश्रण से छह अंशशोधक समाधान (वायुसेना) तैयार करें। 0.5, 1.5, और 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग करें। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  4. इसी अंशांकन समाधान और तालिका 3. मिक्स 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर के अनुसार मानव सीएसएफ जोड़कर 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में अंतिम Calibrators (दो प्रतियों में) तैयार करें।

3. आंतरिक मानक की तैयारी

  1. एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 20% ACN और 4% केंद्रित अमोनिया की 1.968 एमएल / एमएल 13 CAβ 142 50 ग्राम के 32 μL जोड़कर 0.8 माइक्रोग्राम / एमएल 13 CAβ 1-42 पेप्टाइड के 2 एमएल तैयार करें। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  2. एक 5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 20% ACN और 4% केंद्रित अमोनिया का 4.9 एमएल 0.8 माइक्रोग्राम / एमएल के 0.1 एमएल जोड़कर 16 एनजी / एमएल 13 CAβ 1-42 पेप्टाइड के 5 एमएल तैयार करें। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।

4. प्रतिक्रिया कारक नमूना की तैयारी

नोट: प्रतिक्रिया कारक (आरएफ) दृढ़ संकल्प अंशांकन (15 NAβ 1-42) के लिए इस्तेमाल लेबल पेप्टाइड की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। यह जरूरी है कि देशी Aβ 1-42 पेप्टाइड की एकाग्रता एमिनो एसिड विश्लेषण (एएए) का उपयोग निर्धारित किया गया है। इस प्रकार, मात्रा और देशी Aβ 1-42 पेप्टाइड aliquots की एकाग्रताएएए की आवश्यकताओं को पूरा करने की जरूरत है।

  1. एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 20% ACN और 4% केंद्रित अमोनिया की 0.46 एमएल के लिए 50 ग्राम के 40 μL / एमएल मूल निवासी Aβ 1-42 जोड़कर 4 माइक्रोग्राम / एमएल देशी (लेबल नहीं किया गया) Aβ 1-42 के 0.5 एमएल तैयार करें। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  2. 20% की 1.96 एमएल / एमएल मूल निवासी Aβ 1-42 और 4μg के 20 μL / एमएल 15 NAβ 1-42 4 माइक्रोग्राम के 20 μL जोड़कर एक 2 एमएल 40 एनजी / देशी और 15 NAβ 1-42 एमएल मिश्रण तैयार करें ACN और 4% एक 2 एमएल microcentrifuge ट्यूब में अमोनिया ध्यान केंद्रित किया। 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिलाएं।
  3. एक 0.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में कृत्रिम सीएसएफ के 0.38 एमएल के लिए 40 एनजी / एमएल मिश्रण के 20 μL जोड़ें। डुप्लिकेट को तैयार है और 1 मिनट के लिए एक भंवर मिक्सर पर मिश्रण।

5. नमूना तैयार

नोट: नमूने गला लें एक रोलर पर कमरे के तापमान पर मापा जाएगा।

  1. चित्रा 1 के अनुसार प्रत्येक अंशशोधक, प्रतिक्रिया कारक है, और अज्ञात नमूना (गुणवत्ता नियंत्रण [क्यूसी] नमूने, अगर इस्तेमाल सहित) 1 एमएल प्रोटीन 96 गहरी अच्छी तरह से थाली के 0.18 मिलीलीटर जोड़ने, (एक पूरी थाली संभालने प्रयोग किया जाता है)। में नमूने जोड़ने के लिए सुनिश्चित, या करने के लिए, कुओं के नीचे बंद करें।
  2. आंतरिक मानक के 20 μL प्रत्येक अच्छी तरह से (यानी, Calibrators, प्रतिक्रिया कारकों, QCs, और अज्ञात) को जोड़ें; यह विंदुक टिप जलमग्न बिना अच्छी तरह से नमूना की सतह के करीब की तरफ बूंद जारी करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 0.2 एमएल के 5 एम guanidine-हाइड्रोक्लोराइड जोड़ें।
  4. एक microplate प्रकार के बरतन पर नमूना थाली प्लेस और 1100 rpm पर 45 मिनट के लिए नमूने मिश्रण। इष्टतम आवृत्ति इंस्ट्रूमेंटेशन के आधार पर भिन्न हो सकती है। आवृत्ति और मिक्सर के आयाम इतना तय है कि समाधान अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं और आंतरिक मानक या सीएसएफ का कोई बूंदों कुओं की तरफ अमिश्रित छोड़ दिया जाता है।
  5. 4% फॉस्फोरिक एसिड के 0.2 एमएल जोड़ेंप्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए। भंवर संक्षिप्त मिश्रण।

6. ठोस चरण निष्कर्षण

नोट: सभी धोने, लोडिंग, और क्षालन चरणों में, समाधान जोड़ने के बाद संभव सबसे कम निर्वात लागू करते हैं और के रूप में लोड या समाधान elute करने की जरूरत धीरे-धीरे वृद्धि हुई है। प्रत्येक लदान और क्षालन कदम के बीच वैक्यूम अक्षम करें।

  1. एक मिश्रित-मोड के तहत कचरे के लिए एक जलाशय ट्रे रखो, निकासी प्लेट कई गुना कक्ष में कटियन विनिमय, 96 अच्छी तरह से ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) थाली।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से मेथनॉल के 0.2 एमएल जोड़कर एसपीई sorbent हालत।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4% फॉस्फोरिक एसिड के 0.2 एमएल जोड़कर sorbent संतुलित करना।
  4. विशेष थाली करने के लिए गहरी अच्छी तरह से थाली से सभी नमूने (प्रत्येक कुएं में 0.62 के बारे में एमएल) हस्तांतरण। जब विशेष थाली करने के लिए गहरी अच्छी तरह से थाली से नमूने स्थानांतरित एक आठ चैनल पिपेट का उपयोग करें; यह सभी नमूनों की पूरी या बराबर मात्रा हस्तांतरण करने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि नमूने एक प्रशिक्षु शामिलअल मानक है कि बदलाव के लिए क्षतिपूर्ति करेगा।
  5. Sorbent धोने के बाद नमूनों में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4% फॉस्फोरिक एसिड के 0.2 एमएल जोड़कर के माध्यम से पारित कर दिया है।
  6. धोने के बाद विलायक sorbent से eluted गया है, एक संग्रह थाली या ट्रे ट्यूबों के साथ जलाशय की जगह।
  7. दो बार 75% ACN / 10% केंद्रित अमोनिया के 50 μL जोड़कर sorbent से नमूना Elute, और ध्यान दें कि यह समाधान Sorbent के माध्यम से पारित करने के लिए एक बहुत ही कम निर्वात की आवश्यकता है। इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बीच वैक्यूम निष्क्रिय करने के लिए याद रखें।
    1. वैकल्पिक: सील संग्रह थाली या ट्यूब और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले 6.8.2 संग्रह थाली या ट्यूब से मुहर निकालें।
    2. वैक्यूम centrifugation का उपयोग (गर्मी लगाने के बिना) द्वारा eluates सूखी इस निर्वात सेंट्रीफ्यूज के आधार पर कई घंटे के लिए एक से ले जा सकते हैं।
    3. कंटेनरों को सील करने और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।

7. तरल ChromatoGraphy

  1. , और सुई धोने (50% ACN (ACN [V / V] में 4% विआयनीकृत पानी और 0.1% केंद्रित अमोनिया) मोबाइल चरण ए (5% ACN और विआयनीकृत पानी [V / V] में 0.3% केंद्रित अमोनिया), बी तैयार और 4% विआयनीकृत पानी में अमोनिया केंद्रित [V / वी])।
    1. मोबाइल चरण एक के 500 एमएल के लिए, एसीएन के 25 एमएल और विआयनीकृत पानी के लिए केंद्रित अमोनिया की 1.5 एमएल जोड़ें। विआयनीकृत पानी के साथ 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    2. मोबाइल चरण बी के 500 मिलीलीटर के लिए, केंद्रित अमोनिया के 500 μL और ACN के लिए विआयनीकृत पानी के 25 एमएल जोड़ें। ACN के साथ 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    3. ACN के 120 एमएल और विआयनीकृत पानी के लिए केंद्रित अमोनिया के 10 एमएल जोड़कर सुई धोने के 250 एमएल तैयार करें। विआयनीकृत पानी के साथ 250 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें।
    4. नियंत्रण रेखा प्रणाली के साथ उपयोग करने से पहले 20 मिनट के लिए एक sonication स्नान में मोबाइल चरणों ए और बी खुला और सुई धोने बोतलें रखो
  2. 25 20 की μL% ACN और 4% concentra के साथ प्रत्येक नमूना भंगटेड अमोनिया समाधान और उन्हें 20 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर जगह है। नमूने नीचे अपकेंद्रित्र और उन्हें autosampler में जगह (7 डिग्री सेल्सियस पर रखना)।
  3. एक 1 x 250 मिमी 2 polystyrene-divinylbenzene (उलट-चरण) अखंड 50 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा स्तंभ पर नमूना के 20 μL इंजेक्षन।
    1. नियंत्रण रेखा ढाल 0.3 एमएल / मिनट के प्रवाह की दर के साथ तालिका 4 में दिखाया प्रयोग करें। एक डाइवर्ट वाल्व का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमीटर के प्रदूषण को कम करने के लिए (पोस्ट-स्तंभ) बर्बाद करने के लिए पहले दो और पिछले पांच मिनट हटाने की।

8. मास Spectrometric विश्लेषण

नोट: इन मानकों एक quadrupole-Orbitrap संकर बड़े पैमाने पर aheated electrospray आयनीकरण स्रोत के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इस्तेमाल किया गया।

  1. तालिका 5 के अनुसार आयन स्रोत के लिए मानकों सेट करें।
  2. एमएस साधन सेट मूल निवासी Aβ 1-42 के 4 प्रभारी राज्यों को अलग-थलग करने के लिए (1,129.48 बड़े पैमाने परकरने के लिए प्रभारी अनुपात [मी / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 मी / z), और 13 CAβ 1-42 (1,179.50 मी / z) 2.5 मी / z की एक अलग चौड़ाई के साथ quadrupole जन विश्लेषक में।
  3. 17.0 की एक सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा (एनसीई) के साथ टक्कर सेल में अलग पेप्टाइड्स टुकड़ा। यहां तक ​​कि एक ही प्रकार के (और खासकर अगर इस तरह के एक ट्रिपल quadrupole एमएस के रूप में उपकरणों के अन्य प्रकार, का उपयोग करते हुए) यह, प्रत्येक साधन के लिए परिचित होने की आवश्यकता हो सकती है।
  4. 17.500 के एक संकल्प के साथ टुकड़ा स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड, 2 एक्स 10 5 आरोपों की एक स्वत: प्राप्त नियंत्रण लक्ष्य और 250 एमएस की एक अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ।

9. डाटा प्रोसेसिंग

  1. प्रत्येक पेप्टाइड के लिए chromatographic क्षेत्रों की गणना करने के लिए 6 तालिका में (± 250 मिल्ली जन इकाइयों [MMU] के एक बड़े पैमाने सहिष्णुता के साथ) उत्पाद आयनों का योग का प्रयोग करें। ध्यान दें कि आयन प्रकार और संख्या केवल देशी Aβ लिए दिखाए जाते हैं 15 NAβ 1-42 और 13 CAβ 1-42 के लिए ही कर रहे हैं।
  2. मूल निवासी Aβ 1-42 की वक्र के तहत क्षेत्र के साथ 15 NAβ 1-42 की वक्र (chromatographic चोटी) के तहत क्षेत्र को विभाजित करके दो प्रतिक्रिया कारक नमूनों की औसत प्रतिक्रिया कारक निर्धारित करते हैं।
  3. 15 NAβ 1-42 की एकाग्रता प्रतिक्रिया कारक कदम 9.2 में गणना के साथ यह गुणा करके जांच के लिए इस्तेमाल किया समायोजित करें।
  4. क्षेत्र अनुपात एकाग्रता के खिलाफ Calibrators के दो सेट से 13 CAβ 1-42 को NAβ 1-42 15 की साजिश रचने के द्वारा एक अंशांकन वक्र का निर्माण।
  5. ढलान और रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर अंशांकन वक्र के अवरोधन की गणना।
  6. आंतरिक मानक (13 CAβ 1-42) संयुक्त राष्ट्र के लिए करने के लिए देशी Aβ 1-42 के क्षेत्र अनुपात की गणनानाम से जाना जाता नमूने हैं।
  7. ढलान और अवरोधन कदम 9.5 में प्राप्त का उपयोग कर अंशांकन वक्र से अज्ञात नमूनों की एकाग्रता एक्सट्रपलेशन।

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Representative Results

चित्रा 1 में थाली सेटअप के नमूने की एक पूरी थाली के लिए प्रयोग किया जाता है। कम अज्ञात नमूनों का विश्लेषण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, तो दूसरी अंशशोधक, आरएफ, और QC सेट अज्ञात नमूनों की पहली छमाही के बाद रखा जाना चाहिए।

चित्रा 2 में देखा, Calibrators प्रतिगमन लाइन के करीब है, कम मानक विचलन के साथ कर रहे हैं। इस विधि 150 स्नातकोत्तर / एमएल और 4,000 स्नातकोत्तर / एमएल की मात्रा का ठहराव के एक ऊपरी स्तर की मात्रा का ठहराव का एक कम स्तर है। अंशांकन के अवशिष्ट मानक विचलन निश्चित रूप से संभव के रूप में के रूप में कम होना चाहिए। अगर अंशांकन गैर रेखीय है, रन (गंभीरता पर निर्भर करता है) खारिज किया जाना चाहिए, और विचलन गलत pipetting तकनीक और / या Calibrators के कमजोर पड़ने में त्रुटियों के कारण सबसे अधिक संभावना है। प्रतिकृति की भिन्नता (सीवी) के गुणांक 20% नीचे है, लेकिन अधिमानतः 10% से नीचे होना चाहिए।

ogether.within-पेज = "1"> मूल निवासी 15 एन और 13 CAβ 1-42 नियंत्रण रेखा स्तंभ एक साथ से Elute (क्योंकि वे केवल समस्थानिक स्तर पर अलग), के साथ सममित चोटियों के करीब है और महत्वपूर्ण पीछा बिना (चित्रा 3 )। कम से कम दस माप प्रत्येक chromatographic शिखर के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए और साधन विधि में अधिकतम इंजेक्शन समय के साथ समायोजित किया जा सकता है। सभी तीन पेप्टाइड्स एमएस विश्लेषण के दौरान सभी माप (अंशांकन, आरएफ, और अज्ञात) के लिए एक साथ मापा जा सकता है। हालांकि, अगर विधि की संवेदनशीलता सबऑप्टिमल है, ब्याज की केवल पेप्टाइड्स प्रत्येक इंजेक्शन के लिए (मापा जाना चाहिए अर्थात्।, केवल आरएफ नमूने के लिए Calibrators के लिए 15 एन और 13 CAβ 1-42, देशी और 15 NAβ 1-42 मापने, और देशी और अज्ञात नमूने के लिए 13 CAβ 1-42)।

चित्रा 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
चित्रा 1: विशेष और गहरे अच्छी तरह से प्लेटों के लेआउट। Calibrators की विशिष्ट लेआउट (वायुसेना), प्रतिक्रिया कारक नमूना (आरएफ), गुणवत्ता नियंत्रण के नमूने (क्यूसी), और अज्ञात। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: कैलिब्रेशन वक्र। अंशांकन वक्र 172 पर 15 NAβ 1-42, 572, 1,144, 2,287, 3,431, 4,574 और स्नातकोत्तर / एमएल (प्रतिक्रिया कारक का उपयोग कर समायोजित) और मानव सीएसएफ में आंतरिक मानक के रूप में 13 CAβ 1-42 प्रयोग का निर्माण (एन = 2) । 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 के क्षेत्र अनुपात साजिश रची है (शाफ़्ट)एकाग्रता (एक्स अक्ष) के खिलाफ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: chromatogram। 0.500 एनजी / एमएल देशी (अंतर्जात) Aβ 1-42 (शीर्ष पैनल) और मानव सीएसएफ में 1.6 एनजी / एमएल 13 CAβ 1-42 (नीचे पैनल) की chromatogram। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: अज्ञात नमूनों में अज्ञात Aβ 1-42 की मात्रा <।/ strong> चोटी क्षेत्र अनुपात आंतरिक मानक (13 CAβ 1-42) chromatographic शिखर क्षेत्र के साथ देशी Aβ 1-42 chromatographic शिखर क्षेत्र को विभाजित करके गणना की है। नमूना में देशी Aβ 1-42 की एकाग्रता अंशांकन वक्र से extrapolated है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
तालिका 1: सुरक्षा जानकारी। इस प्रोटोकॉल के लिए प्रयुक्त रसायनों के लिए सुरक्षा जानकारी।

अंशशोधक समाधान 100 एनजी के वॉल्यूम / एमएल 15 NAβ 1-42 समाधान (एमएल) 20% ACN और 4% अमोनिया की मात्रा (एमएल) अंतिम मात्रा (एमएल) अंतिम 15 NAβ 1-42 एकाग्रता (एनजी / एमएल)
ए 0.20 0.30 0.50 40.00
बी 0.15 0.35 0.50 30.00
सी 0.20 0.80 1.00 20.00
डी 0.10 0.90 1.00 10.00
ए 0.05 0.95 1.00 5.00
एफ 0.03 1.97 2.00 1.50

तालिका 2: अंशशोधक समाधान। अंशशोधक समाधान 20% ACN में तैयार किया और 4% अमोनिया केंद्रितसीएसएफ Calibrators spiking के लिए इस्तेमाल किया।

अंशशोधक अंशशोधक समाधान इसी की मात्रा (एमएल) मानव सीएसएफ की मात्रा (एमएल) अंतिम मात्रा (एमएल) अंतिम 15N-Aβ1-42 एकाग्रता (एनजी / एमएल)
ए 0.02 (ए) 0.18 0.20 4.00
बी 0.02 (बी) 0.18 0.20 3.00
सी 0.02 (सी) 0.18 0.20 2.00
डी 0.02 (डी) 0.18 0.20 1.00
ए 0.02 (ई) 0.18 0.20 0.50
एफ 0.02 (एफ) 0.18 0.20 0.15

तालिका 3: Calibrators। मानव सीएसएफ में तैयार Calibrators।

समय (मिनट) % मोबाइल चरण बी
0 5
1 5
6 20
7 90
9 90
10 5
15 5

सारणी 4: नियंत्रण रेखा ढाल। नियंत्रण रेखा ढाल 300 μL / मिनट की एक निरंतर प्रवाह की दर के साथ प्रयोग किया।

पैरामीटर मूल्य
म्यान गैस 50
सहायक गैस 6
स्प्रे वोल्टेज 4.4 केवी
एस लेंस आरएफ 61
हीटर तापमान 190 डिग्री सेल्सियस
केशिका तापमान 350 डिग्री सेल्सियस

तालिका 5: आयन स्रोत सेटिंग्स। आयन स्रोत के लिए पैरामीटर साधन धुन सॉफ्टवेयर में स्थापित किया जाना है।

अग्रदूत साबित आयन उत्पाद आयनों
मूल निवासी Aβ1-42 (मी / z 1129.58, 4) 915.19 (b334 +), 943.21 (b344 +), 975.98 (b354 +), 1000.74 (b364 +), 1029.51 (b384 +), 1054.03 (b394 +), 1078.79 (b404 +), 1107.06 (b414 +), 1163.23 (b313 +), 1200.25 (b323 +), 1257.29 (b343 +), 1300.96 (b353 +), 1333.66 (b363 +), 1372.00 (b383 +), 1405.02 (b393 +)
15N-Aβ1-42 (मी / z 1143.00, 4) 926.41, 954.68, 987.95, 1012.71, 1041.22, 1066.99, 1091.75, 1120.28, 1177.18, 1215.55, 1272.58, 1316.92, 1349.94, 1388.63, 1422.31
13C-Aβ1-42 (मी / z 1179.50, 4) 955.33, 985.11, 1019.37, 1045.14, 1074.65, 1100.67, 1126.69, 1156.40, 1253.43, 1313.14, 1358.50, 1393.19, 1432.21, 1466.90

टेबल 6: आयनों मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया। अग्रदूत आयनों की 4 प्रभारी राज्यों 2.5 मी / z की एक अलग चौड़ाई के साथ, quadrupole जन विश्लेषक में अलग कर रहे हैं। उत्पाद आयनों (± 250 MMU के एक बड़े पैमाने सहिष्णुता के साथ) प्रत्येक पेप्टाइड के लिए chromatographic क्षेत्रों की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। आयन प्रकार और संख्या onl हैंY मूल निवासी Aβ 1-42 उत्पाद आयनों के लिए दिखाया गया है, के बाद से वे दोनों 15 NAβ 1-42 और 13 CAβ 1-42 के लिए ही कर रहे हैं।

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Discussion

वर्णित विधि के लिए, बजाय एक किराए की मैट्रिक्स का उपयोग कर के, हम किराए की analyte दृष्टिकोण 13, 14, 15, 16, जो मानव सीएसएफ में अंशांकन सक्षम बनाता है इस्तेमाल किया। किराए की analyte दृष्टिकोण दो अलग isotopically लेबल मानकों शामिल है। जबकि एक अन्य (13 CAβ 142) आंतरिक मानक के रूप में प्रयोग किया जाता है एक (15 NAβ 142), मानव सीएसएफ में अंशांकन वक्र उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अज्ञात अंतर्जात Aβ 142 सांद्रता तो extrapolated रहे हैं अंशांकन वक्र से 15 NAβ 142/13 CAβ 142 गणना की अंतर्जात Aβ 142/13 CAβ 142 अनुपात द्वारा अनुपात का उपयोग निर्माण किया। किराए की analyte दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया गया था के बाद से वहाँ कोई analyte मुक्त सीएसएफ उपलब्ध है, और कम Aβ 142 वसूलीजब विधि विकास के दौरान एक किराए की मैट्रिक्स में देशी Aβ 142 का उपयोग कर मनाया गया।

15 के बाद से NAβ 142 और देशी Aβ 142 अलग-अलग प्रतिक्रियाएं एमएस में, 15 NAβ 142 की एकाग्रता एक ज्ञात एकाग्रता के साथ, एक आरएफ नमूना एक कृत्रिम सीएसएफ 15 NAβ 142 और देशी Aβ 142 के बराबर सांद्रता वाले नमूना मापने के द्वारा निकाला जाता है दे सकता है बैचों के बीच लेबल एन पेप्टाइड 15 के समस्थानिक पवित्रता में संभव बदलाव के कारण AAA.The प्रतिक्रिया कारक द्वारा निर्धारित विभिन्न मास स्पेक्ट्रोमीटर के बीच अलग हो सकता है। इस प्रकार, प्रतिक्रिया कारक प्रत्येक माप दिन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम Calibrators और आरएफ नमूनों की तैयारी कर रहे हैं। Aβ पेप्टाइड्स, विशेष रूप से Aβ 1-42, बहुत हाइड्रोफोबिक हैं और आसानी से पिपेट सुझावों के लिए छड़ी एकएन डी ट्यूब के सतहों 8, 17, 18। pipetting दौरान Aβ पेप्टाइड्स के नुकसान को कम करने के लिए, यह पिपेट सुझावों का वितरण करने से पहले तर करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। अधिमानतः, पेप्टाइड समाधान के तीन खंडों एक नया ट्यूब युक्त समाधान के लिए वितरण के लिए पहले खारिज किया जाना चाहिए। मात्रा और शेयर समाधान की एकाग्रता पर निर्भर करता है, यह हमेशा संभव नहीं है। दूसरी सबसे अच्छा दृष्टिकोण और तीन बार नीचे प्रसव के लिए पहले पेप्टाइड समाधान पिपेट करने के लिए पाठ्यक्रम की है। उसी कारण से, यह ट्यूबों के लिए उचित आकार का उपयोग करने के लिए, बड़े शून्य मात्रा में परहेज जरूरी है।

विधि के लिए पहले से प्रकाशित आंकड़ों से पता चलता है कि वसूली 100% (15%) 15 के भीतर था। बैक गणना Calibrators के लिए रिश्तेदार त्रुटियों पूरी श्रृंखला अंशशोधक वक्र 19 द्वारा परिभाषित के 15% के नीचे थे।

अरे, एकइस तकनीक का bvious सीमा है कि यह कम throughput स्वचालित immunoassays की तुलना में है। हालांकि, वर्णित विधि का उद्देश्य उच्च सटीकता और न throughput है। इस विधि को भी Aβ 1-38 और Aβ 1- 40 है, जो कम 19 हैं शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इस पद्धति का एक सीमा है कि ऑपरेटर साधन पर विश्लेषण चलाने से पहले व्यापक मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी है।

immunoassays का उपयोग कर मात्रा का ठहराव एंटीबॉडी और एंटीजन के बीच बातचीत पर निर्भर है। इस बातचीत नमूना घटकों हस्तक्षेप या बातचीत के साथ प्रतिस्पर्धा कर सकते हैं कि की उपस्थिति से प्रभावित किया जा सकता है। इसके अलावा, बातचीत भी प्रतिजन की रचना से प्रभावित किया जा सकता है। इन प्रभावों को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो जाता है और मुख्य कारण है कि यह मुश्किल हो गया है प्रतिरक्षा प्लेटफार्मों के बीच और प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों के अनुरूप करने के लिए माना जाता है। Becएमएस के साथ ause मात्रा का ठहराव सीधे लक्ष्य अणुओं एक स्थिर, आइसोटोप लेबल मानक के सापेक्ष गिनती पर आधारित है, मात्रा का ठहराव निरपेक्ष और इस तरह के मैट्रिक्स प्रभाव से आम तौर पर अप्रभावित है। इसके अलावा, immunoassays द्वारा नैदानिक ​​प्रोटीन माप, उच्च आदेश माप प्रक्रियाओं और सामग्री की अटूट श्रृंखला के द्वारा समर्थित होना चाहिए मान्य से नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस और RMPs को स्थिर, आइसोटोप लेबल आंतरिक मानकों और एक सीआरएम, इस प्रकार तुलनीयता में सुधार और परिणाम 20, 21 की विश्वसनीयता।

अंत में, सीएसएफ में Aβ 142 की माप के लिए वर्णित आरएमपी एक सीआरएम सीएसएफ में Aβ 142 के लिए सामान्य कट-ऑफ एकाग्रता स्थापित करने में मदद मिलेगी कि विकसित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। सटीक कट-ऑफ सही जल्दी ई के निदान के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण हैं और जब रोग संशोधित दवाओं के नए प्रकार के क्लिनिक तक पहुंचने अत्यंत महत्व के हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL Eppendorf 022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL Eppendorf 022431081
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf 022431102
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL Eppendorf 0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 Eppendorf 951032905
Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom Micronic MPW32071BC3 Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.
Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes Micronic MP53026 Caps for Micronic tubes.
Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded Micronic MPW51015BC3 Holder for Micronic tubes.
Biohit Optifit tips 1.2 mL Sartorius 791210 Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.
Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate Waters 186001830BA 
Waters Plate manifold reservoir tray Waters WAT058942
Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates Waters 186001831
Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis Sigma-Aldrich 30501-1L-D
Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L Fisher Scientific A/0627/17X
ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur Merck Millipore 1005731000
Guanidine Hydrochloride, 500 g Thermo Scientific 24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler.
Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) Dionex 066640
Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated Sigma-Aldrich B6917
Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA rPeptide A-1002-2
15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled rPeptide A-1102-2
13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled rPeptide A-1106-2
Microplate shakers, TiMix 2 Edmund Bühler 6110 000

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References

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चिकित्सा अंक 121 अल्जाइमर रोग amyloid बीटा पेप्टाइड्स मस्तिष्कमेरु द्रव मास स्पेक्ट्रोमेट्री तरल क्रोमैटोग्राफी निरपेक्ष मात्रा संदर्भ माप प्रक्रिया।
Aβ के निरपेक्ष मात्रा<sub&gt; 1-42</sub&gt; सीएसएफ में प्रयोग एक मास Spectrometric संदर्भ माप प्रक्रिया
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Pannee, J., Blennow, K., Zetterberg, … More

Pannee, J., Blennow, K., Zetterberg, H., Portelius, E. Absolute Quantification of Aβ1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure. J. Vis. Exp. (121), e55386, doi:10.3791/55386 (2017).

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