Introduction
La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence et affecte environ 35 millions de personnes à travers le monde 1. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie largement soupçonné d'être au cœur de la pathogenèse de la MA sont des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires de protéine tau hyperphosphorylée 2 et plaques extracellulaires composées de agrégées bêta-amyloïde (Aß) peptides 3. Conformément à cela, l'évaluation de la plaque pathologie in vivo par des biomarqueurs a récemment été inclus dans les critères diagnostiques de recherche pour AD 4. Pour les mesures de LCR de Aß 1-42, plusieurs analyses immunologiques sont disponibles et sont utilisés dans de nombreux laboratoires cliniques 5. La concentration de Aß 1-42 dans le LCR est d' environ 50% plus faible chez les patients AD que chez les sujets âgés normaux sur le plan cognitif, ce qui reflète le dépôt du peptide dans les plaques dans le brain 6, 7.
Ces biomarqueurs sont principalement analysés en utilisant des immunoessais (ie, les techniques à base d' anticorps), mais ces essais peuvent être influencés par les effets de matrice 8. L'utilisation d'immunoessais sur différentes plates - formes technologiques et le manque de dosage normalisation 9, 10 permet l'introduction de concentrations de coupure mondiales difficiles 11, 12. Un RMP analytiquement validé permettrait l'étalonnage uniforme des différentes plates-formes de dosage, idéalement résultant en une meilleure comparabilité entre les plates-formes d'analyse et un meilleur contrôle des facteurs qui contribuent à la variabilité globale de mesure.
La quantification absolue de Aß 1-42 en utilisant la méthode LC-MS / MS développé surmonte un grand nombre des problèmes associés à la techn à base d' anticorpsiques. La méthode, répertorié comme un PGR par le Comité commun pour la traçabilité en médecine de laboratoire (JCTLM base de données le numéro d' identification de C11RMP9), sera utilisé pour déterminer la concentration absolue de Aß 1-42 dans un matériau de référence certifié (CRM) pour harmoniser CSF Aß 1 mesures -42 à travers des techniques et des plates - formes analytiques. Le workflow décrit devrait être de l'intérêt pour le développement de méthodes de référence des candidats pour des peptides et des protéines dans d'autres domaines de la médecine.
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Protocol
NOTE: Ce protocole exige des aliquotes d'au moins 50 ul, avec une concentration de 50 pg / ml pour chaque peptide Aß, en tant que matériau de départ. Les peptides Aß doivent être dissous dans 20% d'acétonitrile (ACN) et une solution à 4% d'ammoniac concentrée dans de l'eau déminéralisée (v / v) et stockées à 80 ° C.
Attention: Voir le tableau 1 pour les informations de sécurité.
1. Préparation des solutions
- Préparer 100 ml de 20% d'ACN et de 4% d'une solution concentrée d'ammoniaque dans de l'eau déminéralisée (v / v) en diluant 20 ml d'ACN et 4 ml d'ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 100 mL avec de l'eau déminéralisée. Faire frais tous les jours.
- Préparer 50 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate par dissolution de 26,08 g de chlorhydrate de guanidine dans de l'eau déminéralisée jusqu'à un volume final de 50 ml. Conserver à 20 ° C et de faire mensuelle frais.
- Préparer 200 ml de 4% d'acide phosphorique dans de l'eau déminéralisée (v /v) en diluant 9,4 ml d'acide phosphorique concentré (~ 85%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 200 mL avec de l'eau déminéralisée. Conserver au réfrigérateur et de faire chaque semaine.
- Préparer 50 ml de 75% d'ACN et 10% de solution d'ammoniaque concentrée (v / v) dans de l'eau déminéralisée en diluant 37,5 ml d'ACN et 5 ml d'ammoniaque concentré (~ 25%) dans de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 50 ml avec de l'eau déminéralisée. Faire frais tous les jours.
- Décongeler au moins 2,5 mL de CSF humain pour les étalons, obtenus à partir de dépersonnalisées échantillons restants de l'analyse clinique de routine.
- Préparer CSF artificiel contenant 150 mM de Na, K 3,0 mM, 1,4 mM de Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM de P et 155 mM de Cl dans de l'eau déminéralisée et on ajoute de l'albumine de sérum bovin à une concentration finale de 4 mg / ml. Seulement 1 mL est nécessaire par analyse, mais préparer un grand volume, aliquote, et magasin pour une utilisation future.
2. Préparation des calibrateurs
- Préparer 0,5 ml de 4 pg / mL 15 NAβ peptide 1-42 par addition de 40 ul de 50 ug / ml 15 NAβ 142 à 0,46 ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Préparer 2 mL de 100 ng / ml 15 NAβ peptide 1-42 par addition de 50 ul de la 4 pg / ml 15 NAβ 142 à 1,95 ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Préparer six solutions d'étalonnage (AF) en mélangeant des volumes de chacune des solutions indiquées dans le tableau 2. Utiliser 0,5, 1,5 et 2 ml microtubes. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Préparer les calibrateurs finales (en double), en ml tubes 0,5 à centrifuger en ajoutant les solutions d'étalonnage correspondantes et CSF humain selon le Tableau 3. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
3. Préparation de l'étalon interne
- Préparer 0,8 ml de 2 pg / ml de peptide 13 CAβ 1-42 par addition de 32 pi de 50 pg / ml 13 CAβ 142 à 1,968 ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentré dans un microtube de 2 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Préparer 5 ml de 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 peptide en ajoutant 0,1 mL de 0,8 pg / ml à 4,9 ml de 20% d' ACN et 4% d' ammoniac concentré dans un tube 5 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
4. Préparation de l'échantillon facteur de réponse
NOTE: Le facteur de réponse (RF) , la détermination est effectuée pour déterminer la concentration du peptide marqué utilisé pour le calibrage (15 NAβ 1-42). Cela exige que la concentration du peptide natif Aß 1-42 a été déterminée par analyse des acides aminés (AAA). Ainsi, le volume et la concentration des fractions aliquotes de peptide Aß 1-42 nativesdoivent satisfaire aux exigences de l'AAA.
- Préparer 0,5 ml de 4 ug / ml natif (sans étiquette) Aß 1-42 par addition de 40 pi de 50 pg / ml natif Aß 1-42 à 0,46 ml de 20% d' ACN et de 4% d' ammoniac concentrée dans un tube de microcentrifugation de 0,5 ml. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Préparer un 2-ml 40 ng / ml de mélange natif et 15 NAβ 1-42 en ajoutant 20 pi de 4 pg / mL natif Aß 1-42 et 20 pi de 4 pg / mL 15 NAβ 1-42 à 1,96 mL de 20% ACN et 4% concentrés ammoniac dans un tube 2 ml de microcentrifugation. Mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
- Ajouter 20 ul de 40 ng / mL mélange à 0,38 ml de CSF artificiel dans un ml tube de 0,5 à centrifuger. Préparer les doublons et mélanger dans un mélangeur à vortex pendant 1 min.
Préparation 5. Sample
NOTE: Décongeler les échantillons à mesurer à la température ambiante sur un rouleau.
- Ajouter 0,18 ml de chaque calibrateur, facteur de réponse et échantillon inconnu (y compris le contrôle de la qualité [QC] échantillons, le cas échéant) à un 1 ml de protéine plaque de 96 puits profonds, selon la figure 1 ( en supposant une assiette pleine est utilisée). Assurez-vous d'ajouter les échantillons, ou à proximité, le fond des puits.
- Ajouter 20 pi de standard interne à chaque puits (c. -à- calibrateurs, les facteurs de réponse, Qcs et inconnues); il est essentiel de libérer la goutte sur le côté du puits à proximité de la surface de l'échantillon, sans l'immerger la pointe de la pipette.
- Ajouter 0,2 ml de 5 M de guanidine-chlorhydrate à chaque puits.
- Placer la plaque d'échantillon sur un agitateur de microplaque et mélanger les échantillons pendant 45 min à 1100 rpm. La fréquence optimale peut varier en fonction de l'instrumentation. Régler la fréquence et l'amplitude du mélangeur, de sorte que les solutions sont soigneusement mélangés, et des gouttes de l'étalon interne ou le LCR sont laissées sans mélange sur le côté du puits.
- Ajouter 0,2 ml de 4% d'acide phosphoriquechaque puits. Vortex mélanger brièvement.
6. extraction en phase solide
NOTE: Dans tous les laver, le chargement, et les étapes d'élution, appliquer le vide le plus bas possible après l'ajout de la solution et d'augmenter graduellement au besoin pour charger ou éluer la solution. Désactivez le vide entre chaque chargement et l'étape d'élution.
- Mettez un plateau de réservoir pour les déchets sous un mode mixte, d'échange de cations, 96 puits d'extraction en phase solide (SPE) plaque dans la chambre de collecteur de plaque d'extraction.
- Conditionner le sorbant SPE en ajoutant 0,2 ml de methanol à chaque puits.
- Équilibrer le sorbant en y ajoutant 0,2 ml de 4% d'acide phosphorique à chaque puits.
- Transférer tous les échantillons (environ 0,62 ml dans chaque puits) de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE. Utiliser une pipette à huit canaux lors du transfert des échantillons de la plaque de puits profonds à la plaque de SPE; il est essentiel de transférer les volumes entiers ou égaux de tous les échantillons, car les échantillons contiennent un stagiairenorme al qui compenser les variations.
- Laver le sorbant après que les échantillons ont traversé en y ajoutant 0,2 ml de 4% d'acide phosphorique à chaque puits.
- Après que le solvant de lavage est élue du sorbant, remplacer le plateau de réservoir d'une plaque ou les tubes collection.
- Éluer l'échantillon à partir du sorbant par deux fois en ajoutant 50 ul de 75% d'ACN / 10% d'ammoniaque concentrée et notez que cette solution nécessite une dépression très faible pour passer à travers le sorbant. Rappelez-vous de désactiver le vide entre chaque addition.
- OPTION: Sceller la plaque ou les tubes de collecte et de les congeler à -80 ° C. Retirez le joint de la plaque ou les tubes collection avant de passer à l'étape 6.8.2.
- Sécher les éluats en utilisant la centrifugation à vide (sans appliquer de la chaleur); cela peut prendre une à plusieurs heures, en fonction de la centrifugeuse sous vide.
- Sceller les récipients et les congeler à -80 ° C.
7. Liquid Chromatophie
- Préparer la phase mobile A (5% ACN et 0,3% d' ammoniac concentré dans de l' eau déminéralisée [v / v]), B (4% d' eau déminéralisée et 0,1% d' ammoniac concentré dans ACN [v / v]), et lavage de l' aiguille (50% ACN et 4% ammoniac concentré dans de l' eau déminéralisée [v / v]).
- Pour 500 ml de phase mobile A, ajouter 25 ml d'ACN et 1,5 ml d'ammoniaque concentrée à l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 500 mL avec de l'eau déminéralisée.
- Pour 500 ml de phase mobile B, ajouter 500 ul d'ammoniaque concentrée et 25 ml d'eau déminéralisée à ACN. Ajuster le volume final à 500 ml avec ACN.
- Préparer 250 ml de lavage de l'aiguille en y ajoutant 120 ml d'ACN et 10 ml d'ammoniaque concentré à de l'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 250 mL avec de l'eau déminéralisée.
- Mettez la phase mobile A et B et de lavage de l'aiguille des bouteilles ouvertes dans un bain de sonication pendant 20 minutes avant de l'utiliser avec le système de LC
- Dissoudre chaque échantillon avec 25 ul de 20% d'ACN et 4% concentrasolution d'ammoniaque ted et les placer sur un agitateur pendant 20 min. Centrifuger bas les échantillons et les placer dans l'échantillonneur automatique (garder à 7 ° C).
- Injecter 20 ul d'échantillon à raison de 1 x 250 mm 2 polystyrènedivinylbenzène (phase inverse) de la colonne monolithique maintenue à 50 ° C.
- Utiliser le gradient LC indiqué dans le Tableau 4 avec un débit de 0,3 mL / min. Détourner les deux premiers et les cinq dernières minutes à perdre (post-colonne) en utilisant une vanne de dérivation pour réduire la contamination du spectromètre de masse.
Analyse 8. spectrométrie de masse
REMARQUE: Ces paramètres ont été utilisés pour un spectromètre de masse hybride quadripolaire-Orbitrap équipé avec une source d'ionisation électrospray aheated.
- Définir les paramètres de la source d'ions conformément au tableau 5.
- Réglez l'instrument MS pour isoler les 4+ états de charge de Aß natif 1-42 (1,129.48 masse-rapport [m / z] à charge), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), et 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) dans la masse quadripolaire analyseur avec une largeur d'isolement de 2,5 m / z.
- Fragment les peptides isolés dans la cellule de collision avec une énergie de collision normalisée (NCE) de 17,0. Cela pourrait avoir besoin d'être réglé pour chaque instrument, même du même type (et en particulier en cas d'utilisation d'autres types d'instruments, comme un triple quadripôle MS).
- Enregistrer les spectres de fragments avec une résolution de 17.500, avec une cible de commande automatique de gain de 2 x 10 5 charges et une durée d'injection maximale de 250 ms.
9. Traitement des données
- Utilisez la somme des ions produits (avec une tolérance de masse de ± 250 unités de masse milli [mmu]) dans le tableau 6 pour calculer les zones chromatographiques pour chaque peptide. Notez que les types et le nombre d'ions ne sont indiqués que pour Aß natif
- Déterminer le facteur de réponse moyen des deux échantillons de facteur de réponse en divisant la surface sous la courbe (pic chromatographique) de 15 NAβ 1-42 avec la zone sous la courbe de natif Aß 1-42.
- Ajuster la concentration du 15 NAβ 1-42 utilisée pour l' étalonnage en le multipliant par le facteur de réponse calculé à l' étape 9.2.
- Construire une courbe d'étalonnage en traçant les rapports de surface de 15 NAβ 1-42 à 13 CAβ 1-42 des deux ensembles de calibrateurs contre la concentration.
- Calculer la pente et l'ordonnée à l'origine de la courbe d'étalonnage en utilisant une régression linéaire.
- Calculer le rapport de surface de Aß natif 1-42 à l'étalon interne (13 CAβ 1-42) pour nondes échantillons connus.
- Extrapoler la concentration des échantillons inconnus à partir de la courbe d'étalonnage en utilisant la pente et l'ordonnée à l'origine obtenue à l'étape 9.5.
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Representative Results
La configuration de la plaque à la figure 1 est utilisé pour une assiette pleine d'échantillons. Si moins d'échantillons inconnus sont à analyser, la deuxième calibrateur, RF, et QC ensembles doit être placé après la première moitié des échantillons inconnus.
Comme on le voit sur la figure 2, les calibrateurs sont proches de la ligne de régression, avec de faibles écarts - types. Cette méthode présente un niveau de quantification de 150 pg / ml et un niveau supérieur de quantification de 4000 pg / ml. L'écart-type résiduel de l'étalonnage doit évidemment être aussi faible que possible. Si l'étalonnage est non-linéaire, la course doit être jeté (selon la gravité), et l'écart est très probablement due à la technique et / ou des erreurs pipetage incorrect dans la dilution de calibrateurs. Le coefficient de variation (CV) de réplicats doit être inférieure à 20%, mais de préférence inférieure à 10%.
ogether.within-page = "1"> Le natif 15 N- et 13 CAβ 1-42 éluer de la colonne LC simultanément (car ils ne diffèrent que sur le plan isotopique), avec près de pics symétriques et sans queue significative (Figure 3 ). Au moins dix mesures doivent être effectuées pour chaque pic chromatographique et peut être ajustée avec le temps d'injection maximale dans le procédé de l'instrument. Les trois peptides peuvent être mesurés simultanément pour toutes les mesures (calibration, RF et inconnues) au cours de l'analyse MS. Toutefois, si la sensibilité de la méthode est suboptimale, seuls les peptides d'intérêt doivent être mesurés pour chaque injection (ie., Ne mesurent que 15 N et 13 CAβ 1-42 pour calibrateurs, natif et 15 NAβ 1-42 pour les échantillons RF, et natif et 13 CAβ 1-42 pour les échantillons inconnus).
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Figure 1: Les plans des plaques de SPE et de puits profonds. Aménagement typique des calibrateurs (AF), échantillon de facteur de réponse (RF), des échantillons de contrôle de qualité (QC), et inconnues. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Courbe d'étalonnage. Courbe d'étalonnage construite en utilisant 15 NAβ 1-42 à 172, 572, 1144, 2287, 3431 et 4574 pg / mL (ajusté à l' aide du facteur de réponse) et 13 CAβ 1-42 comme étalon interne dans le LCR humain (n = 2) . Le rapport de surface de 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 est tracée (axe Y)fonction de la concentration (axe X). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Chromatogramme. Chromatogramme de 0,500 ng / mL natif (endogène) Aß 1-42 (panneau supérieur) et 1,6 ng / mL 13 CAβ 1-42 (panneau du bas) dans le LCR humain. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Quantification de l' inconnu Aß 1-42 dans des échantillons inconnus <./ strong> Le rapport de la surface de crête est calculé en divisant le Aß 1-42 zone de pic chromatographique native avec l'étalon interne (13 CAβ 1-42) de surface de pic chromatographique. La concentration du peptide Aß 1-42 natif dans l'échantillon est extrapolée à partir de la courbe d'étalonnage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Informations de sécurité. Consignes de sécurité pour les produits chimiques utilisés pour ce protocole.
| Solution de calibrateur | Volume de 100 ng / ml 15 NAβ 1-42 solution (ml) Volume de 20% ACN et 4% d' ammoniac (ml) | Le volume final (ml) | 15 concentration finale NAβ 1-42 (ng / ml) | |
| UNE | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| B | 0,15 | 0,35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0,80 | 1.00 | 20.00 |
| ré | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0,05 | 0,95 | 1.00 | 5,00 |
| F | 0,03 | 1,97 | 2.00 | 1.50 |
Tableau 2: solutions de calibrateur. solutions calibrateur préparées dans 20% d'ACN et 4% d'ammoniac concentréutilisé pour dopage calibrateurs CSF.
| calibrateur | Volume de la solution étalon correspondante (ml) | Volume du CSF humain (ml) | Le volume final (ml) | 15N concentration finale de Aß 1-42 (ng / ml) |
| UNE | 0,02 (A) | 0,18 | 0.20 | 4,00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0,02 (C) | 0,18 | 0.20 | 2.00 |
| ré | 0,02 (D) | 0,18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0,02 (E) | 0,18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0.20 | 0,15 |
Tableau 3: calibrateurs. Calibrateurs préparés CSF humain.
| Temps (min) | Phase mobile B% |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| dix | 5 |
| 15 | 5 |
Tableau 4: gradient LC. Le gradient LC est utilisé avec un débit constant de 300 ul / min.
| Paramètre | Valeur |
| gaz de gaine | 50 |
| gaz auxiliaire | 6 |
| Tension de pulvérisation | 4,4 kV |
| S-lentille RF | 61 |
| la température de chauffage | +190 ° C |
| température de Capillaires | +350 ° C |
Tableau 5: Réglages de la source d' ions. Les paramètres de la source d'ions pour être mis dans le logiciel instrument de musique.
| ion précurseur | Des ions de produit |
| Natif Aß 1-42 (m / z 1129,58, 4+) | 915,19 (B334 +), 943,21 (b344 +), 975,98 (B354 +), 1000,74 (B364 +), 1029,51 (B384 +), 1054.03 (b394 +), 1078,79 (B404 +), 1107,06 (B414 +), 1163,23 (B313 +), 1200,25 (B323 +), 1257,29 (B343 +), 1300,96 (b353 +), 1333,66 (B363 +), 1372,00 (B383 +), 1405,02 (b393 +) |
| 15N-Aß 1-42 (m / z 1143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1012,71, 1041,22, 1066,99, 1091,75, 1120,28, 1177,18, 1215,55, 1272,58, 1316,92, 1349,94, 1388,63, 1422,31 |
| 13C-Aß 1-42 (m / z 1179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1019,37, 1045,14, 1074,65, 1100,67, 1126,69, 1156,40, 1253,43, 1313,14, 1358,50, 1393,19, 1432,21, 1466,90 |
Tableau 6: Ions utilisés pour la quantification. Les 4+ états de charge des ions précurseurs sont isolés dans le quadripôle analyseur de masse, avec une largeur d'isolement de 2,5 m / z. Les ions produits (avec une tolérance de masse de ± 250 mmu) sont utilisés pour calculer les zones chromatographiques pour chaque peptide. types et le nombre d'ions sont ONLy montre des ions produits Aß 1-42 indigènes, car ils sont les mêmes pour les 15 NAβ 1-42 et 13 CAβ 1-42.
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Discussion
Pour le procédé décrit, au lieu d'utiliser une matrice de substitution, on a utilisé la méthode de remplacement de l' analyte 13, 14, 15, 16, ce qui permet un calibrage dans le LCR humain. L'approche de l'analyte de substitution implique deux normes marqués par des isotopes différents. L' une (15 NAβ 142) est utilisé pour générer la courbe d'étalonnage dans le LCR humain, alors que l' autre (13 CAβ 142) est utilisé comme étalon interne. Inconnu 142 Aß endogène concentrations sont ensuite extrapolées à partir de la courbe d'étalonnage construite en utilisant la 15 NAβ 142/13 CAβ 142 par rapport endogène Aß 142/13 142 CAβ rapport calculé. L'approche de l' analyte de substitution a été utilisé car il n'y a pas de CSF sans analyte disponible, et une faible Aß 142 récupérationa été observée lors de l' utilisation de Aß natif 142 dans une matrice de substitution au cours du développement de la méthode.
Etant donné que 15 NAβ 142 et Aß natif 142 peuvent donner des réponses différentes dans la sclérose en plaques, la concentration de 15 NAβ 142 est réglée par la mesure d' un échantillon d' un RF échantillon de LCR synthétique contenant des concentrations égales de 15 NAβ 142 et Aß natif 142, avec une concentration connue peptide déterminé par AAA.The facteur de réponse peut varier entre les différents spectromètres de masse en raison de variations possibles de la pureté isotopique du 15 N marqué entre les lots. Ainsi, le facteur de réponse doit être déterminé pour chaque jour de mesure.
Les étapes les plus critiques dans ce protocole sont la préparation des calibrateurs et les échantillons RF. Peptides Aß, en particulier Aß 1-42, sont très hydrophobes et facilement coller à des embouts de pipette untubes nd surfaces 8, 17, 18. Afin de minimiser la perte de peptides Aß pendant le pipetage, il est extrêmement important de saturer les embouts de pipette avant livraison. De préférence, les trois volumes de solution peptidique doivent être éliminés avant la livraison d'une nouvelle solution contenant du tube. En fonction du volume et de la concentration de la solution mère, il est pas toujours possible. La deuxième meilleure approche est bien sûr de la pipette la solution de peptide et à trois reprises avant la livraison. Pour la même raison, il est important d'utiliser des tailles appropriées pour les tubes, en évitant de grands volumes vides.
Les données publiées précédemment pour la méthode montrent que la reprise était à moins de 100% (15%) 15. Les erreurs relatives pour les calibrateurs de retour calculée étaient en dessous de 15% de l'ensemble de la gamme définie par la courbe d'étalonnage 19.
un obvious limitation de cette technique est qu'il est à faible débit par rapport à des dosages immunologiques automatisés. Cependant, le but du procédé décrit est une haute précision et non le débit. Cette méthode peut également être élargi pour inclure Aß 1-38 et Aß 1- 40, qui sont plus courtes 19. Une autre limitation de cette méthode est que l'opérateur aura besoin une formation approfondie de la spectrométrie de masse avant de lancer l'analyse sur l'instrument.
La quantification en utilisant les dosages immunologiques dépend de l'interaction entre l'anticorps et l'antigène. Cette interaction pourrait être affectée par la présence de composants de l'échantillon qui peuvent interférer ou en compétition avec l'interaction. En outre, l'interaction peut également être affectée par la conformation de l'antigène. Ces effets sont difficiles à contrôler et sont considérés comme la principale raison pour laquelle il a été difficile d'harmoniser les résultats entre les plates-formes de dosage immunologique et entre laboratoires. Becquantification ause avec MS est basée sur le comptage directement les molécules cibles par rapport à une norme marquée par un isotope stable, la quantification est absolue et généralement pas affectés par ces effets de matrice. En outre, les mesures de protéines de diagnostic par immunoessais devraient être soutenus par une chaîne ininterrompue de procédures et matériaux de mesure d'ordre supérieur, à partir validé LC-MS / MS et, des normes internes marqués par des isotopes stables à PGF et un CRM, améliorant ainsi la comparabilité et la fiabilité des résultats 20, 21.
En conclusion, le RMP décrit pour la mesure de Aß 142 dans le LCR est une étape importante dans le développement d' un CRM qui aidera à établir la concentration générale de coupure pour Aß 142 dans le LCR. Les seuils exacts sont très importants pour diagnostiquer avec précision AD précoce et sont de la plus haute importance lorsque de nouveaux types de médicaments modificateurs de la maladie atteignent la clinique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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