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Immunology and Infection

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55445
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

Summary

Este protocolo permite que um pesquisador isolar e caracterizar residente em tecido marca de macrófagos em vários tecidos inflamados, extraídos de modelos induzida por dieta de distúrbios metabólicos.

Abstract

A obesidade promove um estado inflamatório crônico que em grande parte é mediado por macrófagos de tecido-residente, bem como macrófagos derivados de monócitos. Obesidade induzida por dieta (DIO) é um modelo valioso em estudar o papel da heterogeneidade de macrófagos; no entanto, os isolamentos adequados macrófago são difíceis de adquirir de tecidos inflamados. Neste protocolo, descrevem as etapas de isolamento e necessárias diretrizes de solução de problemas derivadas de nossos estudos para a obtenção de uma população adequada de tecido-residente de macrófagos de ratos após 18 semanas de alto teor de gordura (HFD) ou gordura/alta-colesterol ( Intervenção de dieta HFHCD). Este protocolo incide sobre três tecidos de hallmark estudados na obesidade e aterosclerose, incluindo o fígado, os tecidos de adiposo brancos (WAT) e a aorta. Destacamos o uso como dualista de fluxo cytometry pode alcançar uma nova dimensão de isolamento e caracterização de macrófagos de tecido-residente. Uma seção fundamental do presente protocolo aborda a complexidade subjacente digestões enzimáticas de tecido-específica e isolamento do macrófago e subsequente da pilha-superfície anticorpo mancha para análise de fluxo cytometric. Este protocolo aborda existentes complexidades subjacentes fluorescente-ativado da pilha (FACS) de classificação e apresenta esclarecimentos para essas complexidades a fim de obter a caracterização de ampla gama de populações de células adequadamente classificada. Métodos alternativos de enriquecimento estão incluídos para classificação de células, tais como o fígado densa, permitindo a gestão de tempo e flexibilidade quando se trabalha com FACS. Em breve, este protocolo auxilia o pesquisador para avaliar a heterogeneidade de macrófagos de uma infinidade de tecidos inflamados em um determinado estudo e fornece dicas de solução de problemas perspicazes que foram bem sucedidas para caracterização e isolamento celular favorável de células do sistema imunológico em inflamação mediada por DIO.

Introduction

Modelos de mouse têm sido extensivamente usados para estudar a dinâmica de doenças humanas. Isolamento adequado, residente de células de tecidos de ratos em um estado doente pode fornecer uma plataforma para a compreensão das contribuições moleculares e celulares para a patogênese de uma doença1. Uma doença que é de importância crucial é a obesidade. A incidência de obesidade continua a aumentar em todo o mundo em paralelo com a resistência à insulina e o tipo 2 diabetes mellitus, doença cardiovascular e esteatose hepática2,3. Consumo excessivo de nutrientes é ainda mais distorcido pela diminuição da atividade física, desencadeando alterados sinais provenientes do tecido adiposo, o que pode alterar o meio celular de outros tecidos periféricos como a aorta e fígado4. Tal rompimento da homeostase metabólica resulta em uma crônica de baixo grau de inflamação sistêmica5.

Clássica ativação de macrófagos residentes para a aorta e fígado, bem como o recrutamento para o tecido adiposo branco (WAT) tem demonstrada não só iniciar dysregulation do metabólicos sinais mas também sustentar inflamação6,7. A heterogeneidade fenotípica e funcional de macrófagos é fortemente associada com a patogênese da obesidade relacionada co-morbidades7. A plasticidade dinâmica na polarização do macrófago permite que estas células que exibem uma variedade de fenótipos registrados que coordenam a progressão e a resolução da inflamação8. Enquanto classicamente ativados macrófagos (M1) estão implicados na propagação da inflamação, alternativamente ativados macrófagos (M2) foram associados com resolução e tecido reparação9,10.

Como o corpo sofre estresse metabólico, o tecido adiposo branco anormalmente acumula. O tecido adiposo expandido atrai e retém células inflamatórias que alterar profundamente a função normal dos adipócitos para promover a resistência à insulina, hiperglicemia e, finalmente, diabetes mellitus tipo 2, resistência à insulina ou hiperglicemia11, 12. Em paralelo, tecido adiposo branco remodela em resposta a sinais inflamatórios lançado pela infiltrou-se classicamente registrados (M1) tecido adiposo macrófagos (ATMs)13,14. Este órgão multicelular exerce uma cascata de sinais que desvia a função normal de outros órgãos do corpo tais como a aorta e hepática4.

O fígado é uma potência metabólica que adapta-se em resposta aos estímulos provenientes da vizinha desregulação WAT15. Hepáticos macrófagos ou células de Kupffer, em resposta a alterações metabólicas, secretam citocinas inflamatórias que transformam ambos parenquimatosa e fenótipo de células não-parenquimatosas e promovem a remodelação do tecido. Acúmulo de lipídios hepático, inflamação, depósitos excessivos de matriz extracelular, necrose e função eventual perda segue os insultos inflamatórios, contribuindo para o amplo espectro de danos no fígado associados com doença hepática gordurosa não-alcoólica 16,17,18.

Em paralelo a WAT comprometido e função hepática, grandes artérias acumulam lipídios dentro da parede arterial como o corpo sofre de estresse metabólico crônico19. Acúmulo de lipídios arterial desencadeia a secreção de quimiocinas pelas células endoteliais ativadas e subsequente recrutamento de monócitos20. Uma vez recrutados, monócitos proliferam, diferenciam, ingerem lipoproteínas e tornar-se células de espuma. Atherogenesis é iniciada e sustentada pela atividade pró-inflamatória dos recrutados e macrófagos residentes tecido de lipídios-carregados. Sucumbir a sinais de estresse extracelular e intracelular, retransmitidos neste microambiente aterogênico, esses macrófagos então se envolver em uma cascata de sinalização de apoptotic. Como essas células espuma morrem, eles contribuem seu conteúdo lipídico preenchido para o núcleo necrótico da lesão, que então leva a ruptura da placa, infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.

Coletivamente, a heterogeneidade dos fenótipos de macrófagos em parte organiza a obesidade induzida por alterações inflamatórias observadas nos tecidos de desregulação como WAT, fígado e aorta8,21. Caracterização de recrutados e macrófagos residentes tecido poderiam fornecer insights sobre potenciais alvos moleculares que manipulam o macrófago fenótipo1. Para efetivamente caracterizar os macrófagos dos tecidos inflamados induzida pela obesidade, uma suspensão de célula única pode ser obtida através de digestão enzimática. Esses protocolos de dissociação devem ser eficazes em suficientemente degradante do tecido conjuntivo, minimizando a morte celular imune e oferece um rendimento de célula ideal. A mistura de enzima é dependente do tipo de tecido e seu tornar-se estrutural. Tecidos resistentes, tais como a aorta requer mais forte atividade enzimática, em comparação com o fígado e o WAT, para alcançar a dissociação de tecido. Da suspensão de célula única, macrófagos residentes de tecido podem ser inequivocamente caracterizados ou isolados para ainda mais a jusante análises tais como criação de perfil transcricional.

Aqui um protocolo específico de tecido é descrito que usa tecido dependente de colagenase digestão e citometria de fluxo policromático efetivamente isolar e caracterizar macrófagos residentes tecido obtidos de obesidade dieta tradicional induzida, aterosclerose, simples esteatose e esteatohepatite mouse modelos. Simultânea de coloração de marcadores de superfície celular com anticorpos contra leucócitos-(CD45 e/ou CD11b) e macrófago - antígenos específicos (F4/80) é frequentemente usado para identificar as populações de macrófagos22. Fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação é uma poderosa estratégia usada para classificar essas populações identificadas em elevado grau de pureza. População classificada, então, pode ser avaliada para perfis de fenótipo gene específico usando a jusante análise molecular (tais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa)23. Apesar de citometria de fluxo padrão e classificação de celulares baseados em citometria de fluxo são ferramentas poderosas na distinção entre macrófagos dentro de uma suspensão de células vastamente heterogêneos, os antigos protocolos devem ser otimizados para garantir uma saída bem sucedida. Neste estudo, são descritos os protocolos que efetivamente isolar e caracterizam os macrófagos específicos do tecido viável; mais importante, este estudo fornece insight crucial sobre questões técnicas que muitas vezes surgem, bem como estratégias proativas e resolução de problemas para prevenir e/ou resolvê-los.

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Protocol

Todos os protocolos experimentais (seções 1, 1.2 e 1.3) foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e uso Comité (IACUC) na Universidade Estadual da Pensilvânia.

Tecido Preparação de Buffers de dissociação Volume final Armazenamento
Tecido adiposo branco (WAT) Buffer de dissociação: 2,5% HEPES, albumina de soro bovino (BSA) de 10 mg/mL, 3 mg/mL (0,3%) Colagenase tipo II em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) com glicose de 4,5 g/L, sem piruvato de sódio e e L-glutamina 500 mL menos 80° C (alíquotas de 10 mL)
Fígado 25 x concentrado de tampão de perfusão (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150mm de NaOH em água destilada deionizada H2O 500 mL menos 20° C (alíquotas de 40 mL)
Buffer de preservação (PRB): BSA de 1% em tampão de perfusão 1x 1 L 4 ° C
Buffer de dissociação: 1 x perfusão Buffer suplementado com 4,76 mM CaCl2 e 72 U/mL colagenase tipo IV 50 mL (por rato) Prepare-se imediatamente antes da utilização
Aorta Buffer de dissociação: 125 U/mL colagenase tipo XI, 60 U/mL hialuronidase tipo I, 60 U/mL DNase eu, 450 U/mL colagenase tipo I, 20 mM HEPES 1 x salino de tampão fosfato (PBS) 500 mL menos 80° C (alíquotas de 10 mL)

Tabela 1: Receitas do amortecedor tecido específico de perfusão.

1. dissociação e isolamento de tecido

  1. Dissociação e isolamento de WAT
    1. Preparar os buffers de tecido-específica, conforme tabela 1e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare o tampão de digestão por descongelar o volume apropriado de buffer de dissociação de WAT e loja a 4 ° C até o uso. Imediatamente antes do uso, aquecer o buffer para 37 ° C. Prepare o buffer de FACS, preparando 1x tampão fosfato salino (PBS) contendo 2% de soro fetal bovino (FBS).
    3. Isolamento de WAT
      1. Eutanásia em uma câmara de rato em um dióxido de carbono (CO2) preenchido. Verifique se há eficácia antes de continuar para a fase de dissecação.
      2. Mergulhe o mouse euthanized brevemente em um béquer contendo 70% de etanol até completamente encharcado e revestidos com etanol. Coloque a superfície ventral do mouse acima na fase de dissecação e aperte o mouse antes e as patas traseiras para o tabuleiro de dissecação usando agulhas G 21.
      3. Use pinça de ponta de ponto médio para agarrar a pele abdominal anterior a abertura uretral e, em seguida, usar tesoura afiada de dissecação para fazer um corte na pele abdominal compreendida.
      4. Insira a lâmina inferior da tesoura a pequena incisão entre a pele e o peritônio e fazer uma incisão lateral do abdome para o tórax.
      5. Suavemente, puxe a pele para expor a cavidade peritoneal intacta e fazer uma incisão lateral através do peritônio e também dobre a membrana transparente ou excisar o tecido para expor o WAT abdominal.
      6. Recolher as almofadas de gordura perigonadal, conforme descrito em Mann et al . 24
        1. As almofadas de gordura perigonadal em camundongos machos são vagamente vinculadas para o epidídimo e testículos. Primeiro Localize os testículos com meio ponto de fórceps, agarrar a preensão da cabeça do epidídimo e puxe suavemente.
        2. Usando a tesoura afiada de dissecação, impostos especiais de consumo cada almofada gorda epidídimo por corte ao longo da superfície do epidídimo (cabeça, corpo e cauda) e os testículos.
        3. Com a pinça, puxe com cuidado a almofada de gordura enquanto corte através do tecido conjuntivo, diretamente ligado à estrutura do epidídimo.
        4. Usando a pinça, segure firmemente o fim da gordura almofada proximal para o epidídimo e descasque delicadamente a almofada de gordura longe as gônadas
        5. Em ratos fêmeas, as almofadas de gordura de perigonadal são vagamente bond para o corpo do útero e o corno uterino.
        6. Usando a pinça de ponto médio, aderência do tecido adiposo perigonadal e puxe delicadamente o tecido longe do corpo do útero e trompa uterina.
        7. Impostos especiais de consumo cada almofada gorda por corte ao longo do corpo do útero e o corno uterino usando tesoura afiada de dissecação.
      7. Coloque a gordura almofadas em um prato de petri preenchida com PBS e mantém no gelo para manter o tecido úmido.
    4. Dissociação de WAT em suspensões celulares simples
      1. Remova a placa de Petri PBS em excesso e usar uma lâmina única borda para picar o WAT abdominal em pedaços pequenos.
      2. Com a ponta afiada da lâmina da navalha, lixe ligeiramente o picada WAT abdominal em um tubo de polipropileno coleção rotulado de 15 mL contendo 2 mL de tampão de dissociação WAT.
      3. Incube a esta mistura de tampão de digestão do tecido sob rotação contínua lenta a 37 ° C por 45 min.
      4. Filtrar o tecido digerido através de um filtro de célula de 70 µm num tubo de colheita 50ml enquanto move o êmbolo de borracha de um êmbolo da seringa em um movimento circular e continuar a peneira a suspensão de células através do filtro.
      5. Pipetar 2 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) para um tubo de coleta de 15 mL, pipeta suavemente acima e para baixo e lavar o filtro com a suspensão de célula única.
      6. Lavar o filtro duas vezes adicionais com DMEM frio e coloque a suspensão única célula no gelo.
      7. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g a 4 ° C, durante 8 min.
      8. Use um aspirador a vácuo para retirar cuidadosamente adipócitos flutuantes (primeiro) e restante sobrenadante. Certifique-se para não perturbar a fração vascular do estroma peletizada (SVF).
      9. Com uma pipeta de 1.000 µ l, delicadamente Ressuspender o pellet em tampão de cloreto de amônio-potássio (ACK) para lisar eritrócitos de acordo com as instruções do fabricante.
      10. Diluir a suspensão de células acima com DMEM e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 g a 4 ° C, durante 8 min.
      11. Ressuspender as células em frio PBS contendo 2% FBS (FACS Buffer) e contar as células em uma câmara Burker/hemocytometer.
      12. Transferi 1 x 106 células (por citometria de fluxo básico) ou a suspensão de toda a célula (por FACS) para rotulado 5ml tubos de poliestireno de fundo redondo. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.
  2. Dissociação e isolamento do tecido do fígado
    Nota: Este protocolo foi adaptado de Smedsrød25.
    1. Preparar os buffers de tecido-específica, conforme tabela 1 e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare 1 x perfusão Buffer (PB), por diluição 40ml de PBC em 960 mL ultrapura H2O. pré-aquecer uma seringa preenchida com 50 mL de PB a 37 ° C, antes de começa a perfusão. Elimine quaisquer bolhas de ar presentes.
        1. Para eliminar as bolhas de ar, inverta a seringa onde a dica de bloqueio de leur está apontando para cima. Bata ou agite a seringa até que as bolhas de ar para a pf superior a seringa. Empurre suavemente o êmbolo para expulsar o ar
      2. Preparar o tampão de digestão diluindo-se 0,5 mL de 476 mM CaCl2 soluçãoa 49,5 mL 1 x buffer de perfusão. Adicione 3600U de colagenase tipo IV a 4,76 mM CaCl2 – solução de PB. Pré-aqueça uma seringa preenchida com 50 mL de tampão de digestão a 37 ° C antes de começa a perfusão. Elimine quaisquer bolhas de ar presentes conforme descrito na etapa 1.2.2.1.1.
      3. Prepare a preservação Buffer (PRB) dissolvendo-se 2,5 g albumina de soro bovino (BSA) em 250 mL de tampão de perfusão 1x. Armazenar a 4 ° C ou manter no gelo até o uso.
      4. Prepare o Buffer de FACS com 1X PBS e 2% FBS.
    3. Isolamento do tecido do fígado
      1. Eutanásia em um rato por asfixia de CO2 , saturar o rato com etanol a 70% para evitar a contaminação dos órgãos intra-abdominais com peles.
      2. Posição da rato ventral para cima em um poliestireno dissecando a placa de espuma e segura o mouse dianteira e traseiro as patas para o tabuleiro de dissecação usando agulhas G 21.
      3. Para expor a parede torácica e a cavidade peritoneal, agarre a pele abdominal perto da abertura uretral, usando uma pinça de ponta de ponto médio. Em seguida, use uma tesoura afiada de dissecação para criar uma pequena incisão na pele abdominal compreendidos.
      4. Insira a lâmina inferior da tesoura a pequena incisão entre a pele e o peritônio e fazer uma incisão lateral da virilha no queixo.
      5. Suavemente, puxe a pele para expor a cavidade peritoneal intacta e a parede torácica, faça uma incisão lateral através do peritônio e excisar a membrana.
      6. Levantar o esterno e cuidadosamente entalhar o diafragma, certifique-se para não perturbar a veia cava inferior (VCI). Mover os órgãos gastrointestinais para o lado e localizar a veia cava inferior subhepatic. Use a pinça hemostática para fixar o suprahepatic veia cava inferior para manter a perfusão localizada.
        Nota: A acumulação excessiva de visceral tecido adiposo branco, muitas vezes pode mascarar a veia cava inferior. Para visualizar melhor este navio, uma pequena área de tecido adiposo junto a veia cava inferior pode ser extirpada. A incisão no janela dentro do tecido adiposo maleável então pode ser posicionada sobre a veia cava inferior para expor o recipiente para a canulação.
      7. Anexe a seringa cheia de PB previamente aquecido para o conjunto de coleta e infusão de sangue 23G. Empurre suavemente o êmbolo até que o tubo e agulha estão cheias de PB.
      8. Insira a agulha 23G, paralela da subhepatic veia cava inferior. Fixe a agulha no lugar usando uma pinça hemostática de 4 cm.
        Nota: Canulação do subhepatic que IVC é preferido em ratos alimentados com dieta em que a veia cava inferior pode ser melhor visualizado e canulados dentro da cavidade cheia de gordura.
      9. Empurre suavemente o êmbolo para iniciar a perfusão, a cor irá liberar rapidamente do fígado (o lóbulo direito primeiro) se a agulha está devidamente posicionada no vaso. Alargamento dos lóbulos é também visível, se a agulha está correctamente inserida a veia cava inferior subhepatic.
      10. Prontamente, corte a veia porta para permitir que o PB flua livremente através do fígado.
      11. Perfundir o fígado até o sangue não é mais visível. De vez em quando delicadamente massagem lóbulos fígados entre tona-dedo indicador e o polegar para facilitar a perfusão.
        Nota: É importante usar sem serra sem corte ferramentas afiadas para lidar com o fígado para evitar danos aos tecidos.
      12. Quando 5 mL de PB permanece dentro da seringa, mude para a seringa cheia de buffer de dissociação previamente aquecido. Não perturbe a posição da agulha protegida durante este tempo.
        Nota: Ampliado significativamente superior a 1,5 g deve ser pintada com um maior volume de tampão de digestão pré-aquecido a garantia de dissociação de fígado bem sucedida de fígados.
      13. Perfundir o fígado até totalmente digerida. Massageie suavemente o fígado lóbulos para facilitar a perfusão.
        Nota: A separação da cápsula de Glisson do parênquima é observável em um fígado com êxito digerido. Para avaliar isso, use a borda romba de um par de pinças, para pressione suavemente o lóbulo lateral esquerdo. Uma impressão deve aparecer na superfície e o recuo deveria encher lentamente, uma vez que a pinça é removida.
      14. Remova a agulha da veia cava inferior subhepatic. Não retire a pinça hemostática aperto o suprahepatic veia cava inferior.
      15. Excisar o fígado inteiro cortando cuidadosamente através da conexão ligamentos usando uma lâmina reta curta, dissecando a tesoura e remover a vesícula biliar.
      16. Coloque o fígado inteiro em um 10-cm-placa de Petri contendo 10 mL Buffer de preservação gelada e loja em 4 оC até prontos para libertar as células.
    4. Dissociação de células hepáticas
      1. Transferir o fígado de um prato de 10 cm, contendo 10 mL DMEM gelada.
      2. Segure o suprahepatic decepada que IVC anexado ao fígado extirpado usando uma pinça dentada. Use pinça de ponto médio para liberar as células da cápsula de Glisson aplicando movimento acariciando rápido para cada lóbulo.
      3. Passe o DMEM saturado através de um filtro de célula 70 µm ligado a um tubo de coleta de 50 mL.
      4. Pipetar 10 mL gelada DMEM para o prato de petri de 10 cm e repita os passos de 1.2.4.1 para 1.2.4.3 até saturação da mídia já não é observada. Coloque a suspensão de células no gelo ou a 4 ° C.
      5. Misture suavemente a suspensão de eritrócitos por inversão do tubo de coleta e centrifugar a 54 x g por 2 min a 4 ° C.
      6. Recolha o sobrenadante em um tubo de coleta de 50ml limpo. Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 54 x g por 2 min a 4 ° C.
      7. Repita a etapa 1.2.4.6 duas vezes adicionais antes de prosseguir para a etapa 1.2.4.8.
      8. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo 50 mL-coleção e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      9. Ressuspender o pellet de células não-parenquimatosas no buffer de FACS e contá-las em uma câmara Burker/hemocytometer.
      10. Transferi 1 x 106 células (por citometria de fluxo básico) ou 15 x 106 - 20 x 106 células (FACS) para rotulado tubos de poliestireno de fundo redondo de 5 mL. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.
  3. Dissociação e isolamento da aorta
    Nota: Este protocolo foi adaptado do açougueiroet al.26
    1. Preparar os buffers de tecido-específica com base em receitas fornecidas na tabela 1 e armazená-los conforme descrito.
    2. Preparem-se os seguintes reagentes.
      1. Prepare o tampão de digestão por descongelar o volume apropriado de buffer de dissociação de WAT e loja a 4 ° C até o uso. Imediatamente antes do uso, aquecer o buffer para 37 ° C.
      2. Prepare uma solução de heparina 10 x dissolvendo heparina sal sódico em 1X PBS em uma concentração de 200 U/mL. Dilua a solução de heparina com PBS 1x para preparar uma solução de heparina de 1x de 10x. Armazene o x 10 e 1 x soluções de heparina em 4 ° C até o uso.
      3. Preparar o Buffer de FACS com 1X PBS contendo 2% FBS.
    3. Dissecação da aorta
      1. Eutanásia em um rato em uma câmara de dióxido de carbono preenchido e lavagem com etanol 70%.
      2. Coloque o lado ventral do mouse na fase de dissecação, espalhar o mouse antes e as patas traseiras e fixá-las à Diretoria de dissecação, usando agulhas de 21 G.
      3. Imediatamente após a eutanásia o rato, realize punção cardíaca. Consulte os passos 1.3.3.4 para 1.3.3.9, se necessário.
      4. Localize o processo xifoide, na extremidade inferior do esterno
      5. Para fazer isso, coloque um ponto médio do dedo ao longo da largura do pescoço do animal. Rastrear ao longo da linha média ventral do pescoço à extremidade caudal do esterno até sente uma extensão cartilaginoso.
      6. Use pinça de ponto médio para compreender a extensão cartilaginosa e se necessário marcar a localização do processo xifoide, removendo o pedaço de cabelo ou a pele na área.
      7. Parcialmente inserir uma agulha 26G sob o processo xifoide em 20-30° ângulo.
      8. Gentilmente aplique pressão negativa na seringa, retirando lentamente o êmbolo e, em seguida, introduza a agulha ainda mais dentro da cavidade até fluxos de sangue.
      9. Se o fluxo de sangue parar, lentamente girar a agulha ou mova ligeiramente em e para fora.
      10. Uso o par de pinças para agarrar as mãos a pele abdominal anterior uretral abrindo e usar um par de tesouras de dissecação afiadas para cortar ao longo da linha média ventral através do peritônio da virilha no queixo.
      11. Puxe a pele para expor os órgãos abdominais e torácica, com os dedos ou pinça romba movimente suavemente órgãos abdominais para o lado.
      12. Uso a pinça para agarrar as mãos do processo xifoide, levante o esterno e entalha o diafragma.
      13. Usando a tesoura dissecar, cortar as costelas laterais em ambos os lados. Segurando o esterno, inverter as costelas para cima e corte através da base de ligação. Remova a caixa torácica expondo os órgãos torácicos subjacentes.
      14. Perfundir a aorta com uma agulha de calibre 26 anexada um 10 mL seringa preenchida com 1 x solução de heparina pela injeção de 1 a 2 mL de solução para o ventrículo esquerdo (LV) do coração.
        Nota: Certifique-se de perfundir em ritmo lento, com pouca pressão para assegurar lesões da aorta ateroscleróticas intactas.
      15. Impostos especiais de consumo a timo, pulmões e tecido conjuntivo. Consulte os passos de 1.3.3.16 e 1.3.3.17, se necessário.
        1. Anterior do coração, localize o branco bi-lobada (ou em forma de borboleta) órgão e firmemente agarrar espera do Timo com a pinça. Afastar-se ambos os lóbulos para cima da cavidade e corte na base com a tesoura.
        2. Para remover os pulmões, beliscar um lóbulo do pulmão com a pinça, puxe o tecido fora da cavidade torácica e corte na base. Repita para cada lóbulo restante.
      16. Use um microscópio de dissecação e microdissecando ferramentas e coletar que arco da aorta (incluindo a innominate artéria, artéria carótida comum esquerda e artéria subclávia esquerda), o ascendente, descendente, aorta torácica e abdominal.
        1. Localize a aorta ascendente no ventrículo esquerdo do coração.
        2. Com um par de curvas 0,07 x 0,04 mm-ponta pinça Segure cuidadosamente a parte da aorta ascendente emergindo do ventrículo esquerdo.
          Nota: Em comparação com o tecido adiposo circundante-amarelado, a aorta será um navio branco brilhante, proveniente do LV quando suficientemente liberado com a solução de heparina.
          1. Se a aorta não foi devidamente liberada pela perfusão cardíaca, lave a aorta novamente enquanto a aorta permanece conectada à cavidade. Para fazer isso, cortar perto da junção do coração-aorta, retirar o coração e depois cortar horizontalmente através da baixo-extremidade da aorta abdominal. Inserir uma agulha 26G na abertura da aorta ascendente e lave delicadamente a aorta com o 1 x solução de heparina.
          2. Suavemente puxe-a para melhor discriminar entre o tecido adiposo e incorporado a aorta, a aorta ascendente.
          3. Ainda puxando na aorta ascendente, use a ponta da mola fechada dissecando tesoura para limpar a gordura que encapsulam a aorta ascendente e arco aórtico. Para fazer isso, curso do tecido adiposo com a ponta das lâminas da tesoura fechada a rasgar a conexão gordura.
            Nota: Abster-se de excisão qualquer tecido adiposo cortando até a aorta ascendente e o arco podem ser visualizados claramente. Isso é para evitar cortar a aorta.
          4. Se a aorta ascendente e o arco podem ser claramente delineados a partir do tecido adiposo de bordadura, use o Primavera dissecando tesoura para retirar o excesso de gordura.
          5. Delicadamente agarra o arco aórtico com a pinça. Novamente usando a ponta da tesoura primavera, braçada a gordura ao longo do comprimento da aorta descendente, torácica e abdominal à extremidade caudal da aorta abdominal, assim, no lado direito da capa de gordura.
          6. Continue a agarrar-se ao longo da aorta quando rasgar a gordura. Certifique-se de fazer tão cuidadosamente para evitar danificar a aorta.
          7. Puxe delicadamente a aorta para cima em direção ao microscópio, para que a gordura está agora posicionada atrás da aorta.
          8. Inserir as lâminas da tesoura fechada entre a interface de gordura-aorta perto da extremidade anterior da aorta descendente, grave fixação do tecido adiposo superfície da aorta, sem rodeios, usando um movimento de varredura.
            Nota: Cuidadosamente removendo o excesso de gordura e tecido de ligação, enquanto a aorta está ainda dentro da cavidade é recomendado.
          9. Excisar o coração e cortar transversalmente na extremidade caudal da aorta abdominal. Remova a aorta toda.
          10. Coloque a aorta em um prato de 35mm e tease fora qualquer excesso de gordura na aorta usando duas agulhas de calibre 21. Coloque a aorta extirpada em tubo de microcentrifuga 1,7 mL no gelo.
    4. Dissociação da Aorta em suspensões celulares simples
      1. Pipetar 0,2 mL aorta dissociação de tampão para o tubo contendo a aorta. Inserir as lâminas de tesoura de mola no final do tubo cônico e picar rapidamente a aorta para facilitar a digestão enzimática.
      2. Transfira a mistura de tecido-solução para um 15 mL coleção tubo e pipeta 1,8 mL aorta dissociação buffer para um volume total de 2 mL.
        Nota: Para fácil transferência de suspensão de tecido, corte a 1 cm fora da extremidade afilada de uma padrão ponta da pipeta 1.000 µ l. Use a ponta encurtada para transferir a suspensão com uma micropipeta.
      3. Incube a aorta picada no buffer de dissociação de aorta para 55 min a 37 ° C, agitando a 220 rpm (0.514 x g).
      4. Passe a suspensão através de filtro de 50 µm célula em um tubo de polipropileno coleção de 15 mL. Use o êmbolo de borracha de um êmbolo da seringa para facilitar a filtragem.
      5. Lavar o tubo de coleta de 15 mL com 1 mL de FACS, recolher a suspensão e passar através do filtro de célula.
      6. Lave o filtro de célula 50 µm duas vezes adicionais com 1 mL de tampão de FACS.
      7. Pelotas as células por centrifugação a 300 x g por 5 min a 4 ° C. Ressuspender as células no Buffer de FACS frio. Conte as células em uma câmara Burker/hemocytometer.
      8. Transferi ou células de 1 x 106 (por citometria de fluxo básico) ou a suspensão de toda a célula (por FACS) para um tubos de poliestireno de fundo redondo de 5ml rotulada. Continue a seção 2 para citometria de fluxo que mancha o protocolo.

2. fluxo Cytometry e FACS coloração

Fluoróforo R-ficoeritrina (PE) PE/cianina (Cy) 7 PE/cianina (Cy) 5 Azul (PB)
Laser (nm) Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm) Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm) Azul (488 nm) / amarelo (561-570 nm) - verde (532 nm) Violeta (405 nm)
ExcitaçãoMAX (nm) 496 496 496 401
Emissão deMAX (nm) 578 785 667 455
Marcador fenotípica F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX integrina, integrina αX cadeia, CR4, p150, ITGAX ΑM integrina, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Tipo de célula alvo Macrófagos residentes de tecido Macrófagos classicamente registrados (M1) Monócitos / macrófagos Leucócitos (macrófagos / monócitos, linfócitos e granulócitos)
Subconjunto de células dendríticas Células dendríticas, células NK, células T ativadas e um subconjunto de linfócitos intraepiteliais intestinais (IEL) Granulócitos, células dendríticas, células NK e subconjuntos de células T e B
Factor de diluição 01:50 1: 100 1: 100 1: 100
ISOTYPE controles PE rato IgG2a PE/Cy7 armênio Hamster IgG PE/Cy5 Rat IgG2b IgG2c rato azul do Pacífico

Tabela 2: Lista de fluoróforo etiquetado anticorpos específicos para discriminar os macrófagos residentes de tecido.

  1. Coletar e preparar os seguintes itens: tubos de poliestireno de fundo redondo FACS Buffer 5 mL, receptor de Fc CD16/32 de antibloqueio rato de anticorpo, fluoróforo conjugado ou anticorpos primários, anticorpos secundarios conjugados fluoróforo (se não-conjugados necessário), 1x tampão fosfato salino (PBS).
    Nota: Para grandes quantidades de células de coloração, concentração de anticorpos é mais crítica ao invés de número de celular. Por exemplo, se a coloração de 10 x 106 células o volume de tampão a coloração e a concentração de anticorpos deve ser o mesmo como se coloração 1.0 x 106 células no volume de reserva de 100 µ l. Para a coloração 1.0 x 108 células, aumentando a quantidade de anticorpo 5-fold é recomendado.
  2. Adicionar adicionais gelada FACS Buffer para cada tubo de FACS, se necessário, as células de pelotas por centrifugação a 751 x g por 5 min (4 ° C). Aspire a sobrenadante centrifugação seguinte.
  3. Adicione o receptor de Fc CD16/CD32 de antibloqueio rato de anticorpo para todas as amostras de acordo com as instruções do fabricante. Incube por 15 min a 4 ° C ou em gelo.
  4. Adicione o fluoróforo primário anticorpo conjugado cocktail diretamente ao receptor Fc contendo anticorpos bloqueio suspensão de células e incubar amostras a 4 ° C por 30 min. amostras de proteger da luz para minimizar o descoramento de anticorpos conjugados fluoróforo.
    1. No caso de unconjugated anticorpos primários foram utilizados, siga estas etapas após completar a etapa 2.4.
    2. Anticorpo primário de lavagem manchado amostras por centrifugação a 751 x g por 5 min (4 ° C).
    3. Remover o sobrenadante por decantação e ressuspender o pellet em buffer de FACS 100 µ l.
    4. Adicione o anticorpo secundário conjugado para todas as amostras necessárias e incube por 30 min a 4 ° C. Prossiga para a etapa 2.5.
  5. Seguir incubação do anticorpo, adicionar 2 mL de tampão de FACS frio gelo depois da pelota células a 751 x g por 5 minutos (4 ° C). Decante o sobrenadante e certifique-se para não perturbar o sedimento.
  6. Misture-os delicadamente as células e então re-suspender com 200-400 µ l de tampão de FACS, em seguida, manter isso no escuro a 4 ° C até análise de citometria de fluxo padrão ou célula de classificação.
  7. Para a fixação de curto prazo de células coradas, proceda à passos 2.8 a 2.10. Fixação de uso por citometria de fluxo padrão somente.
  8. Imediatamente após a etapa 2.5, re-suspender as células em paraformaldeído de 2-4% de 0,5 mL (PFA) por 15-30 min em 4 ° C.
    Nota: Atenção: PFA é um irritante conhecido com efeitos cancerígenos e tóxicos. Quando usando o PFA, manipular com extremo cuidado. Certifique-se de usar o equipamento de protecção adequado e ventilação de exaustão.
  9. Fixação seguinte, lavar as células adicionando FACS de 2 mL de tampão para todas as amostras e centrifugar a 751 x g em 4 ° C por 5 min. remover sobrenadante seguir centrifugação.
  10. Ressuspender as células fixas em 200 µ l de tampão de FACS frio gelo e em 4 ° C. Correção de loja células até 1 semana a 4 ° C, idealmente realizar aquisição de citometria de fluxo dentro de 48 horas para minimizar autofluorescência.
  11. Adquirir dados de citometria de fluxo de acordo com as instruções do fabricante de citômetro de fluxo ou executar fluorescente ativado celular classificação conforme descrito por Brum et al. 23

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Representative Results

Ao usar o apolipoprotein E deficientes camundongos C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) mantidos em uma dieta de alta gordura colesterol elevado (HCHFD ou HCD) por 18 semanas, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrófagos aórtico podem ser isolados quando duas amostras são em pool. Fígados dissecados de ratos alimentados com HFHCD KO ApoE, produziu maior que 5 x 105 classificados células de Kupffer (que depende do tempo de classificação disponível). Quando usando a dieta de alta gordura (HFD) alimentados com camundongos C57BL/6 de tipo selvagem (WT), 5 x 105 a 1 x 106 residentes tecido adiposo macrófagos (ATMs) podem ser classificados da fracção do estroma vascular (SVF). O mencionado número total de macrófagos que podem ser classificados a partir de um determinado tecido era adequado para a realização de análise de expressão do gene utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real (qPCR). Para os tecidos onde menos números das populações de macrófagos são recuperados, tais como a aorta, é recomendável usar co precipitants (por exemplo o glicogênio) e a precipitação durante a noite quando o isolamento do RNA é necessário para essas análises.

Aqui, os efeitos de distúrbios metabólicos induzida por dieta em fenótipo macrófago usando base fluem cytometry, classificação de fluorescência-ativado da pilha (FACS) e a jusante de post tipo análises são mostradas. Esses achados corroboram observações anteriormente publicadas que ratos alimentados com uma infiltração de exposição aumentada HFD ou HFHCD do classicamente registrados (M1) de macrófagos nos tecidos afetados, tais como a aorta (figura 1B). Aproveitando-se da citometria de fluxo, FACS e perfis de expressão de gene (via reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), o fenótipo predominante para tirosina do receptor de Ron quinase-expressando CD45+ + de F4/80 macrófagos derivados de observou-se tecidos isolados de ratos alimentados com dieta. Ron receptor-expressando aórtico macrófagos que demonstraram um fenótipo anti-inflamatórios foram menores em ratos alimentados com HFHCD (Figura 1 e D). Macrófagos do receptor-expressando a Ron classificados derivado demonstrada arginase aumento de aorta digerido 1 (Arg1) expressão de gene, que é um marcador para macrófagos M2 bem estabelecido (Figura 1E). Pró-inflamatórias macrófagos que foram caracterizados como CD45+ + CD11c de F4/80+ foram aumentados na aorta isolada de ratos alimentados com HFHCD (figura 1B e D). Caracterizar os macrófagos residentes fígado mais elucidado o fenótipo predominante de subpopulações de receptores-expressando Ron (Figura 2A). Populações de macrófagos pró-inflamatórias CD11c + demonstraram uma diminuição de expressão de genes que estão fortemente associados com um fenótipo (M2) anti-inflamatórios como Arg1 e Ron (Figura 2B). Tendências similares foram observadas em populações de macrófagos isoladas de digerido de tecido adiposo branco (Figura 3). População de macrófagos com uma assinatura pro-inflamatórios mostrou diminuição da expressão de superfície do receptor Ron (Figura 3). Combinando as abordagens, citometria de fluxo básico e FACS, resultou em dados conclusivos que valida ainda mais o receptor do Ron como um regulador de alternativa (M2) ativação de macrófagos32. Tal preconceito em direção a um anti-inflamatório fenótipo (M2) foi mostrado para jogar um papel protetor no desenvolvimento e progressão da obesidade, aterosclerose e esteatohepatite31.

Figure 1
Figura 1: Caracterização de macrófagos isolados de aorta dissociada removido da ApoE KO ratos mantidos em um HCD por 18 semanas. (A) células foram primeiro condomínio fechadas no CD45+ leucócitos, excluindo os restos celulares. CD45 (B) a coloração em conjunto com F4/80 é usada para delinear duplas populações positivas, presume-se que os macrófagos. Retenção adicional foi usado para demonstrar o percentual de CD11c+CD45+F4/80+ (M1) e (C) Ron+CD45++ (potenciais M2) de F4/80 macrófagos na aorta derivado de ratos alimentaram com qualquer um comida normal ou colesterol alto dieta por 18 semanas. (D) aumento da percentagem de CD11c+CD45++ (M1) de F4/80 macrófagos, bem como uma diminuição da percentagem de Ron+CD45++ (potenciais M2) de F4/80 macrófagos foram observados na aorta derivado de ratos alimentados HCD em comparação com ratos alimentados com uma dieta de comida normal. (E) Gene expressão análise de Ron classificado+CD45+F4/80+ macrófagos demonstraram aumento da expressão de arginase eu (um conhecido murino M2 marcador). Valores foram obtidos usando o t-teste as análises Student realizadas utilizando o software de análise estatística e representado como média ± SEM. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (* P < 0.05, * * * P < 0,001). A figura foi modificada de Yu et al (2016) 31. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Gene transcrição caracterização das populações de células de Kupffer classificadas de fígados digeridos dissecado de ApoE KO ratos mantidos em um HCD por 18 semanas. (A) regime geral associado para caracterização e classificação de populações de células de Kupffer. (B) análise de expressão de Gene de classificados Ron expressando (Ron+) e não-expressando (Ron–) CD45++ de F4/80 macrófagos por PCR quantitativo de RT. Análises do teste t de Student foram realizadas usando o software estatístico e valores foram representados como média ± SEM. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo (* P < 0.05, * * * P < 0,001). A figura foi modificada de Yu et al (2016) 31 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Caracterização de ATMs, isolado do tecido adiposo branco dissecado de WT BL6 ratos alimentados um HFD por 18 semanas. (A) esquema geral de associada para caracterização e classificação de tecido adiposo derivado de populações de macrófagos (B) percentagem de Ron + células dentro CD45++CD11c de F4/80– e CD45++CD11c de F4/80+ populações de macrófagos classificadas de WAT. A figura foi modificada de Yu et al (2016) 31 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Modelos de desordem metabólica induzida por dieta que imitam co-morbidades, tais como aterosclerose, simples esteatose, esteatohepatite e diabetes tipo 2 são usados extensivamente para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes de progressão da doença. Digestão dependente de colagenase é muitas vezes usado para dissociar os tecidos para libertar as células da matriz extracelular (ECM)16,27. Enzimas como a colagenase perturbam o colágeno que fornece suporte estrutural para os vizinhos de células. Composição estrutural dos tecidos determina a rigidez de matriz de tecido (resistência à deformação) e qual o produto bruto colagenase é mais eficiente no sentido de garantir sucesso ECM interrupção28. WAT, que é composto de "matriz macia" muitas vezes é digerido com colagenase tipo II para libertar os adipócitos e células do sistema imunológico residentes, simultaneamente, mantendo a integridade da célula de receptores de insulina superfície29. A microarquitetura dos componentes fibrila da aorta contribui para a "matriz rígida", para o qual eficaz digestão aórtica com tipo de colagenase XI (que tem a maior atividade de colagenase) é usado em combinação com as enzimas adicionais. Ao contrário da aorta, o fígado digestão usa uma colagenase com uma fraca atividade enzimática, colagenase tipo IV, para perturbar a matriz e libertar as células parenquimatosas e não-parenquimatosas viável30. Os tecidos inflamados cronicamente derivado alimentados com dieta selvagem tipo ou deficiência de apolipoproteína E (ApoE KO) mouses em um C57BL6 fundo muitas vezes passam por remodelação que possa impedir a boa digestão enzimática. Esta seção discutirá estratégias para minimizar e/ou eliminar a possibilidade de dissociação de tecido imprópria e recuperação celular baixo.

Uma característica comum dos tecidos derivados de modelos alimentados com dieta rato que imitam, obesidade, aterosclerose, ou doença hepática gordurosa não-alcoólica, é a remodelação do tecido anormal. No tecido adiposo branco, aorta e no fígado, composição de ECM é alterada, muitas vezes resultando em excessiva deposição de componentes fibrillar como colágenos. Tipo selvagem C57BL6 ratos mantidos em uma dieta de alta gordura durante dezoito semanas, experiência anormalidades do tecido-específica como expandido tecido adiposo branco e ampliado fígado gorduroso (esteatose simples). Muitas vezes estas características metabólicas não são incômodos obstáculos durante o processo de dissociação de tecido. Por outro lado, em outros modelos de dieta induzida que espelham mais exacerbados fenótipos, a extensa remodelação do tecido pode representar um problema durante a digestão do tecido. HFHCD alimentou ratos ApoE KO são frequentemente usados para modelo aterosclerose e esteatohepatite. Uma característica comum associada com esteatohepatite avançada é a deposição excessiva de ECM no fígado (ou fibrose). Fígado fibrótico tem demonstrado ser bastante problemáticos durante a dissociação enzimática do tecido e muitas vezes produz a célula de baixo rendimento31. Para melhorar o rendimento da célula, é fundamental que os protocolos de digestão ser seguidos sem desvio. Apesar de fígados normais podem ser picados e submerso em tampão de digestão para alcançar a dissociação, perfusão com tampão de digestão maximiza o contato entre a matriz extracelular do fígado e a solução de colagenase; e, por conseguinte, essa abordagem é altamente recomendada. Além disso, 20 a 30 mL de tampão de digestão é muitas vezes um volume adequado para dissociação bem sucedida de fígados normais; no entanto, no que diz respeito aos modelos de rato que desenvolvem fígados alargados e/ou fibróticos, perfusão com 50 mL de tampão de digestão é preferido para garantir a boa digestão, minimizando a morte celular. Para fígados com pesos que significativamente superior a 1,5 g, aumentar o volume de tampão de digestão é recomendado para garantir sucesso digestão.

Tecido Problema Possível motivo Solução
Tecido adiposo branco (WAT) Dissociação de célula pobre Má digestão Certifique-se de digestão buffer é em 37° C
Morte celular Digestão de colagenase excessiva Reduzir o tempo de digestão
Reduzir o volume de tampão de digestão
Aorta Dissociação de célula pobre Má digestão Certifique-se de digestão buffer é a 37 ° C
Peças de aorta em tampão de digestão foram muito grandes Certifique-se de aorta é cortado em pedaços de 1 mm aproximadamente
Peças de aorta não estavam tremendo no buffer de dissociação durante a incubação Certifique-se de peças de aorta estão tremendo na solução de digestão
Morte celular Digestão de colagenase excessiva Reduzir o tempo de digestão
Reduzir o volume de tampão de digestão
Fígado Dissociação de célula pobre Má digestão Certifique-se de digestão buffer é a 37 ° C
Aumentar volume de tampão de digestão
Imprópria canulação da veia cava inferior (inchaço do tecido que circundante IVC ocorre) Certifique-se de agulha é inserida corretamente a veia cava inferior
Ruptura de veia cava inferior Proteger a agulha na veia cava inferior antes da perfusão
Reduzir a velocidade de perfusão
Ruptura do tecido Reduzir a velocidade de perfusão
Morte celular Liberação inadequada de células da cápsula de Glisson Certifique-se de separar as células da cápsula usando discutido anteriormente acariciando o método
Digestão de colagenase excessiva Reduzir o tempo de digestão
Reduzir o volume de tampão de digestão

Tabela 3: Solucionando problemas de dissociação de tecido malsucedido. Fluxo cytometry baseado célula classificação ou FACS é uma técnica poderosa para isolar populações de células onde o elevado grau de pureza é uma necessidade. Quando purificante células célula classificando, atingir a célula alto rendimento mas também uma espécie de alta pureza requer utilizando as estratégias de classificação adequadas. Nesta seção, métodos para melhorar a multi-fluoróforo fluem baseados em citometria de celular classificação do tecido residente macrófago derivado de ratos alimentados com dieta são descritos. Para isolamento de macrófagos residentes do tecido distintos, seleção de marcador de superfície é uma etapa crítica. Macrófagos derivados de WAT, aorta e fígado são frequentemente distinguidos usando um CD45+, CD11b+, F4/80+ estratégia de retenção. Adicionais de fluxo cytometric painéis podem ser usados para identificar os macrófagos residentes do tecido. Estes painéis incluem anticorpos que sonda para a expressão de superfície de macrófagos glicoproteínas específicas (CD64, CD68 e CD14), formando complexos (MHCII) e apoptose celular tirosina quinase receptores (MerTK)32, 33. fenótipo específico macrófago pode então ser delineado por sondagem para a expressão de superfície seletiva de M2 (CD163, CD209 e CD206) ou M1 marcadores (CD38, CD40, CD80 e CD86)34,35. Autofluorescência gerada pelos macrófagos carregados de lipídios pode apresentar alguns problemas quando a retenção de populações. Usando anticorpos marcados com fluorochromes que estão ansiosas pelo laser verde-amarelo (tais como PE, PE/Cy5, PE/Cy7) ou laser vermelho (como APC, APC Cy7) resulta em fluorescência emitida que é significativamente mais brilhante do que a autofluorescência e assim pode melhorar resultados36. Quando selecionar fluoróforo conjuga com tão alta coloração índice e potencial espectros de emissão se sobrepõem, inclusão de controles adequados é fundamental. Ao identificar limites associados, inclusão de controles simples mancha (SS) e controles de isotipo permitem a delimitação das populações de positivo/negativo e a medição do sinal de fundo específico, causada por anticorpos primários, respectivamente 37. para circunstâncias onde as células são escassas, recomendamos o uso de partículas de compensação para SS e isotipo controles. Partículas de compensação normalmente emitem sinais mais brilhantes do que controles biológicos e também tem menos variação na fluorescência do fundo. Além disso, a fluorescência menos um controles (FMO) são ideais para delinear fronteiras associadas. Incluindo controles FMO, a fluorescência máxima esperada para um subconjunto de coloração é revelada em um determinado canal quando o anticorpo marcado fluorocromo específico para esse canal de fluorescência particular é excluído38. Em nossa experiência, além de controles de partícula única compensação manchada, um controle unstained comparação biológica deve ser incluído para definir limites mais precisos de positivo/negativo.

Excluindo os restos celulares e agregados de células na estratégia associada é também uma abordagem adicional usada para minimizar autofluorescência. Para distinguir os restos celulares da população de células viáveis, utilizar forward scatter (FSC) e dispersão lateral (SSC) é a estratégia mais comum associada. Para células isoladas que serão usadas para análises de tipo de post e exigem maior viabilidade para extrações de DNA/RNA, recomenda-se que as manchas de viabilidade não ser utilizado com qualquer procedimento de fixação e/ou permeabilização. Formaldeído, fixação de células pode comprometer a integridade de ácido nucleico devido a reticulação de ácido nucleico-proteína e assim limitar a eficiência do isolamento, detecção e quantificação exacta. Agregados de células como mencionado antes não podem apenas contribuir para emitido sinais de autofluorescentes, mas também resultar em "anulações de coincidência". Tal ação ocorre para manter a alta pureza em um tipo, mas se muito frequentes, reduz o rendimento da célula classificada. Classificação buffer (buffer de FACS) suplementado com DNAse e MgCl2 durante a coloracao celular pode minimizar a agregação de célula. É recomendável não usar EDTA em combinação com DNAse porque inibe a atividade da enzima. A suspensão única célula de filtragem através de um filtro de célula de 70 µm antes da classificação também pode libertar células de agregados. É imperativo notar que, para minimizar a agregação, suspensões celulares devem ser na concentração de 5 milhões de células por mL em um volume mínimo de 0,4 mL. Células isoladas de tecidos lípidos carregado tendem a ser mais propensos a agregação e isso pode resultar em coincidência anulações e tipo de baixo rendimento. Recomenda-se que amostras são mais diluídas se agregação persiste. Classificada de macrófagos podem ser coletados em tubos de polipropileno de fundo redondo de coleção contendo fetal bovino médio rico para maximizar a recuperação celular. Uma concentração inicial de FBS alta garante recuperação celular desde que a concentração, eventualmente, torna-se diluído com cada gota classificada. Para a coleta de células que serão usadas para análise de DNA ou RNA, as células podem ser classificadas diretamente para o reagente de extração apropriado (por exemplo, TriZol) para evitar a contaminação de RNAse. Quando grandes volumes de classificação, classificação de células primeiro em meios de cultura suplementado com concentrações inferiores de FBS, recomenda-se. Imediatamente após a classificação, as células devem então ser peletizadas e lysed para extração de DNA/RNA. O material genético isolado pode então ser perfilado para expressão do gene alterado. Genes pró-inflamatórios, incluindo TNFa, IL1-β, IL-6, IL-12, L 1-23, relato, Nos2 e MCP1 (CCL2) são muitas vezes upregulated em macrófagos exibindo um classicamente registrados de fenótipo (M1)39. Por outro lado, como alternativa ativado (M2) fenótipo em macrófagos é muitas vezes marcado por indução de genes que codificam Chi3l3 (Ym1), Fizz1, 1 Arginase, CD206, CD163, CD209 1L-10 e TGFβ34,40. Recentemente, CD38, Fpr2 e Gpr18 foram validadas como genes específicos M1 e c-Myc e Egr2 como de genes específicos M234.

Embora o fluxo de cor multi celulares baseados em citometria de classificação é uma ferramenta valiosa para isolar os macrófagos em elevado grau de pureza, esta abordagem pode ser cara. As vantagens poderosas de FACS mediada classificação dependem do pessoal de operações que pode manobrar um classificador de pilha, além do custo elevado de eritrócitos classificador manutenção. Abordagens alternativas podem ser usadas em substituto de caro fluxo cytometry baseado célula classificação. Eles incluem magnético celular ativado classificação (MACS) ou centrifugação gradiente de densidade. A primeira célula alternativa classificação método mencionado engloba magnética e/ou kits de isolamento de coluna Microconta para separar as células de interesse de sangue ou tecidos sólidos41. A segunda célula classificação abordagem separa uma suspensão de células heterogêneas com base na densidade e força de centrifugação. Infelizmente, densidade mediada por centrifugação não é prática para isolar os macrófagos da aorta ou WAT derivada de suspensões de célula única. Muitas vezes, o produto obtido por centrifugação diferencial está contaminado e de baixo rendimento. Consequentemente, os tecidos menores (como a aorta ou WAT) que resultam em poucas células inicialmente após digestão enzimática não são candidatos ideais para centrifugação diferencial. Por outro lado, suspensões celulares derivadas de fígados dissociados podem produzir um número adequado de macrófagos classificados que pode ser usado em experimentos de tipo de post e análises como estímulos da cultura, qPCR ou análise de mancha ocidental. Estas abordagens alternativas também podem ser usadas para enriquecer populações antes da FACS, permitindo os tipos mais limpos. Digno de nota, os macrófagos residentes tecido compõem uma pequena porcentagem da população de toda a célula em WAT, fígado e a aorta. Enriquecimento das células antes da classificação de FACS tem sido uma abordagem usada quando isolar populações de células que são menos frequentes. Uma questão que é comum em pequenas populações de isolamento é que células grandes números devem ser processados para obter células suficientes para análise posterior. Enriquecimento ou pre-classificação pode ser usado para resolver essa questão. Este método ajuda na obtenção de uma população mais concisa das células através de seleção positiva e negativa, mas também permite conservação de tempo como FACS classificação pode ser um processo duradouro para fontes de tecido denso, como o fígado.

Recentes avanços na biologia de inflamação destacam a importância da Caracterização fenotípica e funcional de heterogeneidade de macrófagos para aprofundar a compreensão do complexo papel dessas células imunes na regulação da inflamação crônica. Em breve, este protocolo abrangente fornece uma abordagem multidimensional para caracterizar tecido macrófagos residentes de tecidos marca três estudados em modelos de inflamação e obesidade dieta estabelecida induzida. Mais importante, este protocolo leva em conta a dificuldade e as medidas necessárias para isolar limpo único suspensões celulares de desregulação inflamado tecidos como WAT, placas da aorta e fígados gordos. O protocolo permite que o pesquisador aplicar citometria de fluxo e ferramentas de classificação FACS numa dimensão inovadora para caracterizar macrófagos residentes de tecido, reguladores chaves da inflamação na obesidade. Caracterização aprofundada da dinâmica populacional de macrófago pode fornecer a introspecção do monócito tráfico de tecidos inflamados e permitir avaliações mecanicistas continuadas através de uma multiplicidade de abordagens experimentais em macrófagos classificadas. Caracterização adicional das populações de macrófagos pode fornecer uma introspecção crucial as bases biológicas que regulam a heterogeneidade de macrófagos na saúde e na doença.

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Disclosures

Autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a facilidade do núcleo citometria de fluxo para a Universidade de Pensilvânia estado Millennium ciência complexa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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