Introduction
Alzheimer hastalığı (AD), demansın en yaygın biçimidir ve dünya çapında 1 ila yaklaşık 35 milyon insanı etkiler. Yaygın AD patogenezinde özünde yalan inanılan hastalığın nöropatolojik işaretlerinden toplu amiloid-beta (Aβ) peptitler 3 oluşan hiperfosforile tau proteininin 2 hücre içi nörofibrillerin ve hücre dışı plaklar vardır. Buna paralel olarak, biyomarkerların tarafından in vivo plak patoloji değerlendirmesi son zamanlarda AD 4 araştırma tanı kriterleri dahil edilmiştir. Aβ 1-42 BOS ölçümleri için, çok sayıda bağışıklık mevcuttur ve çok sayıda klinik laboratuarlarda 5 kullanılır. BOS Aβ 1-42 konsantrasyonu br plaklarda peptidin birikme yansıtan bilişsel normal yaşlılarda daha AD hastalarında yaklaşık olarak% 50 daha düşüktürain 6, 7.
Bu biyolojik esas olarak immün (örneğin, antikor bazlı teknikleri) kullanılarak analiz edilir, ancak bu deneyler, matriks etkileri 8 etkilenebilir. Farklı teknoloji platformları üzerinde immunoassay ve tahlil standardizasyon 9 eksikliği kullanımı 10 11, 12 zorlu küresel kesme konsantrasyonlarının giriş yapar. Analitik doğrulanmış RMP ideal analitik platformlarda daha iyi karşılaştırılabilirlik ve genel ölçüm değişkenliği katkıda bulunan faktörlerden daha iyi kontrol sonuçlanan farklı tahlil platformları üniforma kalibrasyonunu imkan verecek.
Geliştirilmiş LC-MS / MS yöntemi kullanılarak Aβ 1-42 mutlak ölçümü antikor bazlı techn ile bağlantılı sorunların üstesinden geliriques. Laboratuvar Tıp İzlenebilirlik için Ortak Komitesi (JCTLM veritabanı kimlik numarası C11RMP9) tarafından bir RPM olarak listelenen yöntem, BOS Aβ 1 uyumlaştırmak için bir Sertifikalı Referans Malzeme (CRM) içinde Aβ 1-42 mutlak konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır teknikleri ve analitik platformlarda -42 ölçümler. açıklanan iş akışı Tıbbın diğer alanlarında peptidler ve proteinler için aday başvuru yöntemlerinin geliştirilmesi için alaka olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol, başlangıç malzemesi olarak, her Aβ peptidi için 50 ug / ml bir konsantrasyonda en az 50 uL hacimde, gerektirir. Aβ peptidler, deiyonize su içinde% 20 asetonitril (ACN) ve% 4, konsantre amonyak çözeltisi (hac / hac) içinde çözülmüş ve 80 ° C 'de muhafaza edilmesi gerekir.
Dikkat: güvenlik bilgisi için Tablo 1'e bakınız.
Çözümler 1. hazırlanması
- ACN 20 ml deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 4 mL (~% 25) seyreltilmesi ile% 20 ACN ve% 4, 100 ml deiyonize edilmiş su (hacim / hacim) konsantre amonyak çözeltisi hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 100 mL nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun.
- 50 mL'lik bir son hacme kadar iyonu giderilmiş su içinde guanidin-hidroklorür 26.08 g çözülmesiyle 5 M guanidin-hidroklorid 50 mL hazırlayın. 20 ° C'de saklayın ve taze Aylık'ı yapmak.
- (Deiyonize su içinde% 4 fosforik asit 200 mL Hazırlama V /h) deiyonize su içinde konsantre edilmiş fosforik asit (~% 85) 9.4 ml seyreltilmesiyle. iyonu giderilmiş su ile 200 mL nihai hacim ayarlayın. Buzdolabında saklayın ve taze haftalık yapmak.
- ACN, 37.5 mL deiyonize su içinde konsantre edilmiş amonyak 5 mL (~% 25) seyreltilmesi ile deiyonize su içinde 50% 75 ACN mL ve% 10 konsantre edilmiş amonyak çözeltisi (hac / hac) hazırlayın. iyonu giderilmiş su ile 50 ml nihai hacim ayarlayın. her gün taze olun.
- Rutin klinik analizden de tanımlanan artık örneklerden elde edilen kalibratör, insan CSF en az 2.5 mL çözülme.
- 150 mM Na, 3.0 mM K, 1.4 mM Ca, 0.8 mM Mg, 1.0 mM p ve deiyonize su içinde 155 mM CI ihtiva eden suni CSF hazırlamak ve 4 mg / mL'lik nihai bir konsantrasyona kadar sığır serum albümini ekleyin. Sadece 1 ml gelecekte kullanılmak üzere kısım bunu, ve mağaza, analiz başına gerekli, ama büyük hacimli hazırlamak olduğunu.
Kalibratörlerimizden 2. Hazırlık
- 4 ug 0.5 mL hazırlayın / ml 10.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / 15 mL NAβ 142 50 ug 40 uL eklenmesiyle 5 NAβ 1-42 peptid. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.95 mL 4 ug / ml 15 NAβ 142 50 uL eklenmesiyle, 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 peptid 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- Tablo 2'de belirtilen her bir çözelti miktarı karıştırılarak altı kalibratör solüsyonları (AF) hazırlayın. 0.5, 1.5, ve 2 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- karşılık gelen kalibrasyon çözümleri ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda Tablo 3. Karışımı uygun olarak insan CSF eklenerek 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde (çift olarak) son kalibratörleri hazırlayın.
Dahili standardın 3. hazırlanması
- 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 1.968 mL / 13 mL CAβ 142 50 ug 32 uL eklenmesiyle / ml 13 CAβ 1-42 peptid 0.8 ug 2 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- 5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 4.9 ml 0.8 ug / ml 0.1 ml ilave edilerek 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 peptid 5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
Yanıt Faktörü Numunenin 4. hazırlanması
Not: yanıt faktörü (RF) belirlenmesi kalibrasyon (15 NAβ 1-42) için kullanılan işaretli peptidin konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu yerli Aβ 1-42 peptid konsantrasyonu amino asit analizi (AAA) ile tespit edilmiştir gerektirir. Bu durumda, ses ve yerli Aβ 1-42 peptid alikotları konsantrasyonuAAA gereklerini yerine getirmek gerekir.
- 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü içinde% 20 ACN ve% 4 konsantre edilmiş amonyak 0.46 mL / mL nativ Aβ 1-42 50 ug 40 uL eklenmesiyle (etiketlenmemiş) 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 0.5 mL hazırlayın. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- % 20 1.96 mi, 4 ug / mL nativ Aβ 1-42 ve 4 ug 20 ul / ml 15 NAβ 1-42 20 uL eklenmesiyle yerli 15 NAβ 1-42 bir 2 mL 40 ng / ml karışımı hazırlayın ACN ve% 4 2 mL mikrosantrifüj tüpü içinde amonyak konsantre edildi. 1 dakika boyunca vorteks mikserde karıştırılır.
- 0.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde suni CSF 0.38 mL 40 ng / ml karışımı 20 uL ekleyin. çiftleri hazırlayın ve 1 dakika boyunca bir vorteks karıştırıcıda karıştırılır.
5. Numune Hazırlama
NOT: örnekleri çözülme rulo üzerinde oda sıcaklığında ölçülecek.
- Şekil 1'e göre, bir 1 ml protein 96 derin oyuklu plakaya her kalibratör, yanıt faktörü ve (kullanıldığı takdirde kalite kontrol [QC] örnekleri dahil) bilinmeyen numunenin 0.18 mL ekleyin (tam bir plaka varsayılarak kullanılır). örnekleri eklemeyi unutmayın, ya da kuyu dibine, yakın olun.
- Her iyi (yani, kalibratörler, tepki faktörleri, QCS ve bilinmeyenler) iç standardın 20 uL ekleyin; o pipet batış olmadan numunenin yüzeyine iyice yakın tarafında damla serbest bırakmak için önemlidir.
- Her bir oyuğa 0.2 ml 5 M guanidin-hidroklorür ekleyin.
- bir mikro çalkalayıcı örnek plakasını ve 1100 rpm'de 45 dakika süre ile numuneler karıştırın. Optimal frekans enstrümantasyon bağlı olarak farklılık olabilir. Mikserin frekans ve genliği ayarlayın çözümler iyice karıştırılır ve iç standart veya CSF hiçbir damla kuyuların tarafında karışmamış bırakılır böylece.
- % 4 fosforik asit 0.2 mL eklemeher oyuğa. Vortex kısaca karıştırın.
6. Katı Faz Ekstraksiyon
Not: Tüm yıkama, yükleme ve elüsyon adımlarda, çözelti ilave edildikten sonra mümkün olan en düşük vakum uygulanır ve yük veya çözelti elüt edilmesi için gerektiği şekilde yavaş yavaş artar. Her yükleme ve elüsyon adım arasındaki vakum devre dışı bırakın.
- karma modunda atıklar için bir rezervuar tepsi koyun, ekstraksiyon plakası manifold bölmesi katyon-değişim, 96-çukurlu bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) plaka.
- Her bir oyuğa 0.2 ml metanol eklenerek SPE sorbent hale getirin.
- her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek sorbent dengelenmesi.
- SPE plakasına derin kuyu plaka tüm örnekleri (her kuyuda yaklaşık 0.62 ml) aktarın. SPE plakasına derin kuyu plaka örnekleri aktarırken sekiz kanallı pipet kullanın; Numuneler, bir intern içeren, çünkü tüm örneklerin tamamı veya eşit hacimlerde aktarmak için önemli değildirdeğişimleri telafi edecek al standardı.
- Numuneler her kuyuya% 4 fosforik asit 0.2 ml ilave edilerek üzerinden geçtikten sonra sorbent yıkayın.
- yıkayıcı çözücü sorbentten elüt sonra, bir toplama plakası ve tüpler haznesi tepsisini değiştirin.
- iki kez% 75 ACN /% 10 konsantre amonyak 50 uL eklenmesiyle sorbentten örnek Zehir, ve bu çözelti, sorbent geçmesi için çok düşük bir vakum gerektirdiğini not edin. her ilave arasında vakum devre dışı bırakmak için unutmayın.
- İSTEĞE BAĞLI: toplama plakası veya tüpleri Seal ve -80 ° C'de onları dondurmak. 6.8.2 adıma geçmeden önce toplama plakası veya tüplerden contayı sökün.
- (Isı uygulamadan) vakum santrifüj kullanılarak eluatları Kuru; Bu vakum santrifüj bağlı olarak birkaç saat birinden alabilir.
- kapları mühür ve -80 ° C'de onları dondurmak.
7. Sıvı Chromatografisi
- Ve iğne yıkama (% 50 ACN (ACN [hacim / hacim]% 4, deiyonize su ve% 0.1 konsantre edilmiş amonyak), B (iyonu giderilmiş su [hacim / hacim]% 5 ACN ile% 0.3 konsantre edilmiş amonyak), mobil faz A Hazırlama ve% 4, deiyonize su içinde amonyak konsantre edildi: [hacim / hacim]).
- Mobil faz A, 500 ml ACN 25 mL deiyonize su konsantre amonyak 1.5 ml. iyonu giderilmiş su ile 500 mL nihai hacim ayarlayın.
- mobil faz B, 500 ml konsantre amonyak 500 uL ACN iyondan arındırılmış 25 ml su ilave edin. ACN ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın.
- ACN, 120 ml deiyonize su, konsantre amonyak 10 ml ilave iğne yıkama 250 mL hazırlayın. deiyonize su ile 250 mL son ses seviyesini ayarlayın.
- LC sistemi kullanmadan önce 20 dakika süreyle sonikasyon banyosunda açık mobil fazlar A ve B iğne yıkama şişeleri koymak
- 25 uL konsantrasyon% ACN% 20 ve 4 ile her bir örnek çözülürted amonyak çözeltisi, 20 dakika süre ile bir çalkalama üzerine yerleştirin ve. örneklerin aşağı santrifüj ve alıcısı içinde koyun (7 ° C'de tutmak).
- 50 ° C 'de muhafaza edilen bir 1 x 250 ila 2 mm polistiren-divinilbenzen (ters faz) monolitik kolon üzerinde örneğin 20 ul enjekte edilir.
- 0.3 mL / dakika bir akış oranı ile Tablo 4'te gösterilmiştir LC gradyanı kullanın. kütle spektrometresi kirlenmesini azaltmak için yönlendirme vanası kullanılarak (post-sütun) atık ilk iki ve son beş dakika yönlendir.
8. Kitle spektrometrik analiz
NOT: Bu parametreler aheated elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile teçhiz edilmiş bir dört kutuplu-Orbitrap hibrid kütle spektrometresi kullanıldı.
- Tablo 5'e uygun iyon kaynağı parametrelerini ayarlar.
- (Yerli Aβ 1-42 4+ şarj durumlarını izole etmek için 1,129.48 kütle cinsinden MS cihazı ayarlayın2,5 m / z yalıtım genişliği kuadruple kitle analizatöründe için şarj oranı [m / z]), 1-42 15 NAβ (1,143.00 m / z), ve 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z).
- 17.0 normalleştirilmiş çarpışma enerjisi (NCE) ile çarpışma hücresinde izole peptidler parçalara. (Örneğin, bir üçlü dört MS gibi araçlarla diğer türleri, kullanımı ve özellikle de) da aynı türde Bu, her enstrüman için ayarlanmış olması gerekebilir.
- 2 x 10 5 ücretleri otomatik kazanç kontrol hedefine ve 250 ms maksimum enjeksiyon süresi ile 17.500 çözünürlüğe sahip fragmanı spektrumları kaydedin.
9. Veri İşleme
- Her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için Tablo 6'da (± 250 mili kütle birimlik [mmu] kütle toleransla) Ürün iyonlarının toplamı kullanın. iyon türleri ve sayıları yalnızca yerel Aβ için gösterilen unutmayın
- Yerel Aβ 1-42 eğri altında kalan alan 15 NAβ 1-42 eğrisi (kromatografik tepe) altındaki alanı bölünmesiyle iki farklı yanıt faktörü numunelerin ortalama yanıt faktörünü belirleyin.
- Adım 9.2 hesaplanan tepki faktörü ile çarpılarak kalibrasyon için kullanılan 15 NAβ 1-42 konsantrasyonu ayarlayın.
- Konsantrasyonuna karşı kalibratör iki grup 13 CAβ 1-42 kadar NAβ 1-42, 15 alan oranları işaretlenmesiyle bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak.
- lineer regresyon kullanılarak kalibrasyon eğrisinin eğimini ve kesişme hesaplayın.
- Un iç standart (CAβ 1-42 13) yerli Aβ 1-42 alanı oranını hesaplamakBilinen örnekler.
- Adım 9.5 'de elde edilen eğim ve kesişme kullanarak kalibrasyon eğrisinden bilinmeyen örneklerinin konsantrasyonunu tahmin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de plaka kurulumu numune tam levha kullanılır. Daha az bilinmeyen numuneler analiz edilecek ise, ikinci kalibratör, RF, ve QC setleri bilinmeyen numunelerin ilk yarısından sonra konulmalıdır.
Şekil 2'de görüldüğü gibi, kalibratörler, düşük ve standart sapmalar, regresyon çizgisine yakın bulunmaktadır. Bu yöntem, 150 pg / ml ve 4,000 pg / ml miktarının bir üst düzeyde miktarının daha düşük bir seviyede bulunur. Kalibrasyon kalan standart sapması tabii ki mümkün olduğu kadar düşük olması gerekmektedir. Kalibrasyon non-lineer ise, çalıştırma (şiddetine bağlı olarak) atılmalıdır ve sapma nedeniyle kalibratörlerinin seyreltme yanlış pipetleme tekniği ve / veya hatalar büyük olasılıkla. çoğaltır varyasyon (CV) katsayısı% 20'nin altında, tercihen% 10 altında olmalıdır.
ogether.within-page = "1"> simetrik doruklarına yakın ve önemli kuyrukçuluğunda olmadan aynı anda LC sütunundan yerli 15 N ve 13 CAβ 1-42 elute (onlar sadece izotop düzeyde farklılık beri), (Şekil 3 ). En az on ölçümleri her kromatografik tepe için yapılmalıdır ve alet yöntemi maksimum enjeksiyon süresi ile ayarlanabilir. Her üç peptidler MS analizi sırasında tüm ölçümlerde (kalibrasyon, RF, ve bilinmeyenler) için eş zamanlı olarak ölçülebilir. Yöntemin duyarlılığı suboptimal, ancak sadece ilgilenilen peptitlerin (her enjeksiyon için ölçülmelidir yani., Sadece RF örnekleri için yerel kalibratör 15 N, 13 CAβ 1-42 ve 15 NAβ 1-42 ölçmek ) yerli ve bilinmeyen numuneler için 13 CAβ 1-42.
Şekil 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Şekil 1: SPE ve derin oyuklu plakalar Düzenleri. kalibratörlerinin tipik düzeni (AF), tepki faktörü numune (RF), kalite kontrol numuneleri (QC) ve bilinmeyenler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kalibrasyon eğrisi. Kalibrasyon eğrisi 172 15 NAβ 1-42, 572, 1,144, 2,287, 3,431 ve 4,574 pg / ml (yanıt faktörü kullanılarak ayarlanmıştır) ve insan CSF iç standart olarak 13 CAβ 1-42 kullanılarak inşa (n = 2) . 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 alan oranı taslak haline getirilir (Y-ekseni)konsantrasyonu (X-ekseni) karşı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: kromatogramı. 0.500 ng / ml yerli (endojen) Aβ 1-42 (üst panel) ve insan BOS 1.6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (alt panel) kromatogramı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: bilinmiyor örneklerinde bilinmeyen Aβ 1-42 Niceleme <./ strong> pik alanı oranı iç standart (13 CAβ 1-42) kromatografik tepe alanı ile yerel Aβ 1-42 kromatografik tepe alanı bölünmesiyle hesaplanır. Örnek doğal Aβ 1-42 konsantrasyonu kalibrasyon eğriden yola çıkılarak hesaplanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: Güvenlik Bilgileri. Bu protokol için kullanılan kimyasalların güvenlik bilgileri.
| Kalibratör çözümü | 100 ng hacmi / ml 15 NAβ 1-42 çözeltisi (mi) % 20 ACN% 4 amonyak hacmi (mi) | Nihai hacmi (mi) | Nihai 15 NAβ 1-42 konsantrasyonu (ng / ml) | |
| bir | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| B | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| D | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
Tablo 2: Kalibratör çözümleri. Kalibratör solüsyonları% 20 ACN içinde hazırlanır ve% 4 amonyak konsantre edildiBOS kalibratörler spike kullanılır.
| Kalibratör | Kalibratör çözümü karşılık gelen hacim (ml) | İnsan BOS hacmi (ml) | Nihai hacmi (mi) | Nihai 15N-Aβ1-42 konsantrasyonunun (ng / ml) |
| bir | 0,02 (A) | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| B | 0.02 (B) | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0,02 (C) | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| D | 0.02 (D) | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0.02 (E) | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
Tablo 3: Kablibratörler. İnsan CSF hazırlanan kalibratörler.
| Süresi (dak) | % Mobil faz B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tablo 4: LC gradyan. 300 uL / dakika bir sabit akış oranı ile kullanılan LC gradyanı.
| Parametre | değer |
| Kılıf gazı | 50 |
| munzam gaz | 6 |
| sprey gerilimi | 4.4 kV |
| S-lens RF | 61 |
| Isıtıcı sıcaklığı | 190 ° C |
| kılcal sıcaklığı | + 350 ° C |
Tablo 5: İyon kaynağı ayarları. iyon kaynağı için parametreler cihaz ayar yazılımında ayarlanacak.
| prekürsör iyon | ürün iyonları |
| Yerli Aβ1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (b334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (b354 +), 1000,74 (b364 +), 1029,51 (b384 +), 1054,03 (b394 +), 1078,79 (b404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (b313 +), 1200,25 (b323 +), 1257,29 (b343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (b363 +), 1372,00 (b383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 |
Tablo 6: ölçümü için kullanılan iyonlar. Ön-madde iyonları 4+ yük durumları 2,5 m / z bir izolasyon genişliği, kuadruple kitle analizatöründe izole edilir. (± 250 MMU kütle toleransla) ürün iyonları her peptit için kromatografik alanları hesaplamak için kullanılır. İyon türleri ve sayıları onl olanY, her 15 NAβ 1-42 ve 13 CAβ 1-42 için aynı olduğundan, ana Aβ 1-42 ürün iyonları için gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarif edilen yöntem için, bunun yerine bir yedek matris kullanılarak, insan CSF kalibrasyon sağlar taşıyıcı analit yaklaşım 13, 14, 15, 16, kullanılır. vekil analit yaklaşım iki farklı izotopik olarak etiketlenmiş standartları içerir. Başka bir (13 CAβ 142), dahili standart olarak kullanılır ise bir (15 NAβ 142), insan CSF kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır. Kalibrasyon eğrisi hesaplanan endojen Aβ 142/13 CAβ 142 oranında 15 NAβ 142/13 CAβ 142 oranı kullanılarak inşa bilinmeyen endojen Aβ 142 konsantrasyonları sonra hesaplanmıştır. 142 kurtarma hiçbir analit içermeyen CSF kullanılabilir ve düşük Aβ beri vekil analit yaklaşımı kullanılmıştıryöntem geliştirme sırasında bir vekil matris içinde yerli Aβ 142 kullanırken gözlenmiştir.
NAβ 142 ve ana Aβ 142 15 yana bilinen bir konsantrasyonu, 15 NAβ 142 ve ana Aβ 142 eşit konsantrasyonlarını ihtiva eden bir RF numune yapay CSF örnek ölçülerek ayarlanır, MS 15 NAβ 142 konsantrasyonunun farklı tepkiler verebilir nedeniyle 15 izotop saflıkta olası varyasyonlar farklı kütle spektrometre arasında farklılık olabilir AAA.The tepki faktörü ile belirlenir partiler arasındaki peptit N-etiketli. Bu nedenle, Yanıt Faktörü her ölçüm gün için belirlenmelidir.
Bu protokolde en kritik adımlar kalibratörlerinin ve RF örneklerinin hazırlanması bulunmaktadır. Özellikle Aβ 1-42 Aβ peptidler, çok hidrofobik ve kolayca pipet uçları sopa birnd tüpleri 8, 17, 18 yüzeyleri. pipetleme sırasında Aβ peptidler kaybını en aza indirmek için, teslimattan önce pipet uçları doyurmak için son derece önemlidir. Tercihen, peptid solüsyonu üç hacim önce yeni bir tüp ihtiva eden çözeltiye teslim atılmalıdır. Stok çözeltisinin hacmi ve konsantrasyonu ile ilgili olarak, bu her zaman mümkün değildir. İkinci en iyi yaklaşım yukarı ve teslimattan önce üç kez aşağı peptid çözüm pipetle için tabii ki. Aynı nedenle, büyük boş hacimlere kaçınarak borular için uygun boyutları kullanmak önemlidir.
Yöntem, daha önce yayınlanan veri kurtarma% 100 (% 15) 15 içinde olduğunu göstermektedir. Arka hesaplanan kalibratörlerinin için göreli hatalar kalibratör eğrisi 19 tarafından tanımlanan tüm aralığın% 15'in altında idi.
Bir OBu tekniğin bvious sınırlama düşük verimli otomatik bağışıklık göre olmasıdır. Bununla birlikte, tarif edilen metodun amacı, yüksek hassasiyet ve kapasiteye sahip olmasıdır. Bu yöntem aynı zamanda 19 daha kısa Aβ 1-38 ve Aβ 1- 40 içerecek şekilde genişletilebilir. Bu yöntemin diğer bir sınırlama operatör alet üzerinde analize geçmeden geniş kütle spektrometresi eğitime ihtiyaç olacaktır.
immün kullanılarak miktar tayini antikor ile antijen arasındaki etkileşime bağlıdır. Bu etkileşim, engelleyen veya etkileşim ile rekabet edebilir numune bileşenlerinin mevcudiyetinde etkilenebilir. Buna ek olarak, bir etkileşim de antijenin uygunluğunu etkilenebilir. Bu etkiler kontrol etmek zordur ve immunoassay platformları arasında ve laboratuarlar arasındaki sonuçların uyumlu hale getirilmesine zor olmuştur temel nedeni olduğuna inanılmaktadır. becMS ause miktar, doğrudan bir kararlı, izotopla işaretli standart göre hedef molekülleri sayımı dayanır, miktar, matris etkilerinden mutlak ve genellikle etkilenmemektedir. böylece Karşılaştırılabilirliği iyileştirilmesi, LC-MS / MS ve RMPS stabil izotop etiketli dahili standartların ve CRM valide gelen ek olarak, immünoeseylerle tanı protein ölçümleri, yüksek dereceli ölçüm prosedürleri ve malzemelerin kesintisiz bir zincir ile desteklenmeli ve sonuçlar 20, 21 güvenilirlik.
Sonuç olarak, BOS Aβ 142 ölçümü için açıklanan RMP BOS Aβ 142 için genel kesme konsantrasyon kurmak için yardımcı olacak bir CRM geliştirilmesinde önemli bir adımdır. Tam cut-off değerleri doğru erken AD teşhisine yönelik son derece önemli olan ve hastalık modifiye ilaçların yeni tip klinik ulaştığında büyük önem taşımaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Braak, H., Braak, E.
- Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Buchhave, P., et al. Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia. Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).
- Bjerke, M., et al. Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid. Int J Alzheimers Dis. , (2010).
- Dumurgier, J., et al. Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting. Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).
- Mattsson, N., et al. CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program. Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).
- Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers. Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).
- Mattsson, N., et al. Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42. Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).
- Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach. Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).
- Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).
- Leinenbach, A., et al. Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid. Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).
- Li, W., Cohen, L. H. Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix. Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).
- Perret-Liaudet, A., et al. Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis. Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).
- Lewczuk, P., et al. Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides. Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).
- Pannee, J., et al. Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET. J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).
- Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes. Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).
- Vesper, H. W., Thienpont, L. M.
