Introduction
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia y afecta a unos 35 millones de personas en todo el mundo 1. Los signos neuropatológicos característicos de la enfermedad se cree ampliamente que se encuentran en el núcleo de patogénesis de la EA son los ovillos neurofibrilares intracelulares de proteína Tau hiperfosforilada y 2 placas extracelulares que consisten en agregados de beta-amiloide (Aß) péptidos 3. En línea con esto, la evaluación de la patología de la placa in vivo mediante biomarcadores recientemente se ha incluido en los criterios diagnósticos de investigación para 4 dC. Para las mediciones de LCR de 1-42, varios inmunoensayos están disponibles y se utilizan en muchos laboratorios clínicos 5. La concentración de 1-42 en CSF es de aproximadamente 50% menor en los pacientes de AD que en los ancianos cognitivamente normales, lo que refleja la deposición del péptido en las placas en el brain 6, 7.
Estos biomarcadores se analizan utilizando principalmente inmunoensayos (por ejemplo, técnicas basadas en anticuerpos), pero estos ensayos pueden estar influenciadas por los efectos de matriz 8. El uso de inmunoensayos en diferentes plataformas tecnológicas y la falta de estandarización de ensayo 9, 10 hace que la introducción de las concentraciones globales de corte difíciles 11, 12. Un PGR analítico validado permitiría la calibración uniforme de diferentes plataformas de ensayo, lo ideal sería que resulta en una mejor comparabilidad entre las plataformas de análisis y un mejor control de los factores que contribuyen a la variabilidad general de medición.
La cuantificación absoluta de 1-42 usando el método LC-MS / MS desarrollado supera muchos de los problemas asociados con la tecn basada en anticuerposiques. El método, que aparece como un PGR por el Comité Conjunto para la Trazabilidad en Medicina de Laboratorio (JCTLM base de datos de identificación del número C11RMP9), se utiliza para determinar la concentración absoluta de 1-42 en un material de referencia certificado (CRM) para armonizar CSF Aß 1 mediciones de -42 a través de técnicas y plataformas analíticas. El flujo de trabajo descrito debe ser de relevancia para el desarrollo de métodos de referencia candidato para péptidos y proteínas dentro de otras áreas de la medicina.
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Protocol
NOTA: Este protocolo requiere alícuotas de al menos 50 l, con una concentración de 50 mg / ml para cada péptido Aß, como material de partida. Los péptidos Aß se deben disolver en 20% de acetonitrilo (ACN) y solución concentrada de amoníaco 4% en agua desionizada (v / v) y se almacenaron a 80 ° C.
Precaución: Véase la Tabla 1 para información de seguridad.
1. Preparación de las soluciones
- Preparar 100 ml de 20% de ACN y 4% de solución de amoníaco concentrado en agua desionizada (v / v) diluyendo 20 ml de ACN y 4 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 100 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos.
- Preparar 50 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato mediante la disolución de 26,08 g de hidrocloruro de guanidina en agua desionizada hasta un volumen final de 50 mL. Almacenar a 20 ° C y hacer mensual fresco.
- Preparar 200 ml de ácido fosfórico al 4% en agua desionizada (v /v) diluyendo 9,4 ml de ácido concentrado fosfórico (~ 85%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 200 ml con agua desionizada. Almacenar en el refrigerador y hacer semanal fresca.
- Preparar 50 ml de 75% de ACN y solución concentrada de amoniaco al 10% (v / v) en agua desionizada mediante la dilución de 37,5 ml de ACN y 5 ml de amoniaco concentrado (~ 25%) en agua desionizada. Ajustar el volumen final a 50 ml con agua desionizada. Hacer todos los días frescos.
- Descongelar al menos 2,5 ml de CSF humano para los calibradores, obtenidos a partir de muestras sobrantes sin identificación de análisis clínicos de rutina.
- Preparar CSF artificial que contiene Na 150 mM, K 3.0, Ca 1,4 mM, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, y Cl 155 mM en agua desionizada y añadir albúmina de suero bovino a una concentración final de 4 mg / mL. Sólo se necesita 1 ml por cada análisis, pero preparar un gran volumen, que alícuota, y almacenar para uso futuro.
2. Preparación de los calibradores
- Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml 15 NAβ 142 a la 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Preparar 2 ml de 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 50 l de la 4 mg / ml 15 NAβ 142 a 1,95 ml de 20% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Preparar seis soluciones de calibrador (AF) mediante la mezcla de los volúmenes de cada solución se indica en la Tabla 2. Use 0.5, 1.5 y 2 tubos de microcentrífuga ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Preparar los calibradores finales (por duplicado) en 0,5 ml tubos de microcentrífuga mediante la adición de las soluciones de calibración correspondientes y CSF humano de acuerdo con la Tabla 3. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
3. Preparación de la Norma Interna
- Preparar 2 ml de 0,8 mg / ml 1-42 13 CAβ mediante la adición de 32 l de 50 mg / ml 13 CAβ 142 a 1,968 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Preparar 5 ml de 16 ng / ml 13 CAβ 1-42 mediante la adición de 0,1 ml de 0,8 mg / ml a 4,9 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
4. Preparación de la muestra Factor de respuesta
NOTA: El factor de respuesta de determinación (RF) se realiza para determinar la concentración del péptido marcado utilizado para la calibración (15 NAβ 1-42). Esto requiere que la concentración del péptido nativo 1-42 se ha determinado utilizando el análisis de aminoácidos (AAA). Por lo tanto, el volumen y la concentración de alícuotas nativas de péptidos Aß 1-42necesita para cumplir los requisitos de la AAA.
- Preparar 0,5 ml de 4 mg / ml nativa (sin etiqueta) 1-42 mediante la adición de 40 l de 50 mg / ml de Aß 1-42 nativa a 0,46 ml de 20% de ACN y el 4% de amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Preparar a 2 ml de 40 ng / ml de mezcla de nativos y 15 NAβ 1-42 mediante la adición de 20 l de 4 mg / ml de Aß 1-42 nativa y 20 l de 4μg / ml 15 NAβ 1-42 a 1,96 ml de 20% ACN y 4% amoníaco concentrado en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. Mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
- Añadir 20 l de la mezcla de 40 ng / ml a 0,38 ml de CSF artificial en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Preparar duplicados y mezclar en un mezclador de vórtice durante 1 min.
Preparación 5. Muestra
NOTA: Descongelar las muestras a medir a temperatura ambiente sobre un rodillo.
- Añadir 0,18 ml de cada calibrador, factor de respuesta, y la muestra desconocida (incluyendo el control de calidad [CC] muestras, si se usa) a un 1 ml de proteína placa de 96 pozos profundos, de acuerdo con la Figura 1 (suponiendo un plato lleno se utiliza). Asegúrese de añadir las muestras en, o cerca de, la parte inferior de los pozos.
- Añadir 20 l de patrón interno a cada pocillo (es decir, los calibradores, los factores de respuesta, los círculos de calidad, y las incógnitas); es crucial para liberar la gota en el lado del pozo cerca de la superficie de la muestra sin sumergir la punta de pipeta.
- Añadir 0,2 ml de 5 M de guanidina-clorhidrato a cada pocillo.
- Colocar la placa de muestra en un agitador de microplacas y mezclar las muestras durante 45 minutos a 1100 rpm. La frecuencia óptima puede variar dependiendo de la instrumentación. Ajuste la frecuencia y la amplitud de la mezcladora de manera que las soluciones se mezclan a fondo y no hay gotas de estándar interno o CSF se dejan sin mezclar en el lado de los pocillos.
- Añadir 0,2 ml de ácido fosfórico al 4%a cada pocillo. Vortex mezclar brevemente.
6. Extracción en Fase Sólida
NOTA: En todos los de lavado, carga y etapas de elución, aplicar el vacío más bajo posible después de la adición de la solución y aumentar gradualmente a medida que sea necesario para cargar o eluir la solución. Desactivar el vacío entre cada carga y etapa de elución.
- Ponga una bandeja de depósito para los residuos bajo un modo mixto, la placa de intercambio catiónico, extracción en fase sólida de 96 pocillos (SPE) en la cámara de colector de placa de extracción.
- Acondicionar el sorbente SPE mediante la adición de 0,2 ml de metanol a cada pocillo.
- Equilibrar el sorbente mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.
- Transferencia de todas las muestras (aproximadamente 0,62 ml en cada pocillo) de la placa de pozo profundo a la placa de SPE. Usar una pipeta de ocho canales cuando se transfieren las muestras de la placa de pozo profundo a la placa de SPE; que no es crucial para transferir los volúmenes enteros o iguales de todas las muestras, ya que las muestras contienen un pasanteal estándar que compensar las variaciones.
- Lavar el sorbente después de que las muestras han pasado a través mediante la adición de 0,2 ml de ácido fosfórico al 4% a cada pocillo.
- Después de que el disolvente de lavado se eluyó de la absorbente, vuelva a colocar la bandeja de depósito con una placa de recogida o tubos.
- Eluir la muestra del sorbente mediante la adición de dos veces 50 l de 75% ACN / 10% de amoniaco concentrado, y se tenga en cuenta que esta solución requiere un vacío muy bajo para pasar a través del sorbente. Recuerde que debe desactivar el vacío entre cada adición.
- OPCIONAL: Sellar la placa de recogida o tubos y congelar a -80 ° C. Retire el sello de la placa de recogida o tubos antes de proceder con el paso 6.8.2.
- Seque los eluatos mediante el uso de centrifugación al vacío (sin aplicación de calor); esto puede tomar de una a varias horas, dependiendo de la centrífuga de vacío.
- Sellar los recipientes y congelar a -80 ° C.
7. Líquido chromatografía
- Preparar la fase móvil A (5% de ACN y 0,3% de amoníaco concentrado en agua desionizada [v / v]), B (4% de agua desionizada y 0,1% de amoníaco concentrado en ACN [v / v]), y el lavado de la aguja (50% de ACN y 4% de amoniaco concentrado en agua desionizada [v / v]).
- Por 500 ml de fase móvil A, se añaden 25 ml de ACN y 1,5 ml de amoníaco concentrado al agua desionizada. Ajustar el volumen final a 500 ml con agua desionizada.
- Por 500 ml de fase móvil B, añadir 500 l de amoníaco concentrado y 25 ml de agua desionizada a ACN. Ajustar el volumen final de 500 ml con ACN.
- Preparar 250 ml de lavado de la aguja mediante la adición de 120 ml de ACN y 10 ml de amoníaco concentrado a agua desionizada. Ajustar el volumen final a 250 ml con agua desionizada.
- Ponga la fases A y B y móvil de lavado aguja botellas abiertas en un baño de ultrasonidos durante 20 min antes de su uso con el sistema LC
- Disolver cada muestra con 25 l de 20% de ACN y 4% concentraciónTed solución de amoniaco y colocarlos en un agitador durante 20 min. Centrifugar las muestras abajo y colocarlos en el inyector automático (mantenga a 7 ° C).
- Inyectar 20 l de muestra en una columna monolítica 1 x 250 mm 2 poliestireno-divinilbenceno (de fase inversa) mantenida a 50 ° C.
- Utilice el gradiente LC se muestra en la Tabla 4 con una velocidad de flujo de 0,3 mL / min. Desviar los dos primeros y los últimos cinco minutos a los residuos (post-columna) mediante una válvula de desvío para reducir la contaminación del espectrómetro de masas.
8. Análisis de espectrometría de masas
NOTA: Estos parámetros se utilizan para un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap equipado con fuente de ionización por electrospray Aheated.
- Establecer los parámetros de la fuente de iones de acuerdo con la Tabla 5.
- Coloque el instrumento MS para aislar las 4+ estados de carga de Aß 1-42 nativa (1,129.48 masaratio [m / z] a carga), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), y 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) en el analizador de masas cuadrupolar con una anchura de aislamiento de 2,5 m / z.
- Fragmentar los péptidos aislados en la celda de colisión con una energía de colisión normalizada (NCE) de 17,0. Esto podría ser necesario ajustar para cada instrumento, incluso del mismo tipo (y especialmente si se utiliza otro tipo de instrumentos, como un triple cuadrupolo MS).
- Registrar los espectros fragmento con una resolución de 17.500, con un objetivo de control automático de ganancia de 2 x 10 5 cargos y un tiempo de inyección máxima de 250 ms.
9. Proceso de Datos
- Utilizar la suma de los iones de productos (con una tolerancia de masa de ± 250 unidades de masa mili [MMU]) en la Tabla 6 para calcular las áreas cromatográficos para cada péptido. Tenga en cuenta que los tipos de iones y los números se muestran sólo para Aß nativa
- Determinar el factor de respuesta promedio de las dos muestras de factor de respuesta dividiendo el área bajo la curva (pico cromatográfico) de 15 NAβ 1-42 con el área bajo la curva de nativo 1-42.
- Ajustar la concentración de la 15 NAβ 1-42 utilizada para la calibración mediante la multiplicación con el factor de respuesta calculado en el paso 9.2.
- Construir una curva de calibrado poniendo las relaciones de área del 15 al 13 de NAβ 1-42 1-42 CAβ de los dos juegos de calibradores frente a la concentración.
- Calcular la pendiente y la intersección de la curva de calibración mediante regresión lineal.
- Calcular la proporción de área de Aß nativo 1-42 al estándar interno (13 CAβ 1-42) para ONUmuestras conocidas.
- Extrapolar la concentración de muestras desconocidas a partir de la curva de calibración utilizando la pendiente y la intersección obtenido en el paso 9.5.
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Representative Results
La configuración de la placa en la Figura 1 se utiliza para un plato lleno de muestras. Si se van a analizar un menor número de muestras desconocidas, el segundo calibrador, conjuntos de RF, y de control de calidad debe ser colocado después de la primera mitad de las muestras desconocidas.
Como se ve en la Figura 2, los calibradores se encuentran cerca de la línea de regresión, con bajas desviaciones estándar. Este método tiene un nivel más bajo de cuantificación de 150 pg / ml y un nivel superior de cuantificación de 4000 pg / mL. La desviación estándar residual de la calibración debe por supuesto ser lo más bajo posible. Si la calibración no es lineal, la carrera debe ser desechada (dependiendo de la gravedad), y la desviación es más probable debido a la técnica de pipeteado incorrecto y / o errores en la dilución de los calibradores. El coeficiente de variación (CV) de repeticiones debe ser inferior a 20%, pero preferiblemente por debajo de 10%.
ogether.within-page = "1"> El nativo de 15 N y 13 CAβ 1-42 eluyen de la columna de LC al mismo tiempo (ya que sólo difieren en el nivel isotópica), con cerca de picos simétricos y sin colas significativa (Figura 3 ). Al menos diez mediciones deben realizarse para cada pico cromatográfico y se pueden ajustar con el tiempo máximo de inyección en el método de instrumentos. Los tres péptidos se pueden medir de forma simultánea para todas las mediciones de calibración (RF, y incógnitas) durante el análisis de MS. Sin embargo, si la sensibilidad del método es subóptima, sólo los péptidos de interés deben medirse para cada inyección (es decir., Sólo miden 15 N- y 13 CAβ 1-42 para los calibradores, nativo y 15 NAβ 1-42 para las muestras de RF, y nativo y 13 CAβ 1-42 de muestras desconocidas).
Figura 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figura 1: Distribución de las placas de SPE y pozos profundos. disposición típica de los calibradores (AF), muestra el factor de respuesta (RF), las muestras de control de calidad (QC), y las incógnitas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Curva de calibración. Curva de calibración construida usando 15 NAβ 1-42 a 172, 572, 1144, 2287, 3431, y 4574 pg / ml (ajustado usando el factor de respuesta) y 13 CAβ 1-42 como patrón interno en CSF humano (n = 2) . La relación de área de 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 se representa (eje Y)frente a la concentración (eje X). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cromatograma. Cromatograma de 0.500 ng / ml nativa (endógena) 1-42 (panel superior) y 1,6 ng / ml 13 CAβ 1-42 (panel inferior) en el LCR humano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cuantificación de 1-42 desconocida en muestras desconocidas <./ strong> La relación de área de pico se calcula dividiendo el área del pico 1-42 cromatográfico nativo con el patrón interno (13 CAβ 1-42) área del pico cromatográfico. La concentración de 1-42 nativo en la muestra se extrapola de la curva de calibración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Información de seguridad. Indicaciones de seguridad para productos químicos utilizados para este protocolo.
| la solución calibradora | Volumen de 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 solución (ml) Volumen de 20% de ACN y 4% de amoniaco (mL) | El volumen final (ml) | 15 final NAβ 1-42 concentración (ng / ml) | |
| UN | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| segundo | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| do | 0.20 | 0.80 | 1.00 | 20.00 |
| re | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| mi | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1.50 |
Tabla 2: Las soluciones de calibrador. soluciones de calibrador preparan en 20% de ACN y 4% de amoniaco concentradoutilizado para clavar los calibradores de LCR.
| calibrador | Volumen de solución calibrador correspondiente (mL) | Volumen de CSF humano (ml) | El volumen final (ml) | 15N-1-42 final de concentración (ng / mL) |
| UN | 0,02 (A) | 0.18 | 0.20 | 4.00 |
| segundo | 0.02 (B) | 0.18 | 0.20 | 3.00 |
| do | 0,02 (C) | 0.18 | 0.20 | 2.00 |
| re | 0,02 (D) | 0.18 | 0.20 | 1.00 |
| mi | 0.02 (E) | 0.18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0.18 | 0.20 | 0.15 |
Tabla 3: Calibradores. Calibradores preparados en CSF humano.
| Tiempo (min) | Fase móvil B% |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabla 4: gradiente de LC. El gradiente de LC se utiliza con un caudal constante de 300 l / min.
| Parámetro | Valor |
| gas envolvente | 50 |
| gas auxiliar | 6 |
| la corriente de pulverización | 4.4 kV |
| S-lente RF | 61 |
| temperatura del calentador | 190 ° C |
| temperatura capilar | 350 ° C |
Tabla 5: Ajustes de la fuente de iones. Los parámetros para la fuente de iones de engaste para el software del instrumento melodía.
| ión precursor | iones de productos |
| Nativo 1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915.19 (B334 +), 943.21 (b344 +), 975.98 (B354 +), 1000.74 (B364 +), 1029.51 (B384 +), 1054.03 (b394 +), 1078.79 (B404 +), 1107.06 (B414 +), 1163.23 (B313 +), 1200.25 (b323 +), 1257.29 (B343 +), 1300.96 (B353 +), 1333.66 (B363 +), 1372.00 (B383 +), 1405.02 (b393 +) |
| 15N-1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926.41, 954.68, 987.95, 1012.71, 1041.22, 1066.99, 1091.75, 1120.28, 1177.18, 1215.55, 1272.58, 1316.92, 1349.94, 1388.63, 1422.31 |
| 13C-1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955.33, 985.11, 1019.37, 1045.14, 1074.65, 1100.67, 1126.69, 1156.40, 1253.43, 1313.14, 1358.50, 1393.19, 1432.21, 1466.90 |
Tabla 6: Los iones utilizados para la cuantificación. Los 4+ estados de carga de los iones precursores se aíslan en el analizador de masas cuadrupolar, con una anchura de aislamiento de 2,5 m / z. Los iones producto (con una tolerancia de ± 250 masas MMU) se utilizan para calcular las áreas cromatográficas para cada péptido. tipo y número de iones son ONLY mostrada por los iones de productos nativos 1-42, ya que son los mismos para ambos 15 y 13 NAβ 1-42 CAβ 1-42.
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Discussion
Para el método descrito, en vez de usar una matriz sustituta, se utilizó el enfoque sustituto analito 13, 14, 15, 16, que permite la calibración en CSF humano. El enfoque analito sustituto implica dos estándares marcados isotópicamente diferentes. Un (15 NAβ 142) se utiliza para generar la curva de calibración en CSF humano, mientras que otro (13 CAβ 142) se utiliza como el estándar interno. Desconocido endógenos concentraciones Aß 142 son entonces extrapolar a partir de la curva de calibración construida usando el 142/13 razón 15 NAβ CAβ 142 por el Aß 142/13 relación calculada endógena CAβ 142. Se utilizó el enfoque analito sustituto ya que no hay CSF libre de analito disponibles, y bajo Aß 142 de recuperaciónse observó al utilizar nativa Aß 142 en una matriz sustituta durante el desarrollo del método.
Desde el 15 de NAβ 142 y Aß nativa 142 pueden dar diferentes respuestas en la MS, la concentración de 15 NAβ 142 se ajusta mediante la medición de un-una muestra de líquido cefalorraquídeo artificial de RF que contiene concentraciones iguales de 15 NAβ 142 y Aß nativa 142, con una concentración conocida determinado por AAA.The factor de respuesta puede diferir entre diferentes espectrómetros de masas debido a las posibles variaciones en la pureza isotópica del 15 péptido N-etiquetados entre lotes. Por lo tanto, el factor de respuesta debe ser determinado para cada día de medición.
Los pasos más críticos en este protocolo son la preparación de los calibradores y las muestras de RF. Péptidos Aß, especialmente 1-42, son muy hidrofóbica y se adhieren fácilmente a las puntas de pipeta unatubos nd superficies 8, 17, 18. Para reducir al mínimo la pérdida de péptidos Aß durante el pipeteado, es extremadamente importante para saturar las puntas de pipeta antes de la entrega. Preferiblemente, tres volúmenes de solución de péptido deben desecharse antes de la entrega a una nueva solución tubo que contiene. Dependiendo del volumen y la concentración de la solución madre, esto no siempre es posible. El segundo mejor enfoque es, por supuesto, a la pipeta la solución de péptido arriba y abajo tres veces antes de la entrega. Por la misma razón, es importante la utilización de tamaños apropiados para los tubos, evitando grandes volúmenes vacíos.
Los datos publicados anteriormente para el método muestran que la recuperación estaba dentro de 100% (15%) 15. Los errores relativos para los calibradores de respaldo calculada estaba por debajo de 15% de toda la gama definida por la curva del calibrador 19.
Uno olimitación bvious de esta técnica es que es de bajo rendimiento en comparación con los inmunoensayos automatizados. Sin embargo, el propósito del método descrito es de alta precisión y no el rendimiento. Este método también se puede ampliar para incluir Aß 1-38 y Aß 1- 40, que son más cortos 19. Otra limitación de este método es que el operador necesitará una amplia formación espectrometría de masas antes de ejecutar el análisis en el instrumento.
La cuantificación utilizando inmunoensayos depende de la interacción entre el anticuerpo y el antígeno. Esta interacción puede verse afectada por la presencia de componentes de la muestra que puedan interferir o competir con la interacción. Además, la interacción también puede verse afectada por la conformación del antígeno. Estos efectos son difíciles de controlar y se cree que son la razón principal por la que ha sido difícil armonizar los resultados entre las plataformas de inmunoensayo y entre laboratorios. beccuantificación ause con MS se basa en contar directamente las moléculas diana con relación a un estándar estable, marcado con isótopo, la cuantificación es absoluta y, en general no afectado por tales efectos de matriz. Además, las mediciones de proteína de diagnóstico por inmunoensayos deben ser apoyados por una cadena ininterrumpida de los procedimientos de medición de orden superior y materiales, desde validado LC-MS / MS y estables, estándares internos marcados con isótopos a los RMP y un CRM, mejorando así la compatibilidad y fiabilidad de los resultados 20, 21.
En conclusión, la PGR se ha descrito para la medición de Aß 142 en el LCR es un paso importante en el desarrollo de un CRM que ayudará a establecer la concentración general de corte para Aß 142 en el LCR. Exactos puntos de corte son muy importantes para diagnosticar con precisión AD temprana y son de suma importancia cuando los nuevos tipos de fármacos modificadores de la enfermedad llegan a la clínica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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