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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55445
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

Summary

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Abstract

L'obesità favorisce uno stato infiammatorio cronico che è in gran parte mediato dai macrofagi residenti in tessuto così come macrofagi monocito-derivati. L'obesità indotta da dieta (DIO) è un modello importante nello studio del ruolo di eterogeneità dei macrofagi; Tuttavia, gli isolamenti del macrofago adeguata sono difficili da acquisire da tessuti infiammati. In questo protocollo, vengono delineati i passaggi di isolamento e le necessarie linee guida sulla risoluzione dei problemi derivate dai nostri studi per l'ottenimento di una popolazione adatta dei macrofagi residenti in tessuto da topi dopo 18 settimane di grassi (HFD) o alto-grasso/colesterolo ( Intervento di dieta HFHCD). Questo protocollo si concentra su tre hallmark tessuti studiati nell'obesità e aterosclerosi compreso il fegato, tessuto adiposo bianco (WAT) e l'aorta. Evidenziamo l'utilizzo come dualistica di flusso cytometry può raggiungere una nuova dimensione di isolamento e caratterizzazione dei macrofagi residenti in tessuto. Una sezione fondamentale del presente protocollo risolve la complessità sottostante digestioni enzimatiche tessuto-specifici e isolamento del macrofago e successiva anticorpo cellula-superficie che macchia per analisi cytometric di flusso. Questo protocollo consente di risolvere complessità esistente alla base fluorescente-attivata delle cellule ordinano (FACS) e presenta chiarimenti a queste complessità in modo da ottenere la caratterizzazione di vasta gamma da popolazioni cellulari adeguatamente ordinato. Metodi di arricchimento alternativo sono inclusi per l'ordinamento di cellule, quali il fegato denso, consentendo per la gestione di tempo e flessibilità quando si lavora con FACS. In breve, questo protocollo aiuti al ricercatore di valutare l'eterogeneità dei macrofagi da una moltitudine di tessuti infiammati in un dato studio e fornisce penetranti suggerimenti sulla risoluzione dei problemi che hanno avuto successo per la caratterizzazione e isolamento cellulare favorevole delle cellule immuni in DIO-ha mediato l'infiammazione.

Introduction

Modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per studiare la dinamica delle malattie umane. Adeguato isolamento delle cellule residenti del tessuto da topi in uno stato malato può fornire una piattaforma per comprendere i contributi molecolari e cellulari alla patogenesi di una malattia1. Un disordine che è di fondamentale importanza è l'obesità. L'incidenza dell'obesità continua ad aumentare in tutto il mondo in parallelo con l'insulino-resistenza e di tipo 2 mellitus del diabete, malattia cardiovascolare e steatosi epatica2,3. Eccessivo consumo di nutrienti è ulteriormente inclinato da riduzione dell'attività fisica innescando segnali alterati provenienti dal tessuto adiposo, che può alterare l'ambiente cellulare degli altri tessuti periferici quali l'aorta e fegato4. Tale perturbazione dell'omeostasi metabolica si traduce in un di infiammazione sistemica cronica di basso grado5.

Classica attivazione dei macrofagi residenti per l'aorta e fegato, nonché il loro reclutamento al tessuto adiposo bianco (WAT) ha dimostrato di non solo avviare il dysregulation di segnali metabolici, ma anche sostenere l'infiammazione6,7. L'eterogeneità fenotipica e funzionale dei macrofagi è fortemente associato con la patogenesi dell'obesità correlate a co-morbidità7. La plasticità dinamica nella polarizzazione del macrofago consente queste cellule ad esporre una gamma di fenotipi attivati che coordinano la progressione e la risoluzione di infiammazione8. Mentre i macrofagi (M1) classicamente attivati sono implicati nella propagazione dell'infiammazione, i macrofagi (M2) in alternativa attivati sono stati associati con risoluzione e tessuto riparazione9,10.

Come il corpo subisce stress metabolico, tessuto adiposo bianco si accumula in modo anomalo. Il tessuto adiposo espanso attira e trattiene le cellule infiammatorie che profondo alterano la normale funzione degli adipociti per promuovere l'insulino-resistenza, iperglicemia e diabete mellito di tipo 2 in ultima analisi, l'insulino-resistenza o iperglicemia11, 12. In parallelo, tessuto adiposo bianco rimodella in risposta a segnali infiammatori rilasciato da infiltrato classicamente attivati (M1) tessuto adiposo macrofagi (ATMs)13,14. Questo organo multi-cellulare esercita una cascata di segnali che deraglia la normale funzione di altri organi del corpo come l'aorta e fegato4.

Il fegato è un concentrato di metabolico che si adatta in risposta a stimoli provenienti da vicine dysregulated WAT15. Epatici macrofagi o cellule di Kupffer, in risposta a cambiamenti metabolici, secernono citochine infiammatorie che trasformano entrambi parenchimatica e fenotipo delle cellule non parenchimali e promuovono il rimodellamento tissutale. Accumulo di lipidi epatici, infiammazione, depositi eccessivi di matrice extracellulare, necrosi e funzione eventuale perdita segue gli insulti infiammatori contribuendo ad ampio spettro di danni al fegato associati con epatopatia steatosica non alcolica 16,17,18.

In parallelo al compromesso WAT e funzione epatica, grandi arterie si accumulano i lipidi all'interno della parete arteriosa come il corpo subisce lo stress metabolico cronico19. Accumulazione del lipido arteriosa innesca la secrezione di chemochine dalle cellule endoteliali attivate e successiva assunzione di monociti20. Una volta reclutate, monociti proliferano, differenziano, ingeriscono lipoproteine e diventano cellule della gomma piuma. Atherogenesis è avviata e sostenuta da attività pro-infiammatoria di reclutati e macrofagi lipido-carichi residente in tessuto. Soccombere ai segnali extracellulari ed intracellulari stress inoltrati in questo microambiente atherogenic, questi macrofagi quindi impegnano in una cascata di segnalazione di apoptotic. Come queste cellule schiumose muoiono, essi contribuiscono loro contenuto lipidico riempito al nucleo necrotico della lesione, che poi conduce alla rottura della placca, infarto miocardico e ictus.

Collettivamente, l'eterogeneità fenotipica del macrofago orchestra in parte l'obesità indotta da cambiamenti infiammatori osservati in tessuti dysregulated come WAT, fegato e dell'aorta8,21. Caratterizzazione di reclutati e macrofagi residenti tessuto potrebbero fornire la comprensione nei potenziali bersagli molecolari che manipolano macrofago fenotipo1. Per caratterizzare in modo efficace i macrofagi dai tessuti infiammati obesità-indotta, una sospensione di singola cellula può essere ottenuta tramite digestione enzimatica. Tali protocolli di dissociazione devono essere efficace nel sufficientemente degradante tessuto connettivo riducendo la morte delle cellule immuni e fornendo resa cellulare ottimale. La miscela di enzimi dipende dal tipo di tessuto e suo strutturale compongono. Tessuti resistenti, come l'aorta richiede più forte attività enzimatica, rispetto al fegato e WAT, per raggiungere la dissociazione dei tessuti. Dalla sospensione unicellulare, macrofagi residenti del tessuto possono essere inequivocabilmente caratterizzati o isolati per ulteriore analisi, a valle quali profiling trascrizionale.

Qui un protocollo di tessuto-specifico è descritto che utilizza la digestione della collagenosi-dipendente del tessuto e citometria a flusso policromatici efficacemente isolare e caratterizzare i macrofagi residenti in tessuto ottenuti da obesità dieta tradizionale ha indotto, aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite modelli murini. Simultanea di colorazione degli indicatori della superficie delle cellule con anticorpi contro del leucocita-(CD45 e/o CD11b) e del macrofago - antigeni specifici (F4/80) è spesso utilizzato per identificare il macrofago popolazioni22. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono una strategia potente utilizzata per ordinare queste popolazioni identificate a elevata purezza. La popolazione ordinata quindi possa essere valutata per profili di gene specifico fenotipo mediante analisi molecolare a valle (ad esempio, reazione a catena della polimerasi quantitativa real time)23. Sebbene la citometria a flusso standard e flusso cytometry-base cella ordinamento sono strumenti potenti nel distinguere i macrofagi all'interno di una sospensione cellulare notevolmente eterogenei, i protocolli ex devono essere ottimizzati per garantire successo uscita. In questo studio, protocolli che efficacemente isolare e caratterizzano i macrofagi specifico tessuto vitale sono descritti; ancora più importante, questo studio fornisce approfondimenti cruciali di questioni tecniche che spesso sorgono, così come le strategie proattive e Trouble-Shooting per prevenire e/o risolverli.

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Protocol

Tutti i protocolli sperimentali (sezioni 1, 1.2 e 1.3) sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la Pennsylvania State University.

Tessuto Preparazione di buffer di dissociazione Volume finale Deposito
Tessuto adiposo bianco (WAT) Buffer di dissociazione: 2,5% HEPES, 10 mg/mL albumina di siero bovino (BSA), 3 mg/mL (0,3%) Collagenasi tipo II in di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) con 4,5 g/L glucosio senza L-glutamina e sodio piruvato 500 mL meno 80° C (aliquote di 10 mL)
Fegato 25 x aspersione tampone concentrato (PBC): 3.55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH in acqua distillata deionizzata H2O 500 mL meno 20° C (aliquote 40 mL)
Buffer di conservazione (PRB): 1% BSA in 1x Buffer di perfusione 1 L 4 ° C
Buffer di dissociazione: 1 x aspersione Buffer completati con 4,76 mM CaCl2 e 72 U/mL collagenasi tipo IV 50 mL (per topo) Preparare immediatamente prima dell'uso
Aorta Buffer di dissociazione: 125 U/mL collagenasi tipo XI, 60 U/mL ialuronidasi tipo I, 60 U/mL dnasi I, 450 U/mL collagenasi di tipo I, 20 mM HEPES in 1x tampone fosfato salino (PBS) 500 mL meno 80° C (aliquote di 10 mL)

Tabella 1: Ricette del buffer dell'aspersione specifici di tessuto.

1. tessuto isolamento e dissociazione

  1. Dissociazione e WAT isolamento
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifici come da tabella 1e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare il tampone di digestione di scongelamento il volume appropriato di WAT dissociazione tampone e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Immediatamente prima dell'uso, caldo tampone a 37 ° C. Preparare il tampone di FACS preparando 1x tampone fosfato salino (PBS) contenente 2% siero bovino fetale (FBS).
    3. Isolamento di WAT
      1. Una camera del mouse in un anidride carbonica (CO2) riempito di eutanasia. Verificare l'efficacia prima di procedere alla fase di dissezione.
      2. Immergere il mouse eutanasizzato brevemente in un becher contenente etanolo al 70% fino a quando completamente imbevuto e rivestito con etanolo. Inserire la superficie ventrale del mouse verso l'alto sul palco di dissezione e fissare il mouse indietro e zampe posteriori alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Utilizzare pinze punta punto medio per afferrare la pelle addominale anteriore l'apertura uretrale, quindi utilizzare forbici per dissezione per fare un nick nella pelle addominale afferrata.
      4. Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione piccola tra la pelle e il peritoneo e fare un'incisione laterale dall'addome per la gabbia toracica.
      5. Tirare delicatamente la pelle per esporre la cavità peritoneale intatta ed effettuare un'incisione laterale attraverso il peritoneo e piegare indietro la membrana trasparente o asportare il tessuto per esporre il WAT addominale.
      6. Raccogliere i cuscinetti di grasso perigonadal, come descritto in Mann et al. 24
        1. I cuscinetti di grasso perigonadal in di topo maschio senza bloccare sono tenuti all'epididimo e testicoli. In primo luogo individuare i testicoli e poi con mezzo punto di pinze, afferrate la testa dell'epididimo e tirare delicatamente.
        2. Utilizzando delle forbici affilate per dissezione, asportare ogni grasso epididimario tagliando lungo la superficie dell'epididimo (testa, corpo e coda) e i testicoli.
        3. Con il forcipe, tirare delicatamente il cuscinetto di grasso mentre taglio attraverso il tessuto connettivo è direttamente legata alla struttura dell'epididimo.
        4. Utilizzando le pinze, afferrare saldamente la fine del rilievo grasso prossimale all'epididimo e Sbucci delicatamente il cuscinetto di grasso dalle gonadi
        5. Nei topi femmina, i cuscinetti di grasso perigonadal sono vagamente legame al corpo dell'utero e corno uterino.
        6. Usando il punto medio forcipe, afferrare il tessuto grasso perigonadal e tirare delicatamente il tessuto lontano dal corpo dell'utero e il corno uterino.
        7. Asportare ogni rilievo grasso tagliando lungo il corpo dell'utero e il corno uterino utilizzando delle forbici affilate per dissezione.
      7. Posizionare il grasso pastiglie in una capsula di Petri-riempito con PBS e tenere il ghiaccio per mantenere il tessuto umido.
    4. Dissociazione di WAT nelle sospensioni singola cella
      1. Togliere l'eccesso di PBS di Petri e utilizzare un'unico bordo rasoio lama per tritare il WAT addominale in piccoli pezzi.
      2. Con il bordo tagliente della lama di rasoio, raschiare delicatamente il WAT addominale macinato in una provetta di raccolta in polipropilene con etichetta 15 mL contenente 2 mL di tampone di dissociazione WAT.
      3. Incubare la miscela di buffer tessuto-digestione sotto lenta rotazione continua a 37 ° C per 45 min.
      4. Filtrare il tessuto digerito attraverso un colino di cella di 70 µm in una provetta di raccolta 50 mL mentre si muove il pistone di gomma di un stantuffo della siringa con un movimento circolare e continuare a setacciare la sospensione cellulare attraverso il filtro.
      5. Pipettare 2 mL di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) in una provetta da 15 mL, pipettare delicatamente su e giù e lavare il filtro con la sospensione unicellulare.
      6. Lavare il filtro altre due volte con DMEM freddo e la sospensione singola cella sul ghiaccio.
      7. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g a 4 ° C per 8 min.
      8. Utilizzare un aspiratore per rimuovere con cautela il galleggiante adipociti (prima) e il rimanente surnatante. Assicurarsi di non disturbare la frazione vascolare stromal pellettata (SVF).
      9. Con una pipetta di 1.000 µ l, delicatamente risospendere il pellet in tampone di cloruro di ammonio e potassio (ACK) a lisare gli eritrociti secondo le istruzioni del produttore.
      10. Diluire la sospensione cellulare sopra con DMEM e centrifugare la sospensione cellulare a 300 g a 4 ° C per 8 min.
      11. Risospendere le cellule in PBS freddo contenente il 2% FBS (FACS Buffer) e contare le celle in una camera di Burker/emocitometro.
      12. Trasferimento o 1 x 106 cellule (per citometria a flusso di base) o la sospensione di intera cella (per FACS) per provette da 5 mL turno-fondo in polistirolo. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.
  2. Dissociazione e l'isolamento del tessuto del fegato
    Nota: Questo protocollo è stato adattato da Smedsrød25.
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifici come da tabella 1 e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare 1 x aspersione Buffer (PB), da diluire 40 mL di PBC in 960 mL ultrapura H2O. pre-caldo una siringa riempita con 50 mL di PB a 37 ° C, poco prima che inizi l'aspersione. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti.
        1. Per eliminare le bolle d'aria, invertire la siringa dove la punta di blocco leur è rivolta verso l'alto. Sfiorare o toccare la siringa fino a quando bolle d'aria sono per il pf superiore la siringa. Spingere lentamente lo stantuffo per espellere l'aria
      2. Preparare il tampone di digestione diluendo 0,5 mL di soluzione di CaCl2 di 476 mMa 49,5 mL 1 x buffer di aspersione. Aggiungere 3600U di collagenasi tipo IV al 4,76 mM CaCl2 – soluzione di PB. Pre-riscaldare una siringa riempita con 50 mL di tampone di digestione a 37 ° C, poco prima che inizi l'aspersione. Eliminare eventuali bolle d'aria presenti come descritto nel passaggio 1.2.2.1.1.
      3. Preparate la conservazione Buffer (PRB) sciogliendo g 2,5 albumina di siero bovino (BSA) in 250 mL di tampone per aspersione 1x. Conservare a 4 ° C o conservare il ghiaccio fino all'utilizzo.
      4. Preparare il tampone di FACS con 1x PBS e 2% FBS.
    3. Isolamento del tessuto del fegato
      1. Eutanasia di un mouse per CO2 asfissia, saturare mouse con etanolo al 70% per prevenire la contaminazione degli organi intra-addominali con pelliccia.
      2. Posizione lato ventrale del mouse fino su un polistirene espanso bordo di dissezione e fissare il mouse anteriore e posteriore zampe alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Per esporre la parete toracica e la cavità peritoneale, afferrare la pelle addominale vicino all'apertura uretra usando una pinzetta punta punto medio. Quindi utilizzare un paio di forbici per dissezione tagliente per creare una piccola incisione sulla pelle addominale afferrato.
      4. Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione piccola tra la pelle e il peritoneo e fare un'incisione laterale dall'inguine al mento.
      5. Tirare delicatamente la pelle per esporre la cavità peritoneale intatto e la parete toracica, fare un'incisione laterale attraverso il peritoneo e asportare la membrana.
      6. Sollevare lo sterno e accuratamente incise il diaframma, essere sicuri di non disturbare la vena cava inferiore (IVC). Spostare gli organi gastrointestinali al lato e individuare il IVC subhepatic. Utilizzare pinze emostatiche per serrare il suprahepatic IVC per mantenere la perfusione localizzata.
        Nota: Eccessivo accumulo di tessuto adiposo bianco viscerale spesso può mascherare il IVC. Per visualizzare meglio questo vaso, una piccola area di tessuto adiposo accanto l'IVC può essere asportata. La finestra incisa all'interno del tessuto grasso flessibile quindi può essere posizionata sopra l'IVC per esporre il vaso per inserimento di una canula.
      7. Collegare la siringa riempita con PB pre-riscaldato per il set di accumulazione e di infusione di sangue 23 G. Spingere delicatamente lo stantuffo fino a quando la tubazione e l'ago sono pieni di PB.
      8. Inserire l'ago 23G, parallelo al livello del subhepatic IVC. Fissare l'ago con una pinza emostatica di 4 cm.
        Nota: Inserimento di una canula di subhepatic che IVC è preferito nei topi di dieta-federazione in quanto l'IVC può essere meglio visualizzata e cannulate all'interno della cavità piene di grasso.
      9. Spingere lentamente lo stantuffo per iniziare la perfusione, colore svuoterà rapidamente dal fegato (lobo di destra prima) se l'ago viene posizionato in modo appropriato nel vaso. Allargamento dei lobi è anche visibile se l'ago è inserito correttamente nell'IVC subhepatic.
      10. Prontamente tagliare la vena portale per consentire il PB di fluire liberamente attraverso il fegato.
      11. Irrorare il fegato fino a quando il sangue non è più visibile. In occasione, massaggiare i lobi del fegato tra ribalta-dito e il pollice per facilitare l'aspersione.
        Nota: È importante utilizzare strumenti taglio smussati non seghettata per gestire il fegato per evitare danni ai tessuti.
      12. Quando 5 mL di PB rimane all'interno della siringa, cambiare la siringa riempita con buffer di dissociazione pre-riscaldato. Non disturbare la posizione dell'ago protetto durante questo tempo.
        Attenzione: Allargata fegati significativamente superiore a 1,5 g devono essere irrorati con un maggiore volume di tampone di digestione pre-riscaldato per garantire successo dissociazione del fegato.
      13. Irrorare il fegato fino a quando non completamente digerito. Massaggiare delicatamente i lobi del fegato per facilitare la perfusione.
        Nota: Separazione della capsula di Glisson dal parenchima è osservabile in un fegato digerito correttamente. Per valutare questo, utilizzare il bordo non tagliente di un paio di pinze, premere delicatamente il lobo laterale di sinistra. Un'impressione dovrebbe apparire sulla superficie e il rientro dovrebbe riempire lentamente una volta rimosso il forcipe.
      14. Rimuovere l'ago dalla subhepatic IVC. Non rimuovere le pinze emostatiche suprahepatic IVC di bloccaggio.
      15. Asportare l'intero fegato tagliando con attenzione attraverso la connessione utilizzando una lama dritta corta forbici di dissezione di legamenti e per rimuovere la cistifellea.
      16. Posizionare l'intero fegato in 10 cm di Petri contenente 10 mL ghiacciata Buffer di conservazione e conservare a 4 оC fino al pronto a liberare le cellule.
    4. Dissociazione delle cellule di fegato
      1. Trasferire il fegato a un piatto di 10 cm contenente 10 mL DMEM ghiacciata.
      2. Afferrare la mozzata suprahepatic che IVC attaccato al fegato asportato utilizzando una pinza dentata. Utilizzare pinze punta media per rilasciare le cellule dalla capsula di Glisson applicando il rapido movimento di carezze per ogni lobo.
      3. Passare il DMEM saturi attraverso un colino di cella µm 70 collegata ad un tubo di raccolta di 50 mL.
      4. Pipettare 10 mL ghiacciata DMEM al 10 cm di Petri e ripetere i passaggi da 1.2.4.1 a 1.2.4.3 fino a saturazione dei media non è osservata. Posizionare la sospensione cellulare in ghiaccio o a 4 ° C.
      5. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare capovolgendo la provetta di raccolta e poi Centrifugare a 54 x g per 2 min a 4 ° C.
      6. Raccogliere il surnatante in un tubo di raccolta pulita da 50 mL. Poi Centrifugare la sospensione cellulare a 54 x g per 2 min a 4 ° C.
      7. Ripetere il passaggio 1.2.4.6 altre due volte prima di procedere al passaggio 1.2.4.8.
      8. Trasferire il surnatante in una provetta pulita 50 mL-collezione e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
      9. Risospendere il pellet di cellule non parenchimali nel buffer di FACS e contarli in un camera di Burker/emocitometro.
      10. Trasferire 1 x 106 cellule (per citometria a flusso di base) o 15 x 106 - 20 x 106 cellule (per FACS) a sfondo sferico polistirolo provette 5 mL. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.
  3. Dissociazione e l'isolamento dell'aorta
    Nota: Questo protocollo è stato adattato dal macellaioet al.26
    1. Preparare i buffer di tessuto-specifica basati sulle ricette fornite nella tabella 1 e memorizzarli come descritto.
    2. Preparare i seguenti reagenti.
      1. Preparare il tampone di digestione di scongelamento il volume appropriato di WAT dissociazione tampone e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Immediatamente prima dell'uso, caldo tampone a 37 ° C.
      2. Preparare una soluzione di eparina 10x sciogliendo eparina sale sodico in 1X PBS a una concentrazione di 200 U/mL. Diluire la soluzione di riserva di eparina con PBS 1X per preparare una soluzione di eparina di 1x 10x. Memorizzare il 10x e 1 x soluzioni eparina a 4 ° C fino all'utilizzo.
      3. Preparare il tampone di FACS con 1x PBS contenente il 2% FBS.
    3. Dissezione dell'aorta
      1. Eutanasia di un topo in una camera di biossido di carbonio riempito e risciacquarlo con etanolo al 70%.
      2. Posizionare il lato ventrale del mouse fino sul palco di dissezione, diffondere il mouse indietro e le zampe posteriori e fissarli alla scheda di dissezione usando gli aghi 21G.
      3. Immediatamente dopo l'eutanasia il mouse, eseguire la puntura cardiaca. Fare riferimento ai passaggi 1.3.3.4 a 1.3.3.9, se necessario.
      4. Individuare il processo xifoideo all'estremità inferiore dello sterno
      5. A tale scopo, posizionare un punto medio dito lungo la larghezza del collo dell'animale. Risalire lungo la linea mediana ventrale dal collo all'estremità caudale dello sterno finché non si avverte un'estensione cartilaginosa.
      6. Utilizzare pinze punto medio per afferrare l'estensione cartilaginosa e se necessario contrassegnare la posizione del processo xifoideo rimuovendo la patch dei capelli o della pelle nella zona.
      7. Parzialmente inserire un ago 26 G sotto il processo xifoideo angolazione di 20-30°.
      8. Delicatamente applicare una pressione negativa alla siringa ritirando lentamente lo stantuffo, quindi inserire l'ago più ulteriormente nella cavità fino a quando il sangue scorre.
      9. Se si interrompe il flusso sanguigno, ruotare l'ago lentamente o spostare leggermente in e fuori.
      10. Uso il paio di pinze per afferrare tenere della pelle addominale anteriore uretrale aprendo e usare un paio di forbici per dissezione tagliente per tagliare lungo la linea mediana ventrale attraverso il peritoneo dall'inguine al mento.
      11. Tirare indietro la pelle per esporre gli organi addominali e gabbia toracica con le dita o forcipe smussato spostare delicatamente gli organi addominali al lato.
      12. Utilizzare le pinze per afferrare tenere del processo xifoideo, sollevare lo sterno e incise il diaframma.
      13. Usando le forbici per dissezione, tagliare attraverso le costole laterali su entrambi i lati. Presa dello sterno, capovolgere la gabbia toracica verso l'alto e tagliare la base di collegamento. Rimuovere la gabbia toracica esponendo i sottostanti organi toracici.
      14. Irrorare l'aorta con un ago 26-gauge attaccato ad un 10 mL-siringa riempita di soluzione di eparina: 1x iniettando 1-2 mL di soluzione nel ventricolo sinistro (LV) del cuore.
        Nota: Assicurarsi di irrorare ad un ritmo lento con poca pressione affinché intatte lesioni aterosclerotiche aortiche.
      15. Asportare il timo, i polmoni e tessuto connettivo. Fare riferimento ai punti 1.3.3.16 e 1.3.3.17, se necessario.
        1. Anteriore al cuore individuare il bianco bilobato (o a forma di farfalla) organo e saldamente afferrare del timo con le pinze. Allontanarsi verso l'alto entrambi i lobi della cavità e tagliare alla base con le forbici.
        2. Per rimuovere i polmoni, pizzicare un lobo del polmone con il forcipe, tirare il tessuto dalla cavità toracica e tagliare alla base. Ripetere per ogni lobo restante.
      16. Utilizzare un microscopio di dissezione e micro-dissezione strumenti e raccogliere che arco aortica (compreso l'arteria innominate, arteria carotide comune sinistra e dell'arteria succlavia sinistra), l'ascendente, discendente, aorta toracica e addominale.
        1. Individuare l'aorta ascendente al ventricolo sinistro del cuore.
        2. Con un paio di curve 0.07 x 0.04 mm-punta forcipe afferra delicatamente la parte dell'aorta ascendente, emergenti dal ventricolo sinistro.
          Nota: Rispetto al tessuto grasso circostante tinto di giallo, l'aorta sarà un vaso bianco brillante proveniente da LV quando sufficientemente scaricata con la soluzione di eparina.
          1. Se l'aorta non è stato correttamente scaricata tramite aspersione cardiaca, irrigare l'aorta nuovamente mentre l'aorta rimane connesso alla cavità. Per effettuare questa operazione, tagliare nei pressi dello svincolo di cuore-aorta, togliere il cuore e poi tagliare orizzontalmente attraverso l'estremità inferiore dell'aorta addominale. Inserire un ago 26 G nell'apertura dell'aorta ascendente e lavare delicatamente l'aorta con l'eparina soluzione 1x.
          2. Tirare delicatamente l'aorta ascendente di discriminare meglio tra il tessuto adiposo e l'aorta incorporato.
          3. Ancora delicatamente sull'aorta ascendente, usare la punta della primavera chiuso forbici di dissezione per eliminare il grasso che incapsulano l'aorta ascendente e l'arco aortico. A tale scopo, corsa il tessuto grasso con la punta delle lame a forbice chiusa a strappare via il grasso comunicante.
            Nota: Evitare di asportare qualsiasi tessuto grasso dal taglio fino a quando l'aorta ascendente e l'arco può essere chiaramente visibili. Questo serve a prevenire l'aorta di taglio.
          4. Se l'aorta ascendente e l'arco può essere chiaramente delineati dal tessuto grasso di surround, è possibile utilizzare la molla per dissezione Forbici per asportare il grasso in eccesso.
          5. Afferrare delicatamente dell'arco aortico con il forcipe. Utilizzando nuovamente il suggerimento di forbici di primavera, colpo presso il grasso lungo la lunghezza dell'aorta discendente, toracica e addominale all'estremità caudale dell'aorta addominale, farlo sul lato destro del manicotto di grasso.
          6. Continuare a cogliere lungo l'aorta quando strappare via il grasso. Essere sicuri di fare così delicatamente per evitare di danneggiare l'aorta.
          7. Tirare delicatamente l'aorta ascendente verso il microscopio in modo che il grasso è ora posizionato dietro l'aorta.
          8. Inserire le lame a forbice chiusa tra l'interfaccia di grasso-aorta vicino l'estremità anteriore dell'aorta discendente, grave allegato di tessuto grasso alla superficie di aorta senza mezzi termini con un movimento ampio.
            Nota: Accuratamente rimuovendo l'eccesso di grasso e tessuto di collegamento mentre l'aorta è ancora all'interno della cavità è consigliabile.
          9. Asportare il cuore e tagliato trasversalmente verso l'estremità caudale dell'aorta addominale. Rimuovere l'intera aorta.
          10. Posto dell'aorta in un piatto di 35 mm e stuzzicare via grasso in eccesso sull'aorta usando due aghi 21 gauge. Posizionare l'aorta asportata nel tubo del microcentrifuge 1,7 mL sul ghiaccio.
    4. Dissociazione dell'Aorta in sospensioni di cellule singole
      1. Pipettare 0,2 mL aorta dissociazione di tampone nella provetta contenente l'aorta. Inserire le lame della forbice di primavera verso l'estremità conica del tubo e tritare rapidamente l'aorta per facilitare la digestione enzimatica.
      2. Trasferire il composto di tessuto-soluzione a un 15 mL collezione tubo e pipetta 1,8 mL aorta dissociazione buffer per un volume totale di 2 mL.
        Nota: Per il semplice trasferimento della sospensione del tessuto, tagliare il 1 cm la parte conica della punta di una pipetta di 1.000 µ l standard. Utilizzare la punta accorciata per trasferire la sospensione con una micropipetta.
      3. Incubare l'aorta macinata nel buffer di dissociazione dell'aorta per 55 min a 37 ° C, agitando a 220 giri/min (0,514 x g).
      4. Passare la sospensione attraverso filtro cella 50-µm in una provetta da 15 mL in polipropilene collezione. Utilizzare il pistone di gomma di un stantuffo della siringa per facilitare il filtraggio.
      5. Sciacquare il tubo di raccolta da 15 mL con buffer di 1 mL FACS, raccogliere la sospensione e passare attraverso il filtro delle cellule.
      6. Lavare il filtro di cella µm 50 due volte con 1 mL di tampone di FACS.
      7. Agglomerare le cellule mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Risospendere le cellule in freddo FACS Buffer. Contare le celle in una camera di Burker/emocitometro.
      8. Trasferire o cellule 1 x 106 (per citometria a flusso di base) o la sospensione di intera cella (per FACS) un 5ml con etichetta rotonda-fondo polistirene provette. Continuare alla sezione 2 per citometria a flusso protocollo di colorazione.

2. flusso Cytometry e FACS macchiatura

Fluoroforo R-ficoeritrina (PE) PE/cianina (Cy) 7 PE/cianina (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm) Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm) Blu (488 nm) / giallo (561-570 nm) - verde (532 nm) Violetto (405 nm)
EccitazioneMAX (nm) 496 496 496 401
EmissioneMAX (nm) 578 785 667 455
Marcatore fenotipico F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 Integrina αX, integrina αX catena, CR4, p150, ITGAX ΑM integrina, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Tipo di cella mirati Macrofagi residenti del tessuto Macrofagi attivati classicamente (M1) Monociti / macrofagi Leucociti (macrofagi / monociti, linfociti e granulociti)
Subset di cellule dendritiche Cellule dendritiche, cellule NK, linfociti T attivati e un sottoinsieme di intestinali linfociti intraepiteliali (IEL) Granulociti, cellule dendritiche, cellule NK e sottoinsiemi di cellule T e B
Fattore di diluizione 01:50 1: 100 1: 100 1: 100
Controlli di isotipo PE del ratto IgG2a Criceto armeno PE/Cy7 IgG PE/Cy5 topo IgG2b IgG2c ratto Blu Pacifico

Tabella 2: Elenco del fluoroforo contrassegnati gli anticorpi specifici per discriminante macrofagi residenti di tessuto.

  1. Raccogliere e preparare i seguenti elementi: tubi di polistirolo di turno-fondo di FACS Buffer 5 mL, recettore CD16/32 Fc anti-topo blocco dell'anticorpo, fluoroforo coniugato o unconjugated anticorpi primari, anticorpi secondari coniugati fluoroforo (se necessario), 1x tampone fosfato salino (PBS).
    Nota: Per la macchiatura grandi quantità di cellule, la concentrazione di anticorpi è più critici piuttosto che di numero di cellulare. Ad esempio, se colorazione 10x106 celle il volume di accumulo colorazione e concentrazione di anticorpi dovrebbe essere lo stesso come se colorazione 1.0 x 106 celle in 100 µ l di tampone. Per la colorazione 1.0 x 108 cellule, aumentando la quantità di anticorpo 5 volte è raccomandato.
  2. Eventualmente, aggiungere ulteriori ghiacciata FACS Buffer per ogni tubo di FACS, pellet di cellule mediante centrifugazione a 751 x g per 5 min (4 ° C). Aspirare il surnatante in seguito a centrifugazione.
  3. Aggiungere recettore CD16/CD32 Fc anti-topo blocco dell'anticorpo a tutti i campioni secondo le istruzioni del produttore. Incubare per 15 min a 4 ° C o su ghiaccio.
  4. Aggiungere esempi di anticorpo primario coniugato fluoroforo cocktail direttamente al recettore Fc blocco contenenti anticorpi delle cellule sospensione ed incubare a 4 ° C per 30 min. Protect esempi dalla luce per ridurre al minimo lo sbiancamento di anticorpi coniugati fluoroforo.
    1. Nel caso in cui sono stati utilizzati anticorpi primari non coniugati, eseguire la procedura a seguito di completamento passo 2.4.
    2. Anticorpo primario Wash macchiato campioni mediante centrifugazione a 751 x g per 5 min (4 ° C).
    3. Rimuovere il surnatante di decantazione e risospendere il pellet in 100 µ l di tampone di FACS.
    4. Anticorpo secondario coniugato in tutti i campioni necessari ed incubare per 30 min a 4 ° C. Procedere al punto 2.5.
  5. Incubazione dell'anticorpo seguente, aggiungere 2 mL di buffer di FACS freddo ghiaccio poi a pellet di cellule a 751 x g per 5 minuti (4 ° C). Decantare il supernatante ed essere sicuri di non disturbare il pellet.
  6. Mescolare delicatamente le cellule e quindi risospendere con 200-400 µ l di tampone di FACS, quindi tenetelo al buio a 4 ° C fino a analisi di citometria a flusso standard o ordinamento delle cellule.
  7. Per il fissaggio di breve termine delle cellule marcate, procedere a passi 2.8 a 2.10. Utilizzare la fissazione per la citometria a flusso standard solo.
  8. Subito dopo passo 2.5, risospendere le cellule in 0,5 mL 2-4% paraformaldeide (PFA) per 15-30 min a 4 ° C.
    Nota: Attenzione: PFA è un noto irritante con effetti cancerogeni e tossici. Quando si utilizza PFA, maneggiare con cura estrema. Assicurarsi di utilizzare appropriati dispositivi di protezione individuale e ventilazione di scarico.
  9. La fissazione seguente, lavare le cellule con l'aggiunta di 2 mL FACS tampone a tutti i campioni e centrifugare a 751 x g a 4 ° C per 5 min. Remove surnatante in seguito a centrifugazione.
  10. Risospendere le cellule fissate in 200 µ l di tampone di FACS freddo ghiaccio e conservare a 4 ° C. Negozio fix celle fino a 1 settimana a 4 ° C, idealmente effettuare l'acquisizione di citometria a flusso entro 48 ore per ridurre al minimo autofluorescenza.
  11. Acquisire dati di cytometry di flusso secondo le istruzioni del produttore citometro a flusso o eseguire ordinamento fluorescente delle cellule attivate come descritto da Basu et al. 23

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Representative Results

Quando si utilizza dell'apolipoproteina E (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) topi mantenuti su una dieta di alto colesterolo alto grasso (HCHFD o HCD) per 18 settimane, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ F4/80 macrofagi aortici possono essere isolati, quando i due campioni sono in pool. Fegati sezionati da topi KO per ApoE HFHCD-Federazione, prodotto maggiore di cellule di Kupffer5 ordinato 5 x 10 (che dipende dal tempo di ordinamento disponibile). Quando utilizzando dieta grassa alta (HFD) alimentato topi C57BL/6 wild type (WT), 5 x 105 ai macrofagi di 1 x 106 residente del tessuto adiposo (ATM) possono essere ordinati dalla frazione vascolare stromal (SVF). Il numero totale accennato dei macrofagi che possono essere ordinate da un dato tessuto era adeguato per l'esecuzione di analisi di espressione genica mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa tempo reale (qPCR). Per tessuti dove vengono recuperati meno numeri delle popolazioni di macrofagi, quali l'aorta, si consiglia di utilizzare co-precipitanti (ad esempio glicogeno) e precipitazioni durante la notte quando isolamento di RNA è necessaria per queste analisi.

Qui, gli effetti dei disordini metabolici indotti da dieta sul fenotipo del macrofago utilizzando base citometria a flusso, ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule (FACS) e ordina a valle post analisi sono mostrati. Questi risultati confermano le osservazioni precedentemente pubblicate che i topi hanno alimentato un HFD o HFHCD esposizione aumentata infiltrazione dei macrofagi (M1) classicamente attivati nei tessuti affetti come l'aorta (Figura 1B). Approfittando della citometria a flusso, FACS ed espressione genica (tramite reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), il fenotipo predominante per tirosina del recettore Ron chinasi-esprimendo CD45+ + F4/80 macrofagi derivati da tessuti isolati da topi di dieta-federazione è stata osservata. Ron che esprimono recettori aortici macrofagi che hanno dimostrato un fenotipo anti-infiammatorio sono stati diminuiti nei topi HFHCD-Federazione (Figura 1 e D). Macrofagi che esprimono recettori di ordinato Ron derivano da aumentata dell'arginasi dimostrata digerito aorte 1 espressione genica (Arg1), che è un indicatore di macrofago M2 ben consolidato (Figura 1E). I macrofagi pro-infiammatorie che sono stati caratterizzati come CD45+ + CD11c F4/80+ sono stati aumentati in aorte isolati dai topi HFHCD-Federazione (Figura 1B e D). Che caratterizzano i macrofagi residenti fegato ulteriormente chiarito il fenotipo prevalente delle sottopopolazioni che esprimono recettore Ron (Figura 2A). CD11c + popolazioni pro-infiammatorie del macrofago ha dimostrato una diminuzione espressione di geni che sono fortemente associati con un fenotipo (M2) antinfiammatorio quali Arg1 e Ron (Figura 2B). Tendenze simili sono state osservate in popolazioni di macrofagi isolate da digerito tessuto adiposo bianco (Figura 3). Popolazione del macrofago con una firma pro-infiammatorie ha mostrato superficie diminuita espressione del recettore Ron (Figura 3). Combinazione di approcci, citometria a flusso di base e FACS, ha provocato dati conclusivi che ulteriore convalida il recettore Ron come regolatore di attivazione alternativo (M2) in macrofagi32. Tale polarizzazione verso un fenotipo (M2) antinfiammatorio è stato indicato per svolgere un ruolo protettivo nello sviluppo e nella progressione di obesità, aterosclerosi e steatoepatite31.

Figure 1
Figura 1: Caratterizzazione dei macrofagi isolati dall'aorta dissociata rimosso dai topi ApoE KO mantenuti su un HCD per 18 settimane. (A) cellule erano in primo luogo recintate il CD45+ leucociti, escluse detriti cellulari. (B) CD45 macchiatura in combinazione con F4/80 viene utilizzata per delineare doppie popolazioni positivi presume essere macrofagi. Ulteriori gating è stato utilizzato per dimostrare la percentuale di CD11c+CD45+F4/80+ (M1) e Ron (C)+CD45++ (potenziale M2) F4/80 i macrofagi in aorte derivate da topi alimentati su entrambi un cibo normale o dieta ricca in colesterolo per 18 settimane. (D) aumentata percentuale di CD11c+CD45++ (M1) F4/80 macrofagi, come pure una diminuzione percentuale di Ron+CD45++ (potenziale M2) F4/80 i macrofagi sono stati osservati in aorte derivati da topi alimentati HCD rispetto ai topi alimentati una dieta normale del cibo. (E) analisi dell'espressione genica di Ron ordinato+CD45+F4/80+ macrofagi hanno dimostrato l'espressione aumentata dell'arginasi io (un indicatore ben noto murino M2). I valori sono stati ottenuti usando le analisi dello studente t-test eseguiti utilizzando software di analisi statistica e rappresentato come media ± SEM. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo (* P < 0,05, * * * P < 0,001). Nella figura è stata modificata da Yu et al. (2016) 31. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: trascrizione genica delle popolazioni di cellule di Kupffer ordinate dai fegati digeriti dissecato dai topi ApoE KO mantenuti su un HCD per 18 settimane. (A) schema di gating generali per la caratterizzazione e l'ordinamento di popolazioni di cellule di Kupffer. (B) analisi di espressione genica di ordinato Ron esprimendo (Ron+) e non-esprimendo (Ron–) CD45++ F4/80 macrofagi tramite RT PCR quantitativa. Analisi test t di Student sono stati eseguiti utilizzando il software statistico e i valori sono stati rappresentati come media ± SEM. P < 0,05 è stato considerato statisticamente significativo (* P < 0,05, * * * P < 0,001). Nella figura è stata modificata da Yu et al. (2016) 31 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Caratterizzazione di ATMs isolato dal tessuto adiposo bianco sezionato da topi WT BL6 alimentati un HFD per 18 settimane. Regime di gating generale (A) per la caratterizzazione e l'ordinamento del tessuto adiposo derivato popolazioni del macrofago (B) percentuale di Ron + celle all'interno di CD45++CD11c F4/80– e CD45++CD11c F4/80+ popolazioni di macrofagi ordinati dal WAT. Nella figura è stata modificata da Yu et al. (2016) 31 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Modelli di malattia metabolica indotta da dieta che imitano co-morbidità, quali aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite e diabete di tipo 2 sono ampiamente utilizzati per comprendere meglio i meccanismi molecolari della progressione di malattia. Dipendente dalla digestione della collagenosi viene spesso utilizzata per dissociare tessuti per liberare le cellule dalla matrice extracellulare (ECM)16,27. Enzimi quali la collagenasi perturbare collagene che fornisce il supporto strutturale per cellule vicine. Composizione strutturale dei tessuti determina la rigidità di matrice dei tessuti (resistenza alla deformazione) e quale prodotto grezzo collagenasi è più efficiente per garantire successo ECM perturbazione28. WAT, che si compone di "matrice morbida" spesso viene digerito con collagenasi tipo II per liberare adipociti e cellule immuni residenti mantenendo nel contempo l'integrità della cellula insulina superficie recettori29. La microarchitettura delle componenti della fibrilla dell'aorta contribuisce alla "matrice rigida", per il quale efficace digestione aortica con tipo collagenosi XI (che ha la più alta attività della collagenosi) è usata in combinazione con enzimi addizionali. A differenza dell'aorta, la digestione del fegato utilizza una collagenosi con una più debole attività enzimatica, collagenasi di tipo IV, di perturbare la matrice e liberare le cellule parenchimali e non-parenchimali vitali30. Cronicamente inflamed tessuti derivano da dieta-federazione wild type o carenti dell'apolipoproteina E (ApoE KO) topi su una C57BL6 sfondo subiscono spesso rimodellamento che possono impedire la corretta digestione enzimatica. Questa sezione vengono descritte le strategie per ridurre al minimo e/o eliminare la possibilità di dissociazione del tessuto improprio e recupero delle cellule basso.

Una caratteristica comune dei tessuti derivati dai modelli di dieta-federazione del mouse che imitano l'obesità, aterosclerosi, e/o affezione epatica grassa non alcolica, è il rimodellamento del tessuto anormale. Nel tessuto adiposo bianco, l'aorta e il fegato, la composizione di ECM è alterata, spesso con conseguente deposizione eccessiva di componenti fibrillari come collageni. Topi C57BL6 mantenuti su una dieta grassa alta diciotto settimane, le anomalie del tessuto-specifici come il tessuto adiposo bianco espanso di esperienza e ingrandito fegato grasso (steatosi semplice). Spesso queste caratteristiche metaboliche non sono fastidiosi ostacoli da superare durante il processo di dissociazione del tessuto. D'altra parte, in altri modelli di dieta ha indotto che rispecchiano più esacerbati fenotipi, il vasto rimodellamento del tessuto può rappresentare un problema durante la digestione del tessuto. HFHCD topi ApoE KO alimentati sono spesso utilizzati per modello aterosclerosi e steatoepatite. Una caratteristica comune associata avanzate steatoepatite è l'eccessiva deposizione di ECM nel fegato (o fibrosi). Fegato fibrotico ha dimostrato di essere piuttosto problematico durante dissociazione enzimatica del tessuto e spesso produce cellule basso rendimento31. Per migliorare il rendimento delle celle, è fondamentale che i protocolli di digestione seguita senza deviazione. Anche se fegati normali possono essere macinati e sommerso nel buffer di digestione per raggiungere dissociazione, aspersione con buffer di digestione massimizza il contatto tra la matrice extracellulare del fegato e la soluzione di collagenasi; e questo approccio è pertanto vivamente consigliato. Inoltre, 20-30 mL di tampone di digestione è spesso un adeguato volume per successo dissociazione di fegati normali; Tuttavia, per quanto riguarda modelli murini che sviluppano fegati allargati e/o fibrotici, aspersione con 50 mL di tampone di digestione è preferito per garantire una corretta digestione riducendo al minimo la morte delle cellule. Per i fegati con pesi che superano notevolmente 1,5 g, aumentando il volume di tampone di digestione è consigliabile per garantire successo digestione.

Tessuto Problema Motivo possibile Soluzione
Tessuto adiposo bianco (WAT) Dissociazione di povera cella Cattiva digestione Assicurarsi che il buffer di digestione è a 37° C
Morte delle cellule Digestione della collagenosi eccessivo Ridurre i tempi di digestione
Ridurre il volume di tampone di digestione
Aorta Dissociazione di povera cella Cattiva digestione Assicurarsi che il buffer di digestione è a 37 ° C
Pezzi di aorta nel buffer di digestione erano troppo grandi Assicurarsi dell'aorta è tagliato in pezzi di circa 1 mm
Pezzi di aorta non tremavano nel buffer di dissociazione durante l'incubazione Essere sicuri di pezzi dell'aorta sono agitazione della soluzione di digestione
Morte delle cellule Digestione della collagenosi eccessivo Ridurre i tempi di digestione
Ridurre il volume di tampone di digestione
Fegato Dissociazione di povera cella Cattiva digestione Assicurarsi che il buffer di digestione è a 37 ° C
Aumentare il volume di tampone di digestione
Inserimento di una canula improprio di IVC (gonfiore dei tessuti che circostanti IVC si verifica) Essere sicuri dell'ago sia inserito correttamente nell'IVC
IVC rotto Proteggere adeguatamente i ago in IVC prima dell'aspersione
Ridurre la velocità di perfusione
Tessuto rotto Ridurre la velocità di perfusione
Morte delle cellule Improprio rilascio delle cellule dalla capsula di Glisson Essere sicuri di dissociare le cellule dall'utilizzo di capsule precedentemente discusso accarezzando il metodo.
Digestione della collagenosi eccessivo Ridurre i tempi di digestione
Ridurre il volume di tampone di digestione

Tabella 3: risoluzione dei problemi di dissociazione infruttuoso tessuto. Flusso cytometry basata cella ordinamento o FACS è una potente tecnica per isolare popolazioni cellulari dove elevata purezza è una necessità. Quando purificante celle di ordinamento delle cellule, ottenendo il rendimento delle celle ad alta, ma anche una sorta di elevata purezza richiede utilizzando le strategie di ordinamento corrette. In questa sezione, metodi per il miglioramento della multi-fluoroforo flusso cytometry-base cella ordinamento del tessuto residente dei macrofagi derivati da topi di dieta-federazione sono descritti. Per l'isolamento del macrofago residente di tessuto distinti, selezione di superficie dell'indicatore è un passo fondamentale. Macrofagi derivati da WAT, dell'aorta e del fegato sono spesso distinguono utilizzando un CD45+, CD11b+, F4/80+ strategia di gating. Pannelli di cytometric di flusso aggiuntivo possono essere utilizzati per identificare macrofagi residenti del tessuto. Questi pannelli sono anticorpi che sonda per l'espressione di superficie dei complessi di macrofago glicoproteine specifiche (CD64, CD68 e CD14), maggiore di istocompatibilità (MHCII) e apoptotica delle cellule tirosina chinasi dei recettori (MerTK)32, 33. macrofago specifico fenotipo può quindi essere delineato tramite sondaggio per la selettiva espressione di superficie di M2 (CD163, CD209 e CD206) o M1 marcatori (CD38, CD40, CD80 e CD86)34,35. Auto-fluorescenza generata dai macrofagi lipido-carichi può presentare alcuni problemi quando popolazioni di gating. Usando gli anticorpi contrassegnati con fluorocromi che sono eccitati dal laser giallo-verde (come PE, PE/Cy5, PE/Cy7) o laser rosso (come APC, APC Cy7) provoca la fluorescenza emessa che è significativamente più luminosa di auto-fluorescenza e quindi possono migliorare Risultati36. Quando selezionando fluoroforo coniugati con tale alta colorazione indice e potenziale spettri di emissione sovrapposizione, inclusione di controlli appropriati è fondamentale. Quando si identificano i confini gating, l'inserimento di controlli singola macchia (SS) e isotype consente per la delineazione delle popolazioni di positivo/negativo e la misura del segnale di fondo causata da anticorpi primari, rispettivamente 37. per circostanze in cui le cellule sono scarse, si consiglia di utilizzare particelle di compensazione per i controlli di SS e isotype. Particelle di compensazione in genere emettono segnali più luminosi rispetto a controlli biologici e hanno anche meno varianza in fluorescenza di fondo. Inoltre, fluorescenza meno uno (FMO) controlli sono ideali per delineare i confini di gating. Includendo i controlli FMO, la fluorescenza massima prevista per un sottoinsieme di colorazione si rivela in un determinato canale quando l'anticorpo fluorocromo-tag specifico per quel canale particolare fluorescenza è escluso38. Nella nostra esperienza, oltre ai controlli di particella singola compensazione macchiato, un controllo biologico non macchiate di confronto deve essere incluso per l'impostazione più precisi confini di positivo/negativo.

Esclusi i detriti cellulari e aggregati cellulari nella strategia di gating è anche un approccio aggiuntivo utilizzato per ridurre l'auto-fluorescenza. Per distinguere la popolazione di cellule vitali detriti cellulari, utilizzando forward scatter (FSC) e side scatter (SSC) è la strategia più comune di gating. Per cellule isolate che verranno utilizzate per le analisi di tipo post e richiedono maggiore redditività per l'estrazione di DNA/RNA, è consigliabile che macchie di redditività non essere utilizzato con qualsiasi procedura di fissazione e/o permeabilizzazione. Formaldeide di fissaggio delle cellule può compromettere l'integrità dell'acido nucleico a causa degli acidi nucleici-proteine reticolazione e quindi limitare l'efficienza di isolamento, la rilevazione e quantificazione accurata. Aggregati cellulari come accennato prima non possono solo contribuire a segnali di auto-fluorescente emessi, ma anche tradursi in "coincidenza terminazioni". Tale azione si verifica per mantenere elevata purezza in una sorta ma se troppo frequenti, riduce il rendimento delle celle ordinato. Ordinamento buffer (buffer di FACS) completati con DNasi e MgCl2 durante la colorazione delle cellule può ridurre l'aggregazione delle cellule. Si consiglia di non utilizzare EDTA in combinazione con dnasi in quanto inibisce l'attività dell'enzima. La sospensione unicellulare che filtra attraverso un colino di cella di 70 µm prima dell'ordinamento può anche liberare le cellule da aggregati. È indispensabile tenere presente che per ridurre al minimo l'aggregazione, sospensioni delle cellule dovrebbero essere ad una concentrazione di 5 milioni di cellule per mL in un volume minimo di 0,4 mL. Cellule isolate da tessuti di lipidi tendono ad essere più inclini all'aggregazione e questo può comportare una coincidenza terminazioni e sorta di basso rendimento. Si raccomanda che i campioni sono ulteriormente diluiti Se persiste l'aggregazione. Macrofagi ordinati possono essere raccolti in provette di polipropilene fondo tondo collezione contenenti fetale bovino medio ricco per massimizzare il recupero delle cellule. Un'alta concentrazione di FBS iniziale accerta il recupero di cellule poiché la concentrazione alla fine diventa diluita con ogni goccia ordinato. Per la raccolta di cellule che verranno utilizzate per l'analisi del DNA o RNA, le cellule possono essere ordinate direttamente nel reagente di estrazione appropriato (ad es. TriZol) per prevenire la contaminazione RNasi. Durante l'ordinamento di volumi elevati, ordinamento celle prima in terreni di coltura completati con concentrazioni più basse di FBS, è raccomandato. Immediatamente dopo l'ordinamento, le cellule dovrebbero quindi essere pellettate e lisate per estrazione DNA/RNA. Il materiale genetico isolato può quindi essere profilato per alterata espressione genica. Geni pro-infiammatori compreso TNFα, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 e MCP1 (CCL2) spesso sono sovraregolati nei macrofagi che esibiscono un fenotipo di classicamente attivati (M1)39. D'altra parte, il fenotipo (M2) in alternativa attivato nei macrofagi è spesso segnata da induzione dei geni che codificano Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 e TGFβ34,40. Recentemente, CD38, Fpr2 e Gpr18 sono stati convalidati come M1 specifici geni e c-Myc ed Egr2 come M2 specifici geni34.

Anche se multi-colore flusso cytometry-base cella ordinamento è uno strumento prezioso per isolare i macrofagi a elevata purezza, questo approccio può essere costoso. I potenti vantaggi del FACS mediata ordinamento dipendono dal personale operativo che possono manovrare un sorter delle cellule oltre l'alto costo dei reagenti di manutenzione del selezionatore delle cellule. Approcci alternativi possono essere utilizzati in sostituzione di costoso flusso cytometry basato ordinamento delle cellule. Essi comprendono magnetico cellulare attivato l'ordinamento (Mac) o centrifugazione in gradiente di densità. La prima cella alternativa metodo accennato di ordinamento comprende magnetico e/o kit di isolamento della microperla colonna per separare le cellule di interesse dal sangue o tessuti solidi41. La seconda cella ordinamento approccio separa una sospensione di cellule eterogenee basata sulla densità e forza di centrifugazione. Purtroppo, densità mediata centrifugazione non è pratico per isolare i macrofagi da aorta - o WAT-derivati di sospensioni di cellule singole. Spesso, il prodotto ottenuto mediante centrifugazione differenziale è contaminato e di bassa resa. Di conseguenza, più piccoli tessuti (ad esempio l'aorta o WAT) che si traducono in alcune cellule inizialmente dopo digestione enzimatica non sono candidati ideali per centrifugazione differenziale. D'altra parte, sospensioni di cellule derivate dai fegati dissociati possono produrre un numero adeguato di macrofagi ordinati che può essere utilizzato in esperimenti di tipo post e analizza come stimolazioni di cultura, qPCR o analisi macchiante occidentale. Questi approcci alternativi è utilizzabile anche per arricchire le popolazioni prima del FACS, consentendo per i tipi più puliti. Di nota, macrofagi residenti tessuto costituiscono una piccola percentuale della popolazione intera cella in WAT, fegato e l'aorta. Arricchimento delle cellule prima del FACS l'ordinamento è stato un approccio utilizzato quando isolare popolazioni di cellule che sono meno frequenti. Una questione che è comune nelle piccole popolazioni di isolamento è quella cella grande numeri devono essere elaborati per ottenere abbastanza cellule per la successiva analisi. Arricchimento o pre-ordinamento consente di risolvere tale problema. Questo metodo aiuta a ottenere una popolazione più concisa delle cellule attraverso la selezione positiva e negativa, ma permette anche la conservazione del tempo come FACS l'ordinamento può essere un processo duraturo per le origini di tessuto denso come il fegato.

Recenti progressi della biologia di infiammazione sottolineano l'importanza della caratterizzazione fenotipica e funzionale di eterogeneità dei macrofagi per favorire la comprensione del ruolo del complesso di queste cellule immunitarie nel regolare l'infiammazione cronica. In breve, questo protocollo completo fornisce un approccio multi-dimensionale per la caratterizzazione dei tessuti macrofagi residenti dai tessuti di tre hallmark studiati nell'obesità dieta stabilita ha indotto e modelli di infiammazione. Ancora più importante questo protocollo prende in considerazione la difficoltà e le misure necessarie per isolare pulito singole sospensioni cellulari da dysregulated infiammato tessuti quali WAT, placche aortiche e fegati grassi. Il protocollo consente al ricercatore di applicare FACS strumenti ordinamento in una dimensione innovativa per caratterizzare i macrofagi residenti di tessuto, regolatori chiave di infiammazione nell'obesità e citometria a flusso. Approfondita caratterizzazione della dinamica di popolazione di macrofago può fornire la comprensione nei monociti traffico in tessuti infiammati e consentono continuati meccanicistici valutazioni attraverso una moltitudine di approcci sperimentali sui macrofagi ordinati. Ulteriore caratterizzazione delle popolazioni del macrofago in grado di fornire una visione fondamentale i fondamenti biologici che regolano la eterogeneità dei macrofagi nella salute e nella malattia.

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Disclosures

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare il flusso Cytometry Core Facility presso The Pennsylvania State University Millennium scienza complessa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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