Introduction
La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più comune di demenza e colpisce circa 35 milioni di persone in tutto il mondo 1. Le caratteristiche neuropatologici della malattia ampiamente creduto di essere al centro della patogenesi sono grovigli neurofibrillari intracellulari di hyperphosphorylated proteina tau 2 e placche extracellulari costituito da (Ap) peptidi 3 aggregati beta-amiloide. In linea con questo, la valutazione della patologia placca in vivo da biomarcatori è stato recentemente inserito nei criteri diagnostici di ricerca per AD 4. Per misurazioni CSF di Ap 1-42, vari test immunologici sono disponibili e sono utilizzati in molti laboratori clinici 5. La concentrazione di Ap 1-42 in CSF è inferiore di circa il 50% in pazienti con AD rispetto al cognitivo normale anziani, riflettendo la deposizione del peptide in placche nel brain 6, 7.
Questi biomarcatori sono principalmente analizzati utilizzando saggi immunologici (ad esempio, le tecniche a base di anticorpi), ma questi test possono essere influenzati da effetti di matrice 8. L'uso di saggi immunologici su piattaforme tecnologiche diverse e la mancanza di test di standardizzazione 9, 10 rende l'introduzione di concentrazioni di cut-off globali difficili 11, 12. Un RMP analiticamente convalidato avrebbe permesso la calibrazione uniforme delle piattaforme di analisi diverse, idealmente con conseguente migliore comparabilità tra le piattaforme di analisi e in un migliore controllo dei fattori che contribuiscono alla variabilità complessiva di misura.
La quantificazione assoluta di Ap 1-42 con il metodo LC-MS / MS sviluppata supera molti dei problemi connessi con tecn a base di anticorpiiques. Il metodo, indicato come un RMP dal comitato misto per la tracciabilità in Medicina di Laboratorio (JCTLM archivio di identificazione numero C11RMP9), sarà utilizzato per determinare la concentrazione assoluta di Ap 1-42 in un materiale di riferimento certificato (CRM) per armonizzare CSF Ap 1 misurazioni -42 attraverso tecniche e piattaforme analitiche. Il flusso di lavoro descritto deve essere rilevante per lo sviluppo di metodi di riferimento candidato per peptidi e proteine all'interno di altre aree della medicina.
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Protocol
NOTA: Questo protocollo richiede aliquote di almeno 50 ml, con una concentrazione di 50 mg / ml per ciascun peptide Ap, come materiale di partenza. I peptidi Ap vanno dissolte in 20% acetonitrile (ACN) e il 4% di soluzione di ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) e conservati a 80 ° C.
Attenzione: Vedi Tabella 1 per le informazioni di sicurezza.
1. preparazione delle soluzioni
- Preparare 100 ml di 20% ACN e 4% ammoniaca concentrata in acqua deionizzata (v / v) diluendo 20 mL di ACN e 4 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 100 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni.
- Preparare 50 mL di 5 M guanidina cloridrato sciogliendo 26,08 g di guanidina cloridrato in acqua deionizzata fino ad un volume finale di 50 ml. Conservare a 20 ° C e fare mensile fresco.
- Preparare 200 ml di acido fosforico 4% in acqua deionizzata (v /v) diluendo 9,4 mL di acido fosforico concentrato (~ 85%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 200 ml con acqua deionizzata. Conservare in frigorifero e fare settimanale fresco.
- Preparare 50 mL di 75% ACN e ammoniaca concentrata 10% (v / v) in acqua deionizzata diluendo 37,5 mL di ACN e 5 ml di ammoniaca concentrata (~ 25%) in acqua deionizzata. Regolare il volume finale di 50 ml con acqua deionizzata. Fare fresco tutti i giorni.
- Scongelare almeno 2,5 ml di CSF umano per i calibratori, ottenuti da campioni avanzi de-identificato da analisi cliniche di routine.
- Preparare CSF artificiale contenente 150 mM Na, 3,0 mM K, 1.4 mM Ca, Mg 0,8 mM, 1,0 mM P, e 155 mM Cl in acqua deionizzata e aggiungere sieroalbumina bovina ad una concentrazione finale di 4 mg / mL. Solo 1 ml è necessaria per l'analisi, ma preparare un grande volume, un'aliquota di esso, e conservare per uso futuro.
2. Preparazione dei calibratori
- Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml 15 NAβ 1-42 peptide aggiungendo 40 ml di 50 mg / mL 15 NAβ 142 al 0.46 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Preparare 2 mL di 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 peptide aggiungendo 50 ml di 4 mg / mL 15 NAβ 142 al 1.95 mL di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Preparare sei soluzioni calibratori (AF) mescolando i volumi di ogni soluzione indicata nella tabella 2. Utilizzare 0.5, 1.5, e 2 tubi ml microcentrifuga. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Preparare i calibratori finali (in duplicato) in 0,5 ml microprovette con l'aggiunta delle soluzioni di taratura corrispondenti e CSF umano secondo la Tabella 3. Mix su un vortex per 1 minuto.
3. Preparazione dello standard interno
- Preparare 2 ml di 0,8 mg / mL 13 CAβ 1-42 peptide aggiungendo 32 ml di 50 mg / mL 13 CAβ 142 al 1.968 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta 2 mL. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Preparare 5 ml di 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 peptide aggiungendo 0,1 ml di 0,8 mg / ml a 4,9 ml di 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da microcentrifuga 5. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
4. Preparazione del campione Fattore di risposta
NOTA: Il fattore di risposta (RF) determinazione è eseguita per determinare la concentrazione del peptide marcato usato per la calibrazione (15 NAβ 1-42). Ciò richiede che la concentrazione del nativo Ap 1-42 peptide è stata determinata tramite analisi amminoacidica (AAA). Così, il volume e la concentrazione di nativi aliquote peptide Ap 1-42necessità di soddisfare i requisiti del AAA.
- Preparare 0,5 ml di 4 mg / ml nativo (senza etichetta) Ap 1-42 con l'aggiunta di 40 ml di 50 mg / ml nativo Ap 1-42 a 0,46 ml del 20% ACN e ammoniaca concentrata 4% in una provetta da 0,5 ml. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Preparare un 2-ml 40 ng mL mix di nativi e 15 NAβ 1-42 / aggiungendo 20 ml di 4 mg / ml nativo Ap 1-42 e 20 ml di 4μg / mL 15 NAβ 1-42 a 1,96 ml del 20% ACN e 4% concentrate di ammoniaca in una provetta da microcentrifuga 2. Miscelare con un miscelatore vortex per 1 minuto.
- Aggiungere 20 ml di 40 ng / mL mix di 0,38 ml di liquido cerebrospinale artificiale in una provetta 0,5 microcentrifuga. Preparare i duplicati e mescolare su un vortex per 1 minuto.
Preparazione del campione 5.
NOTA: Scongelare i campioni da misurare a temperatura ambiente su un rullo stanza.
- Aggiungere 0,18 ml di ogni calibratore, fattore di risposta, e campione non noto (compreso il controllo di qualità [QC] campioni, se utilizzato) ad una piastra a 96 profondo bene 1 proteina mL, secondo la figura 1 (assumendo un piatto pieno è utilizzato). Assicurarsi di aggiungere i campioni in, o in prossimità, il fondo dei pozzetti.
- Aggiungere 20 ml di standard interno ad ogni pozzetto (ad esempio, calibratori, i fattori di risposta, QC, e le incognite); è fondamentale per rilasciare la goccia sul lato del pozzo vicino alla superficie del campione senza immergendo la punta della pipetta.
- Aggiungere 0,2 ml di 5 M guanidina-cloridrato in ciascun pozzetto.
- Posizionare il piatto del campione, un vortex e miscelare i campioni per 45 min a 1100 rpm. La frequenza ottimale potrebbe differire a seconda della strumentazione. Impostare la frequenza e l'ampiezza del mixer in modo che le soluzioni sono accuratamente miscelati e non gocce di standard interno o CSF sono lasciati non miscelato sul lato dei pozzetti.
- Aggiungere 0,2 ml di acido fosforico 4%in ciascun pozzetto. Vortex mescolare brevemente.
6. estrazione in fase solida
NOTA: In tutte lavaggio, carico, e passi di eluizione, applicare il vuoto più basso possibile, dopo l'aggiunta della soluzione e aumentare gradualmente come necessario per caricare o eluire la soluzione. Disabilitare il vuoto tra ogni carico e passo eluizione.
- Mettere un vassoio di serbatoio per i rifiuti sotto una modalità mista, scambio cationico, 96 pozzetti estrazione in fase solida (SPE) placca nella camera di collettore piatto di estrazione.
- Condizionare la assorbente SPE con l'aggiunta di 0,2 ml di metanolo ad ogni pozzetto.
- Equilibrare il sorbente aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto.
- Trasferire tutti i campioni (circa 0,62 ml in ogni pozzetto) dalla piastra profondo bene alla piastra SPE. Utilizzare una pipetta a otto canali per il trasferimento dei campioni dalla piastra profondo bene alla piastra SPE; non è cruciale per la trasmissione completa o volumi uguali di tutti i campioni, poiché i campioni contengono un internoal standard che compensare le variazioni.
- Lavare il sorbente dopo i campioni hanno attraversato aggiungendo 0,2 mL di acido fosforico 4% a ciascun pozzetto.
- Dopo che il solvente di lavaggio è eluito dalla sorbente, sostituire il vassoio serbatoio con una piastra di raccolta o tubi.
- Eluire il campione dalla sorbente di due volte aggiungendo 50 ml di 75% ACN / 10% ammoniaca concentrata e notare che questa soluzione richiede molto basso vuoto per passare attraverso l'assorbente. Ricordarsi di disattivare il vuoto tra ogni aggiunta.
- OPTIONAL: Sigillare la piastra di raccolta o tubi e congelarli a -80 ° C. Rimuovere il sigillo dalla piastra raccolta o tubi prima di procedere al punto 6.8.2.
- Asciugare le eluati utilizzando centrifugazione a vuoto (senza applicazione di calore); questo può richiedere da una a diverse ore, a seconda della centrifuga a vuoto.
- Sigillare i contenitori e congelarli a -80 ° C.
7. chromato Liquidgrafia
- Preparare fase mobile A (5% ACN e ammoniaca concentrata 0,3% in acqua deionizzata [v / v]), B (acqua deionizzata 4% e ammoniaca concentrata 0,1% in ACN [v / v]), e lavaggio dell'ago (50% ACN e 4% concentrato ammoniaca in acqua deionizzata [v / v]).
- Per 500 ml di fase mobile A, aggiungere 25 ml di ACN e 1,5 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 500 ml con acqua deionizzata.
- Per 500 ml di mobili fase B, aggiungere 500 ml di ammoniaca concentrata e 25 ml di acqua deionizzata ad ACS. Regolare il volume finale di 500 ml con ACN.
- Preparare 250 ml di lavaggio dell'ago aggiungendo 120 mL di ACN e 10 ml di ammoniaca concentrata di acqua deionizzata. Regolare il volume finale a 250 ml con acqua deionizzata.
- Mettere il fasi mobili A e B e lavare l'ago bottiglie aperte in un bagno di ultrasuoni per 20 minuti prima di utilizzarlo con il sistema LC
- Sciogliere ogni campione con 25 ml di 20% ACN e il 4% Concentrasoluzione di ammoniaca Ted e metterli su un agitatore per 20 min. Centrifuga verso il basso i campioni e metterli nel campionatore automatico (tenere a 7 ° C).
- Iniettare 20 ml di campione su un 1 x 250 mm 2 polistirene-divinilbenzene (fase inversa) colonna monolitica mantenuta a 50 ° C.
- Utilizzare il gradiente LC mostrato nella Tabella 4 con una portata di 0,3 mL / min. Deviazione i primi due e gli ultimi cinque minuti sprecare (post-colonna) mediante una valvola di deviazione per ridurre la contaminazione dello spettrometro di massa.
Analisi 8. Messa spettrometrica
NOTA: Questi parametri sono stati utilizzati per uno spettrometro di massa ibrido quadrupolo-Orbitrap dotato di aheated sorgente di ionizzazione elettrospray.
- Impostare i parametri per la sorgente di ioni secondo la tabella 5.
- Impostare lo strumento MS per isolare i 4+ carica stati di natale Ap 1-42 (1,129.48 di massaa-charge ratio [m / z]), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 m / z), e 13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) nell'analizzatore di massa a quadrupolo con una larghezza isolamento di 2,5 m / z.
- Frammentare i peptidi isolati nella cella di collisione con un'energia di collisione normalizzata (NCE) di 17,0. Questo potrebbe essere necessario sintonizzati per ogni strumento, anche dello stesso tipo (e soprattutto se si utilizzano altri tipi di strumenti, come un triplo quadrupolo MS).
- Registrare il spettri frammento con una risoluzione di 17.500, con un obiettivo di controllo automatico del guadagno di 2 x 10 5 cariche e un tempo massimo di iniezione di 250 ms.
9. Elaborazione dati
- Utilizzare la somma degli ioni prodotto (con una tolleranza massa di ± 250 unità di massa milli [MMU]) nella Tabella 6, per calcolare le aree cromatografiche per ciascun peptide. Si noti che i tipi di ioni ed i numeri sono indicati solo per Ap nativo
- Determinare il fattore di risposta media dei due campioni fattore risposta dividendo l'area sotto la curva (picco cromatografico) del 15 NAβ 1-42 con l'area sotto la curva del nativo Ap 1-42.
- Regolare la concentrazione del 15 NAβ 1-42 utilizzata per la calibrazione, moltiplicandolo per il fattore di risposta calcolato nel passo 9.2.
- Costruire una curva di taratura riportando i rapporti di superficie di 15 NAβ 1-42 al 13 CAβ 1-42 da due serie di calibratori contro la concentrazione.
- Calcolare la pendenza e intercetta della curva di calibrazione utilizzando la regressione lineare.
- Calcolare il rapporto di nativo Ap 1-42 area a standard interno (13 CAβ 1-42) per uncampioni noti.
- Estrapolare la concentrazione dei campioni sconosciuti dalla curva di calibrazione utilizzando la pendenza e l'intercetta ottenuto nel passaggio 9.5.
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Representative Results
Il setup piatto in Figura 1 è utilizzato per un piatto pieno di campioni. Se un minor numero di campioni sconosciuti sono da analizzare, il secondo calibratore, set RF, e QC deve essere posto dopo la prima metà dei campioni sconosciuti.
Come si vede nella figura 2, i calibratori sono vicini alla linea di regressione, con basse deviazioni standard. Questo metodo ha un livello inferiore di quantificazione di 150 pg / ml e un livello superiore di quantificazione di 4,000 pg / mL. La deviazione standard residua della calibrazione ovviamente deve essere il più basso possibile. Se la calibrazione non è lineare, la corsa deve essere eliminato (a seconda della gravità), e la deviazione è probabilmente dovuto alla tecnica di pipettaggio errata e / o errori nella diluizione dei calibratori. Il coefficiente di variazione (CV) di repliche dovrebbe essere inferiore al 20%, preferibilmente inferiore al 10%.
ogether.within-page = "1"> Il nativo 15 N e 13 CAβ 1-42 eluire dalla colonna LC contemporaneamente (in quanto differiscono solo a livello isotopica), con vicino a picchi simmetrici e senza tailing significativa (Figura 3 ). Almeno dieci misurazioni devono essere eseguiti per ogni picco cromatografico e possono essere regolati con il tempo massimo di iniezione nel metodo strumento. Tutti e tre i peptidi possono essere misurati simultaneamente per tutte le misurazioni (calibrazione, RF, e le incognite) durante l'analisi MS. Tuttavia, se la sensibilità del metodo è ottimale, solo peptidi di interesse devono essere misurati per ogni iniezione (ad es., Misura solo 15 N e 13 CAβ 1-42 per calibratori, nativo e 15 NAβ 1-42 per i campioni RF, e nativo e 13 CAβ 1-42 per i campioni sconosciuti).
Figura 1 "src =" / files / ftp_upload / 55386 / 55386fig1.jpg "/>
Figura 1: Layout di piatti SPE e profondo bene. Tipico schema di calibratori (AF), fattore di risposta del campione (RF), campioni di controllo di qualità (QC), e le incognite. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curva di calibrazione. Curva di calibrazione costruita utilizzando 15 NAβ 1-42 a 172, 572, 1.144, 2.287, 3.431, e 4.574 pg / mL (adattato in base al fattore di risposta) e 13 CAβ 1-42 come standard interno nel CSF umano (n = 2) . Il rapporto di 15 NAβ 1-42 / 13 CAβ 1-42 zona è tracciata (asse Y)contro la concentrazione (asse X). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Cromatogramma. Cromatogramma di 0,500 ng / mL nativo (endogena) Ap 1-42 (pannello superiore) e 1,6 ng / mL 13 CAβ 1-42 (pannello inferiore) nel liquido cerebrospinale umano. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Quantificazione di sconosciuta Ap 1-42 in campioni sconosciuti <./ strong> Il rapporto area del picco è calcolato dividendo il nativo Ap 1-42 zona cromatografica picco con lo standard interno (13 CAβ 1-42) area del picco cromatografico. La concentrazione di nativo Ap 1-42 nel campione è estrapolata dalla curva di calibrazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Informazioni sulla sicurezza. Informazioni sulla sicurezza per le sostanze chimiche utilizzate per questo protocollo.
| soluzione calibratore | Volume di 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 soluzione (ml) Volume del 20% ACN e 4% di ammoniaca (ml) | Volume finale (mL) | Finale 15 NAβ 1-42 concentrazione (ng / mL) | |
| UN | 0.20 | 0.30 | 0.50 | 40.00 |
| B | 0.15 | 0.35 | 0.50 | 30.00 |
| C | 0.20 | 0,80 | 1.00 | 20.00 |
| D | 0.10 | 0.90 | 1.00 | 10.00 |
| E | 0.05 | 0.95 | 1.00 | 5.00 |
| F | 0.03 | 1.97 | 2.00 | 1,50 |
Tabella 2: le soluzioni del calibratore. Le soluzioni del calibratore preparate nel 20% ACN e il 4% concentrati ammoniacautilizzato per la chiodare calibratori CSF.
| Calibratore | Volume del corrispondente soluzione di calibrazione (ml) | Volume di CSF umana (ml) | Volume finale (mL) | Finale 15N-Aβ1-42 concentrazione (ng / mL) |
| UN | 0,02 (A) | 0,18 | 0.20 | 4.00 |
| B | 0,02 (B) | 0,18 | 0.20 | 3.00 |
| C | 0.02 (C) | 0,18 | 0.20 | 2.00 |
| D | 0.02 (D) | 0,18 | 0.20 | 1.00 |
| E | 0,02 (E) | 0,18 | 0.20 | 0.50 |
| F | 0,02 (F) | 0,18 | 0.20 | 0.15 |
Tabella 3: calibratori. Calibratori preparati in CSF umano.
| Tempo (min) | % Fase mobile B |
| 0 | 5 |
| 1 | 5 |
| 6 | 20 |
| 7 | 90 |
| 9 | 90 |
| 10 | 5 |
| 15 | 5 |
Tabella 4: gradiente di LC. Il gradiente LC usato con una portata costante di 300 microlitri / min.
| Parametro | Valore |
| gas guaina | 50 |
| gas ausiliario | 6 |
| tensione Spray | 4.4 kV |
| S-lens RF | 61 |
| temperatura del riscaldatore | +190 ° C |
| temperatura capillare | +350 ° C |
Tabella 5: impostazioni della sorgente ionica. Parametri per la sorgente ionica di essere impostate nel software dello strumento melodia.
| ione precursore | ioni prodotto |
| Native Aβ1-42 (m / z 1.129,58, 4+) | 915,19 (+ B334), 943,21 (b344 +), 975,98 (B354 +), 1.000,74 (B364 +), 1.029,51 (+ b384), 1054.03 (b394 +), 1.078,79 (B404 +), 1.107,06 (B414 +), 1.163,23 (B313 +), 1.200,25 (B323 +), 1.257,29 (B343 +), 1.300,96 (B353 +), 1.333,66 (B363 +), 1.372,00 (B383 +), 1.405,02 (b393 +) |
| 15N-Aβ1-42 (m / z 1.143,00, 4+) | 926,41, 954,68, 987,95, 1.012,71, 1.041,22, 1.066,99, 1.091,75, 1.120,28, 1.177,18, 1.215,55, 1.272,58, 1.316,92, 1.349,94, 1.388,63, 1.422,31 |
| 13C-Aβ1-42 (m / z 1.179,50, 4+) | 955,33, 985,11, 1.019,37, 1.045,14, 1.074,65, 1.100,67, 1.126,69, 1.156,40, 1.253,43, 1.313,14, 1.358,50, 1.393,19, 1.432,21, 1.466,90 |
Tabella 6: Gli ioni utilizzate per la quantificazione. Le 4+ carica stati degli ioni precursori sono isolati nel analizzatore di massa a quadrupolo, con una larghezza isolamento di 2,5 m / z. Gli ioni di prodotto (con una tolleranza di massa di ± 250 MMU) vengono utilizzati per calcolare le zone cromatografiche per ciascun peptide. tipi di ioni e numeri sono only mostrato per nativi Ap 1-42 ioni prodotto, dal momento che sono gli stessi per entrambi 15 NAβ 1-42 e 13 CAβ 1-42.
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Discussion
Per il metodo descritto, invece di utilizzare una matrice surrogata, abbiamo usato il metodo surrogata analita 13, 14, 15, 16, che consente la calibrazione in CSF umano. L'approccio analita surrogato coinvolge due diversi standard marcati con isotopi. Uno (15 NAβ 142) è utilizzato per generare la curva di calibrazione in CSF umano, mentre un altro (13 CAβ 142) è usato come standard interno. Sconosciuto endogeni Ap 142 concentrazioni sono poi estrapolati dalla curva di calibrazione costruito utilizzando il 15 NAβ 142/13 CAβ rapporto di 142 dal endogena Ap 142/13 rapporto calcolato CAβ 142. L'approccio analita surrogata è stato usato poiché non vi è alcuna connessione CSF-analita disponibili, e basso Ap 142 recuperoè stato osservato quando si utilizza nativo Ap 142 in una matrice surrogata durante lo sviluppo del metodo.
Da 15 NAβ 142 e nativo Ap 142 possono dare risposte diverse nei MS, la concentrazione di 15 NAβ 142 viene regolata misurando un campione-an RF campione CSF artificiale contenente uguali concentrazioni di 15 NAβ 142 e nativo Ap 142, con una concentrazione nota determinata da AAA.The fattore di risposta potrebbe variare tra i diversi spettrometri di massa a causa di possibili variazioni nella purezza isotopica del 15 peptide N-marcato tra i lotti. Così, il fattore di risposta deve essere determinato per ciascun giorno di misurazione.
Le fasi più critiche di questo protocollo sono la preparazione dei calibratori e dei campioni RF. Peptidi Ap, soprattutto Ap 1-42, sono molto idrofobiche e facilmente attenersi a punte per pipette untubi ND superfici 8, 17, 18. Per ridurre al minimo la perdita di peptidi Ap durante la dispensazione, è estremamente importante per saturare le punte delle pipette prima della consegna. Preferibilmente, tre volumi di soluzione peptide deve essere eliminata prima della consegna a una nuova soluzione provetta contenente. A seconda del volume e la concentrazione della soluzione di riserva, questo non è sempre possibile. Il secondo approccio migliore è ovviamente quello di pipetta la soluzione di peptidi su e giù per tre volte prima della consegna. Per la stessa ragione, è importante utilizzare formati appropriati per tubi, evitando grandi volumi vuoti.
I dati pubblicati in precedenza per il metodo mostrano che il recupero era all'interno del 100% (15%) 15. Gli errori relativi per i calibratori di back-calcolato erano al di sotto del 15% di tutta la gamma definita dalla curva di calibrazione 19.
Uno olimitazione bvious di questa tecnica è che è a basso rendimento rispetto ai saggi immunologici automatizzati. Tuttavia, lo scopo del metodo descritto è elevata precisione e non produttività. Questo metodo può anche essere ampliato per includere Ap 1-38 e Ap 1- 40, che sono più brevi 19. Un altro limite di questo metodo è che l'operatore dovrà una formazione spettrometria di massa prima di eseguire l'analisi sullo strumento.
Quantificazione usando immunodosaggi dipende dall'interazione tra l'anticorpo e l'antigene. Questa interazione potrebbe essere influenzata dalla presenza di componenti del campione che possono interferire o competere con l'interazione. Inoltre, l'interazione può anche essere influenzata dalla conformazione dell'antigene. Questi effetti sono difficili da controllare e si ritiene essere il motivo principale per cui è stato difficile per armonizzare i risultati tra le piattaforme immunodosaggio e tra laboratori. becquantificazione ause con SM si basa sul conteggio direttamente le molecole bersaglio rispetto ad una standard marcati con isotopi stabili, la quantificazione è assoluta e generalmente influenzato da tali effetti matrice. Inoltre, le misure di proteine diagnostici per test immunologici dovrebbero essere sostenuti da una catena ininterrotta di procedure di misura di ordine superiore e materiali, da convalidato LC-MS / MS e stabili, marcati con isotopi standard interni a RMP e un CRM, migliorando così la comparabilità e affidabilità dei risultati 20, 21.
In conclusione, il RMP descritto per la misurazione del Ap 142 nel liquor è un passo importante nello sviluppo di un CRM che aiuterà a stabilire la concentrazione generale di cut-off per la A? 142 nel liquido cerebrospinale. Esatte cut-off sono molto importanti per diagnosticare con precisione AD precoce e sono della massima importanza quando i nuovi tipi di farmaci modificanti la malattia raggiungere la clinica.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 022431081 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | 022431102 | |
| Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL | Eppendorf | 0030 108.310 | |
| Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96 | Eppendorf | 951032905 | |
| Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom | Micronic | MPW32071BC3 | Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates. |
| Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes | Micronic | MP53026 | Caps for Micronic tubes. |
| Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded | Micronic | MPW51015BC3 | Holder for Micronic tubes. |
| Biohit Optifit tips 1.2 mL | Sartorius | 791210 | Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well. |
| Waters Oasis MCX 96-well µElution Plate | Waters | 186001830BA | |
| Waters Plate manifold reservoir tray | Waters | WAT058942 | |
| Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates | Waters | 186001831 | |
| Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis | Sigma-Aldrich | 30501-1L-D | |
| Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L | Fisher Scientific | A/0627/17X | |
| ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur | Merck Millipore | 1005731000 | |
| Guanidine Hydrochloride, 500 g | Thermo Scientific | 24110 | |
| Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFALGMAZR | With bundled Dionex Ultimate 3000 LC & autosampler. |
| Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm) | Dionex | 066640 | |
| Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated | Sigma-Aldrich | B6917 | |
| Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA | rPeptide | A-1002-2 | |
| 15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1102-2 | |
| 13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled | rPeptide | A-1106-2 | |
| Microplate shakers, TiMix 2 | Edmund Bühler | 6110 000 |
References
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