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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen

Published: April 3, 2017 doi: 10.3791/55445
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, 2Microscopy and Cytometry Facility, The Huck Institutes of Life Sciences, Pennsylvania State University

Summary

Dieses Protokoll ermöglicht ein Forscher zu isolieren und zu charakterisieren, Gewebe-Bewohner Makrophagen in verschiedenen hallmark entzündetem Gewebe extrahiert aus Diät-induzierten Modelle der Stoffwechselstörungen.

Abstract

Übergewicht fördert einen chronische entzündlichen Zustand, der weitgehend durch Gewebe-Bewohner Makrophagen sowie Monocyte abgeleiteten Makrophagen vermittelt wird. Diät-induzierten Adipositas (DIO) ist ein wertvolles Modell bei der Untersuchung der Rolle der Makrophagen Heterogenität; angemessene Makrophagen Isolationen sind jedoch schwierig, von entzündetem Gewebe zu erwerben. In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung Schritte und notwendigen Lösungsanleitungen stammen aus unseren Studien eine geeignete Bevölkerung von Gewebe-Bewohner Makrophagen von Mäusen nach 18 Wochen der fettreichen (HFD) oder High-Fat/High-Cholesterin (einzuholen HFHCD) Diät Intervention. Dieses Protokoll konzentriert sich auf drei Markenzeichen Gewebe untersucht Adipositas und Arteriosklerose einschließlich der Leber, weißen Fettgewebe (WAT) und der Aorta. Wir markieren wie dualistische Nutzung des Flow Cytometry erreichen eine neue Dimension der Isolierung und Charakterisierung von Gewebe-Bewohner Makrophagen. Ein grundlegenden Abschnitt dieses Protokolls befasst sich mit die Feinheiten gewebespezifischen enzymatischen Verdauung und Makrophagen Isolierung und anschließende Zelloberfläche Antikörper Färbung für durchflusszytometrischen Analyse zugrunde liegen. Dieses Protokoll befasst sich mit vorhandenen Komplexität zugrunde liegende fluoreszierende aktiviert Zelle sortieren (FACS) und enthält Erläuterungen zu diesen komplexen Problemen um breite Palette Charakterisierung von angemessen sortierte Zellpopulationen zu erhalten. Dazu gehören Alternative Anreicherungsverfahren für das Sortieren von Zellen, wie die dichten Leber, ermöglichen Flexibilität und Zeit bei der Arbeit mit FACS. Kurz gesagt, dieses Protokoll aids-Forscher, Makrophagen Heterogenität aus einer Vielzahl von entzündetem Gewebe in einer bestimmten Studie zu bewerten und liefert aufschlussreiche Tipps zur Problembehandlung, die erfolgreich für günstige zellulären Isolierung und Charakterisierung von Immunzellen in DIO-vermittelte Entzündung.

Introduction

Maus-Modellen sind weitgehend benutzt worden, um die Dynamik der menschlichen Krankheiten zu studieren. Richtige Isolierung der ansässigen Gewebezellen von Mäusen in einem kranken Zustand kann eine Plattform bieten, für das Verständnis der molekularen und zellulären Beiträge zur Pathogenese einer Krankheit1. Eine Störung, die von entscheidender Bedeutung ist Übergewicht. Die Inzidenz der Adipositas weiter steigen weltweit parallel mit Insulinresistenz und Typ-2 Diabetes Mellitus, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleber2,3. Übermäßiger Konsum Nährstoff ist weiter verzerrt durch verminderte körperliche Aktivität auslösen veränderten Signale aus Fettgewebe, die das zelluläre Milieu von anderen peripheren Geweben wie der Aorta und Leber4verändern können. Solche Störungen der metabolischen Homöostase führt eine chronische niedriggradigen systemischen Entzündung5.

Klassische Aktivierung von Makrophagen wohnhaft sind, um die Aorta und Leber sowie ihre Einstellung zu weißen Fettgewebe (WAT) nachweislich nicht nur Dysregulation von metabolischen Signalen zu initiieren, sondern auch nachhaltig Entzündung6,7. Die phänotypische und funktionelle Heterogenität von Makrophagen ist stark verbunden mit der Entstehung von Übergewicht im Zusammenhang mit Komorbiditäten7. Die dynamische Plastizität in Makrophagen Polarisierung ermöglicht diese Zellen eine Reihe von aktivierten Phänotypen, die das Fortschreiten zu koordinieren und Auflösung der Entzündung8auszustellen. Während klassisch aktivierte Makrophagen (M1) in der Ausbreitung der Entzündung beteiligt sind, wurden Alternativ aktivierte Makrophagen (M2) mit Auflösung und Gewebe Reparatur9,10verbunden.

Wie der Körper metabolische Belastung erfährt, sammelt sich ungewöhnlich weißen Fettgewebe. Das erweiterte Fettgewebe anzieht und behält sich Entzündungszellen, die normalen Adipocyte Funktion zur Förderung der Insulinresistenz, Hyperglykämie und letztlich Typ-2 Diabetes Mellitus, Insulin-Resistenz oder Hyperglykämie11tiefgreifend verändern, 12. Parallel infiltriert weißen Fettgewebe umbaut in Reaktion auf inflammatorische Signale veröffentlicht von klassisch aktivierte (M1) Fettgewebe Makrophagen (ATMs)13,14. Diese mehrzellige Organ übt eine Kaskade von Signalen, die die normale Funktion der anderen Organe des Körpers wie die Aorta und Leber4entgleist.

Die Leber ist eine metabolische Kraftwerk, das als Reaktion auf Reize aus nahe gelegenen Dysregulated WAT15passt. Hepatische Makrophagen oder Kupffer Zellen als Reaktion auf metabolische Veränderungen, sezernieren inflammatorischen Zytokinen, die beide parenchymatösen verwandeln und nicht parenchymatösen Zelle Phänotyp und fördern Gewebe umgestaltet. Hepatische Lipid Akkumulation, Entzündung, übermäßige extrazelluläre Matrix Einlagen, Nekrose und eventuelle Funktion Verlust folgt die entzündlichen Beleidigungen beitragen, das breite Spektrum der Leberschäden im Zusammenhang mit nicht-alkoholische Fettleber 16,17,18.

Parallel zu kompromittierten WAT und Leberfunktion akkumulieren große Arterien Lipiden in der Arterienwand, wie der Körper chronischer metabolischer Stress19 erfährt. Arterielle Lipid Ansammlung löst die Sekretion von Chemokinen durch aktivierten Endothelzellen und spätere Rekrutierung von Monozyten20. Einmal eingestellt, vermehren Monozyten, differenzieren, Lipoproteine aufnehmen und zu Schaumzellen. Atherogenese initiiert und getragen von der Pro-inflammatorischen Aktivität von rekrutiert und Gewebe resident Lipid-beladene Makrophagen. Die extrazellulären und intrazellulären Stress-Signale weitergeleitet in diesem atherogenic Mikroumgebung erliegen, diese Makrophagen dann in eine Signalkaskade Apoptotic engagieren. Wenn diese Schaumzellen sterben, tragen sie ihre Lipid gefüllt Inhalte zum nekrotischen Kern der Läsion, die dann zu Plaque Ruptur, Herzinfarkt und Schlaganfall führt.

Die Heterogenität der Makrophagen Phänotypen orchestriert Kollektiv, teilweise die Adipositas induziert durch entzündliche Veränderungen in Dysregulated Gewebe wie WAT, Leber und Aorta8,21. Charakterisierung von rekrutiert und resident Gewebe Makrophagen konnte Einblick in mögliche molekulare Targets, die Makrophagen Phänotyp1bearbeiten. Um Makrophagen von Adipositas-induzierte entzündetem Gewebe effektiv zu charakterisieren, erhalten Sie eine einzellige Suspension durch enzymatische Verdauung. Solche Protokolle Dissoziation müssen ausreichend erniedrigende Bindegewebe bei gleichzeitiger Minimierung immun Zelltod und bietet optimale Zellausbeute wirksam. Die Enzym-Mischung ist abhängig von der Art des Gewebes und seiner strukturellen Make-up. Elastische Gewebe wie der Aorta erfordert stärkere enzymatische Aktivität im Vergleich zu der Leber und WAT Gewebe Dissoziation zu erreichen. Aus der Einzelzelle Suspension können Gewebe resident Makrophagen eindeutig gekennzeichnet oder isoliert für weitere nachgelagerte Analysen wie transkriptionelle Profilierung.

Hier ist eine gewebespezifische Protokoll beschrieben, die Kollagenase-abhängige Gewebe Verdauung und polychromatische Durchflusszytometrie verwendet, um effektiv zu isolieren und zu charakterisieren Gewebe-Bewohner Makrophagen aus traditionellen Ernährung induzierten Adipositas gewonnen, Arteriosklerose, einfache Steatose und Steatohepatitis Mausmodellen. Gleichzeitige Färbung der Zelle Oberflächenmarker mit Antikörpern gegen Leukozyten-(CD45 und/oder CD11b) und Makrophagen - spezifische Antigene (F4/80) wird häufig verwendet um Makrophagen Populationen22zu identifizieren. Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) ist eine wirkungsvolle Strategie verwendet, um diese identifizierten Populationen in hoher Reinheit zu sortieren. Die sortierte Bevölkerung kann dann für Phänotyp spezifischen Gen-Profile mit nachgeschalteten molekulare Analyse (z. B. quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion)23ausgewertet werden. Obwohl standard Durchflusszytometrie und Flow Cytometry-basierte Zellsortierung mächtige Werkzeuge in Makrophagen in einem stark heterogenen Zellsuspension zu unterscheiden sind, müssen der ehemaligen Protokolle optimiert werden, um erfolgreichen Ausgang zu gewährleisten. In dieser Studie sind Protokolle, die effektiv zu isolieren und zu charakterisieren bestimmte tragfähige Gewebe Makrophagen beschrieben; noch wichtiger ist, bietet diese Studie entscheidende Einblicke in technische Probleme, die häufig sowie proaktive und Fehlersuche Strategien zu verhindern bzw. zu lösen auftreten.

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Protocol

Alle experimentelle Protokolle (Abschnitte 1, 1.2 und 1.3) stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Pennsylvania State University.

Gewebe Dissoziation-Puffer-Vorbereitung Endvolumen Lagerung
Weißen Fettgewebe (WAT) Dissoziation Puffer: 2,5 % HEPES, 10 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA), 3 mg/mL (0,3 %) Kollagenase Typ II in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glucose ohne L-Glutamin und Natrium Pyruvat 500 mL minus 80° C (10 mL Aliquote)
Leber 25 x Perfusion Puffer Konzentrat (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, destilliert 240 mM HEPES, 150 mM NaOH in entionisiertem H2O 500 mL minus 20° C (40 mL Aliquote)
Erhaltung-Puffer (PRB): 1 % BSA in 1 x Perfusion Puffer 1 L 4 ° C
Dissoziation Puffer: 1 x Perfusion Puffer ergänzt mit 4,76 mM CaCl2 und 72 U/mL Kollagenase Typ IV 50 mL (per Mausklick) Bereiten Sie unmittelbar vor der Verwendung
Aorta Dissoziation: 125 U/mL Collagenase Puffertyp XI, 60 U/mL Hyaluronidase Typ I, 60 U/mL DNase I, 450 U/mL Kollagenase Typ I, 20 mM HEPES 1 x Phosphat Buffered Saline (PBS) 500 mL minus 80° C (10 mL Aliquote)

Tabelle 1: Gewebe spezifische Perfusion Puffer Rezepte.

(1) Gewebe isoliert und Dissoziation

  1. WAT Isolation und Dissoziation
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer gemäß Tabelle 1, und speichern sie wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie die Verdauung Puffer durch Auftauen das entsprechende Volumen der WAT Dissoziation Puffer und Speicher bei 4 ° C bis zur Verwendung. Unmittelbar vor dem Gebrauch warm Puffer auf 37 ° C. Vorbereiten des FACS-Puffers durch die Vorbereitung 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), enthält 2 % fetalen bovine Serum (FBS).
    3. WAT-Isolation
      1. Eine Maus in einem Kohlendioxid (CO2) gefüllt-Kammer einschläfern. Suchen Sie nach Wirksamkeit vor der Dissektion Bühne weiter.
      2. Tauchen Sie die euthanasierten Maus kurz in einen Becher mit 70 % igem Ethanol bis gründlich eingeweicht und mit Ethanol beschichtet. Legen Sie die Maus ventralen Oberfläche nach oben auf der Bühne der Dissektion und befestigen Sie Maus Vorder und Hinterpfoten die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln.
      3. Verwenden Sie mittlerer Punkt Spitze Pinzette, um die Bauchhaut anterior der Harnröhrenöffnung zu erfassen, dann verwenden Sie scharfen sezierenden Schere um einen Nick in der erfassten Bauchhaut.
      4. Der kleine Schnitt zwischen Haut und Bauchfell Untermesser der Schere einfügen und einen seitlichen Schnitt aus Bauch, den Brustkorb zu machen.
      5. Ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut um die intakte Bauchhöhle aufzudecken und machen einen seitlichen Schnitt durch das Peritoneum und entweder Klappen Sie die transparente Membran oder Verbrauchsteuern das Gewebe um den Bauch WAT verfügbar zu machen.
      6. Die Perigonadal Fettpölsterchen zu sammeln, wie in Mann Et Al. beschrieben 24
        1. Die Perigonadal Fettpölsterchen bei männlichen Mäusen sind locker an den Nebenhoden und Hoden gebunden. Zuerst suchen Sie die Hoden mit mittlerer Punkt Zange, erfassen von den Nebenhoden Kopf halten und ziehen.
        2. Mit scharfen sezierenden Schere, Verbrauchsteuern Sie jedes epididymal Fettpolster durch Schneiden entlang der Oberfläche des Nebenhodens (Kopf, Körper und Heck) und den Hoden.
        3. Ziehen Sie mit der Zange vorsichtig auf die Fettpolster, während schneiden durch das Bindegewebe direkt an die Nebenhoden Struktur gebunden.
        4. Mit der Pinzette, greifen Sie fest zum Jahresende Fettlappen proximal zu den Nebenhoden und schälen Sie vorsichtig Fettpolster Weg von den Keimdrüsen
        5. Bei weiblichen Mäusen sind die Fettpölsterchen Perigonadal lose Bindung an den Körper der Gebärmutter und uterine Horn.
        6. Mit mittlerer Punkt Pinzette, greifen Sie das Perigonadal Fettgewebe und ziehen Sie vorsichtig das Gewebe vom Körper der Gebärmutter und uterine Horn.
        7. Verbrauchssteuern Sie jedes Fettpolster durch Schneiden entlang der Gebärmutter Körper und uterine Horn mit scharfen sezierenden Schere.
      7. Legen Sie das Fett Pads in einer Petrischale gefüllt mit PBS und halten Sie auf dem Eis, Gewebe feucht zu halten.
    4. Dissoziation von WAT in einzelnen Zellsuspensionen
      1. Entfernen Sie überschüssige PBS aus der Petrischale und verwenden Sie eine einzelne Kante Rasierklinge um den Bauch WAT in kleine Stücke hacken.
      2. Kratzen Sie mit der scharfen Kante der Rasierklinge sanft die Hackfleisch / Bauch WAT in eine beschriftete 15 mL Polypropylen Sammelröhrchen mit 2 mL WAT Dissoziation Puffer.
      3. Inkubieren Sie diese Gewebe-Verdauung Puffer Mischung unter langsame kontinuierliche Rotation bei 37 ° C für 45 min.
      4. Filtern der verdauten Gewebes durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL Sammelröhrchen während der Bewegung des Kautschuk-Kolbens von einem Spritzenkolben in einer kreisförmigen Bewegung und weiterhin die Zellsuspension durch den Filter Sieb.
      5. Pipettieren 2 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) an eine 15 mL Sammelröhrchen sanft Pipettieren rauf und runter und waschen Sie den Filter mit der Single-Zellsuspension.
      6. Waschen Sie den Filter zwei weitere Male mit kalten DMEM und die einzelnen Zellsuspension auf Eis.
      7. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 X g bei 4 ° C für 8 min.
      8. Verwenden einer Vakuum-Sauger vorsichtig schwimmende Adipozyten (zunächst) entfernen und verbleibende Überstand. Achten Sie darauf, nicht die gebeizte Stromazellen vaskulären Bruch (SVF) stören.
      9. Aussetzen Sie mit einer 1.000 µL Pipette sanft wieder, das Pellet in Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer zur lyse der Erythrozyten nach den Anweisungen des Herstellers.
      10. Verdünnen Sie die oben genannten Zellsuspension mit DMEM und Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 g bei 4 ° C für 8 min.
      11. Wieder aussetzen Zellen in kaltem PBS mit 2 % FBS (FACS-Puffer) und zählen Sie die Zellen in einem Burker Kammer/Hemocytometer.
      12. Übertragen Sie entweder 1 x 106 Zellen (für grundlegende Durchflusszytometrie) oder die gesamte Zellsuspension (für FACS) 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre zu kennzeichnen. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.
  2. Lebergewebe isoliert und Dissoziation
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde von Smedsrød25.
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer gemäß Tabelle 1 und aufbewahren Sie, wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie 1 X Perfusion Puffer (PB), durch Verdünnung 40 mL der PBC in 960 mL Reinstwasser H2O. Pre Warm pro Spritze mit 50 mL PB bei 37 ° C gefüllt kurz vor Perfusion. Vermeiden Sie Luftblasen vorhanden.
        1. Um Luftblasen zu beseitigen, invertieren Sie die Spritze, wo die Leur Sperre Spitze nach oben zeigt. Tippen Sie oder streichen Sie die Spritze bis Luftblasen auf der obersten Pf die Spritze. Schieben Sie den Kolben in die Luft zu vertreiben
      2. Vorbereitung den Verdauung Puffer durch Verdünnung 0,5 mL 476 mm CaCl2 -Lösungbis 49,5 mL 1 x Perfusion Puffer. Die 4,76 mM CaCl2 -Lösung PB 3600U Kollagenase Typ IV hinzufügen. Wärmen Sie eine Spritze gefüllt mit 50 mL des Puffers Verdauung bei 37 ° C kurz vor Perfusion vor. Beseitigen Sie Luftblasen vorhanden, wie in Schritt 1.2.2.1.1 beschrieben.
      3. Bereiten Sie die Erhaltung Puffer (PRB) durch Auflösen von 2,5 g Rinderserumalbumin (BSA) in 250 mL 1 X Perfusion Puffer. Bei 4 ° C lagern Sie oder halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
      4. FACS-Puffer mit 1 X PBS und 2 % FBS vorzubereiten.
    3. Lebergewebe isoliert
      1. Einschläfern Sie eine Maus durch CO2 ersticken, sättigen Sie Maus mit 70 % Ethanol, Kontamination von intraabdominellen Organe mit Fell zu verhindern.
      2. Position der Maus Bauchseite bis auf Polystyrol Schaum sezieren Board und sichern die Maus Vorder- und Hinterbeine Pfoten die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln.
      3. Um die Thoraxwand und Bauchhöhle verfügbar zu machen, greifen Sie die Bauchhaut in der Nähe der Harnröhrenöffnung mit einem mittleren Punkt Spitze Pinzette. Verwenden Sie dann einen scharfen sezierenden Schere zum einen kleinen Schnitt an der erfassten Bauchhaut zu erstellen.
      4. Untermesser der Schere in der kleine Schnitt zwischen Haut und Bauchfell und einen seitlichen Schnitt von der Leiste bis zum Kinn.
      5. Ziehen Sie vorsichtig wieder die Haut zu entlarven die intakte Bauchhöhle und Thoraxwand, machen einen seitlichen Schnitt durch das Peritoneum und Verbrauchsteuern die Membran.
      6. Heben Sie das Brustbein und sorgfältig einzuschneiden Sie das Zwerchfell, achten Sie darauf, nicht zu der unteren Hohlvene (IVC) stören. Bewegen Sie die gastro-intestinalen Organe zur Seite, und suchen Sie die subhepatic IVC. Verwenden Sie blutstillende Zange um Suprahepatic IVC lokalisierte Perfusion zu spannen.
        Hinweis: Übermäßige Ansammlung von weißen viszeralen Fettgewebe kann oft die IVC maskieren. Um dieses Schiff besser zu visualisieren, kann ein kleiner Bereich des Fettgewebes neben der IVC herausgeschnitten werden. Das eingeschnittene Fenster innerhalb der biegsamen Fettgewebe kann dann über die IVC, das Schiff für Kanülierung aussetzen positioniert werden.
      7. Legen Sie die Spritze gefüllt mit vorgewärmten PB auf die 23 G Blut Sammlung und Infusion. Drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis der Schlauch und Nadel mit PB gefüllt sind.
      8. Setzen Sie die 23 G-Nadel, parallel zur Ebene des subhepatic IVC. Sichern Sie die Nadel mit einer 4 cm blutstillende Klemme.
        Hinweis: Kanülierung der Subhepatic, die IVC bei Diät gefütterten Mäusen bevorzugt wird, insofern als die IVC besser sein kann visualisiert und kanülierte innerhalb des Hohlraums mit Fett gefüllt.
      9. Schieben Sie den Kolben Perfusion beginnen, Farbe wird schnell Spülen aus der Leber (rechter Lappen zuerst) wenn die Nadel in das Gefäß entsprechend positioniert ist. Erweiterung der Lappen ist auch sichtbar, wenn die Nadel richtig in die subhepatic IVC eingesteckt ist.
      10. Schneiden Sie prompt die Pfortader damit die PB frei durch die Leber fließen kann.
      11. Durchspülen Sie die Leber, bis Blut nicht mehr sichtbar ist. Massieren Sie gelegentlich Leber Lappen zwischen Vordergrund-Finger und Daumen Perfusion zu erleichtern.
        Hinweis: Es ist wichtig, nicht gezahnt stumpfen scharfkantigen Werkzeuge verwenden, um die Leber um Gewebeschäden zu vermeiden zu behandeln.
      12. 5 mL PB in der Spritze bleibt, ändern Sie in der Spritze mit vorgewärmten Dissoziation Puffer gefüllt. Stören Sie die Position der gesicherten Nadel während dieser Zeit nicht.
        Hinweis: Vergrößerte Leber, die deutlich über 1,5 g mit einem größeren Volumen von vorgewärmten Verdauung Puffer garantieren erfolgreiche Leber Dissoziation durchblutet werden sollte.
      13. Durchspülen der Leber bis vollständig verdaut. Massieren Sie Leber Lappen um die Durchblutung zu erleichtern.
        Hinweis: Trennung Glissons Kapsel aus Parenchym ist zu beobachten, in der erfolgreich verdaute Leber. Um dies zu beurteilen, verwenden der stumpfen Kante eines Paares von Zangen, sanft auf der linken seitlichen Lappen drücken. Ein Bild sollte erscheinen auf der Oberfläche und die Einrückung sollte langsam füllen, sobald die Zange entfernt wird.
      14. Entfernen Sie die Nadel aus der subhepatic IVC. Entfernen Sie nicht die blutstillende Zange spannen Suprahepatic IVC.
      15. Die gesamte Leber durch sorgfältig durch die Verbindung der Bänder mit einer kurzen geraden Klinge Präparierscheren schneiden Verbrauchsteuern und die Gallenblase zu entfernen.
      16. Legen Sie die gesamte Leber in einer 10 cm Petrischale mit 10 mL eiskaltes Erhaltung Puffer und Speicher auf 4 ÜberprüfungenC bis bereit, um Zellen zu befreien.
    4. Leberzelle Dissoziation
      1. Übertragen Sie die Leber auf eine 10 cm Schale mit 10 mL eiskaltes DMEM.
      2. Fassen Sie den abgetrennten Suprahepatic IVC die ausgeschnittenen Leber mit einem gezahnten Zangen befestigt. Verwenden Sie mittlerer Punkt Zange, die Zellen aus der Glisson Kapsel freizugeben, indem Sie streicheln Eilgang auf jeder Lappen.
      3. Ein 70 µm Zelle Sieb angebracht zu einem Sammelrohr 50 mL durchlaufen Sie gesättigte DMEM.
      4. Pipettieren 10 mL eiskaltes DMEM 10 cm Petrischale und wiederholen Sie die Schritte 1.2.4.1. zu 1.2.4.3 bis Medien Sättigung nicht mehr eingehalten werden. Ort der Zellsuspension auf Eis oder bei 4 ° C.
      5. Vorsichtig mischen die Zellsuspension durch invertieren das Sammelröhrchen und anschließend Zentrifugieren bei 54 X g für 2 min bei 4 ° C.
      6. Den Überstand in ein sauberes 50 mL Sammelrohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 54 X g für 2 min bei 4 ° C.
      7. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4.6. zwei weitere Male, bevor Sie mit Schritt 1.2.4.8.
      8. Den Überstand auf eine saubere 50 mL-Sammelröhrchen übertragen und Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C.
      9. Re nicht parenchymatösen Zelle Pellet in FACS Puffer und in ein Burker Kammer/Hemocytometer zu zählen.
      10. Übertragen Sie 1 x 106 Zellen (für grundlegende Durchflusszytometrie) oder 15 x 106 - 20 x 106 Zellen (FACS) auf 5 mL Rundboden Polystyrol Röhrchen beschriftet. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.
  3. Aorta Isolation und Dissoziation
    Hinweis: Dieses Protokoll wurde vom Metzgeret al.26
    1. Bereiten Sie die gewebespezifischen Puffer basierend auf den in Tabelle 1 enthaltenen Rezepte zu und aufbewahren Sie, wie beschrieben.
    2. Die folgenden Reagenzien vorzubereiten.
      1. Bereiten Sie die Verdauung Puffer durch Auftauen das entsprechende Volumen der WAT Dissoziation Puffer und Speicher bei 4 ° C bis zur Verwendung. Unmittelbar vor dem Gebrauch warm Puffer auf 37 ° C.
      2. Bereiten Sie eine 10 X Heparin-Lösung durch Auflösen von Heparin Natriumsalz in 1 X PBS in einer Konzentration von 200 U/mL. Verdünnen Sie die 10 x Heparin-Stammlösung mit 1 X PBS, 1 x Heparin-Lösung vorzubereiten. 10 X und 1 x Heparin Lösungen bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
      3. Vorbereiten der FACS-Puffer mit 1 X PBS mit 2 % FBS.
    3. Aorta Dissektion
      1. Eine Maus in einer Kammer Kohlendioxid gefüllt und mit 70 % igem Ethanol spülen einschläfern.
      2. Legen Sie die Maus Bauchseite nach oben auf der Bühne der Dissektion, verbreiten Sie Maus Vorder und Hinterpfoten zu und die Dissektion gegenüber mit 21 G Nadeln befestigen.
      3. Unmittelbar nach dem euthanizing der Maus ausführen Herzpunktion. Beziehen sich auf Schritte 1.3.3.4, 1.3.3.9, falls erforderlich.
      4. Suchen Sie das Xiphoid Prozess am unteren Ende des Brustbeins
      5. Dazu legen Sie einen Finger Mittelpunkt entlang der Breite der Hals des Tieres. Verfolgen Sie entlang der ventralen Mittellinie vom Hals bis zum kaudalen Ende des Brustbeins bis eine knorpelige Erweiterung zu spüren ist.
      6. Verwenden Sie mittlerer Punkt Zange, um die knorpelige Erweiterung zu erfassen und ggf. Markieren Sie die Position des Xiphoid Prozesses durch das Entfernen des Patches von Haar oder Haut im Bereich.
      7. Teilweise Nadel 26 G unter dem Xiphoid Prozeß in 20-30°-Winkel.
      8. Leicht negativen Druck auf die Spritze durch den Kolben langsam zurückziehen, dann stechen Sie die Nadel weiter in den Hohlraum bis Blut fließt.
      9. Wenn der Blutfluss stoppt, drehen Sie die Nadel oder bewegen Sie langsam etwas in und heraus.
      10. Verwenden Sie das Paar der Zange zu greifen die Bauchhaut anterior Harnröhre halten öffnen und verwenden einen scharfen sezierenden Schere entlang der ventralen Mittellinie durch das Bauchfell von der Leiste bis zum Kinn geschnitten.
      11. Ziehen Sie die Haut, die Bauchorgane und Brustkorb mit Fingern aussetzen oder stumpfen Pinzette vorsichtig Bauchorgane zur Seite bewegen.
      12. Verwenden Sie die Zange greifen des Xiphoid-Prozesses halten heben das Brustbein und Einschneiden des Zwerchfells.
      13. Mit der sezierenden Schere, Schnitt durch die seitlichen Rippen auf beiden Seiten. Greifen des Brustbeins, drehen Sie den Brustkorb nach oben und durch die verbindende Basis geschnitten. Entfernen Sie den Brustkorb, die Freilegung der zugrunde liegenden thorakalen Organe.
      14. Durchspülen der Aorta mit einer 26-Gauge Nadel eine 10 mL-Spritze gefüllt mit 1 x Heparin-Lösung durch die Injektion von 1-2 mL der Lösung in den linken Ventrikel (LV) des Herzens.
        Hinweis: Achten Sie darauf, mit einer niedrigen Übertragungsrate mit wenig Druck darauf intakte atherosklerotische Läsionen Aorten durchspülen.
      15. Verbrauchsteuern Sie, Thymus, Lungen und Bindegewebe. Beziehen sich auf Schritte 1.3.3.16 und 1.3.3.17, falls erforderlich.
        1. Anterior Herzen zu finden, der weiße Bi-gelappt (oder Schmetterling geformt) Orgel und fest greifen Halt des Thymus mit der Zange. Beide Lappen von der Kavität nach oben ziehen und an der Basis mit der Schere ausschneiden.
        2. Um die Lunge zu entfernen, drücken Sie ein Lungenflügel mit der Zange, ziehen Sie das Gewebe von der Brusthöhle und Schneiden an der Basis. Wiederholen Sie für jeden verbleibenden Lappen.
      16. Verwenden Sie eine Dissektion Mikroskop und Mikro-sezieren Werkzeuge und sammeln die Aortenklappe (einschließlich der Innominate Arterie, linke gemeinsame Halsschlagader und linken subclavia), Bogen der aufsteigend, absteigend, thorakalen und abdominalen Aorta.
        1. Suchen Sie die Aorta ascendens auf dem linken Ventrikel des Herzens.
        2. Mit ein paar gebogene 0,07 x 0,04 mm-Tipp greifen Zange vorsichtig den Teil der Aorta ascendens aus der linken Herzkammer.
          Hinweis: Im Vergleich zu den umliegenden gelb gefärbten Fettgewebe, wird die Aorta eine helle weiße Schiff aus der LV, wenn ausreichend mit der Heparin-Lösung gespült werden.
          1. Wenn die Aorta durch kardiale Perfusion nicht richtig gespült wurde, spülen Sie die Aorta wieder während die Aorta in die Kavität verbunden bleibt. Dazu schneiden Sie in der Nähe der Herz-Aorta-Kreuzung, entfernen Sie Herzen zu und dann horizontal durchschneiden Sie die Low-End der Bauchschlagader. 26 G Nadel in die Öffnung der Aorta ascendens und sanft spülen der Aorta mit 1 x Heparin-Lösung.
          2. Ziehen Sie vorsichtig, auf die Aorta ascendens, besser zwischen dem Fettgewebe und eingebettete Aorta zu unterscheiden.
          3. Noch leichtes Ziehen an der Aorta ascendens, mit der Spitze eines geschlossenen Frühling Präparierscheren, um das Fett, das die aufsteigende Aorta und Aortenbogen Kapseln zu löschen. Um dies zu tun, streicheln Sie das Fettgewebe mit der Spitze des geschlossenen Schere Messer das verbindende Fett losreißen.
            Hinweis: Verzichten Sie besteuert jeder Fettgewebe durch Schneiden bis die aufsteigende Aorta und Bogen übersichtlich visualisiert werden können. Dies soll verhindern, dass die Aorta schneiden.
          4. Verwenden Sie die aufsteigende Aorta und Bogen deutlich aus dem Fettgewebe Surround abgegrenzt werden können, Frühjahr Präparierscheren, um überschüssiges Fett Verbrauchsteuern.
          5. Behutsam fasse sie der Aortenbogen mit der Zange. Wieder mit der Feder Schere Spitze, Strich am Fett entlang der Länge der absteigenden, thorakalen und abdominalen Aorta am kaudalen Ende der Bauchschlagader, auf der rechten Seite der Hülse von Fett.
          6. Weiter entlang der Aorta zu erfassen, wenn das Fett Weg zu reißen. Achten Sie darauf, so sanft tun, um zu verhindern, dass die Aorta zu beschädigen.
          7. Ziehen Sie vorsichtig die Aorta nach oben in Richtung des Mikroskops, so dass das Fett jetzt hinter der Aorta positioniert ist.
          8. Einfügen Sie die geschlossenen Schere Messer zwischen die Fett-Aorta-Schnittstelle am vorderen Ende der absteigenden Aorta, schwere das Fettgewebe Anlage an der Aorta Oberfläche stumpf mit einer schwungvollen Bewegung.
            Hinweis: Gründlich entfernen überschüssiges Fett und Gewebe zu verbinden, während die Aorta noch innerhalb des Hohlraums ist empfiehlt sich.
          9. Verbrauchsteuern Sie Herzen und am kaudalen Ende der Bauchschlagader quer geschnitten. Entfernen Sie die gesamte Aorta.
          10. Legen Sie die Aorta in einer 35-mm-Schale und entfernt necken Sie überschüssiges Fett auf der Aorta mit zwei 21-Gauge Nadeln zu. Legen Sie die ausgeschnittene Aorta in 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch auf Eis.
    4. Dissoziation der Aorta in einzelnen Zellsuspensionen
      1. Pipettieren 0,2 mL Aorta Dissoziation Puffer, das Rohr mit der Aorta. Legen Sie die Frühling Scheren Messer in Richtung das spitz zulaufende Ende des Rohres und schnell Zerkleinern der Aorta zur enzymatischen Verdauung zu erleichtern.
      2. Übertragen Sie die Gewebe-Lösung-Mischung in einen 15 mL Sammlung Rohr- und Pipette 1,8 mL Aorta Dissoziation Puffer für ein Gesamtvolumen von 2 mL.
        Hinweis: Für den problemlosen Austausch der Gewebe-Suspension, schneiden Sie die 1 cm das verjüngte Ende des einen standard 1.000 µL Pipettenspitze ab. Verwenden Sie die verkürzte Spitze, um das Fahrwerk mit einer Mikropipette übertragen.
      3. Inkubieren Sie die Hackfleisch / Aorta in die Aorta Dissoziation Puffer 55 Minuten bei 37 ° C, bei 220 u/min (0.514 x g) schütteln.
      4. 50-µm-Zelle-Sieb durchlaufen Sie die Suspension in einem 15 mL Polypropylen Sammelröhrchen. Verwenden des Kautschuk-Kolbens von einem Spritzenkolben Filterung zu erleichtern.
      5. Spülen Sie das Sammelröhrchen 15 mL mit 1 mL FACS-Puffer, sammeln Sie die Aussetzung und die Zelle Sieb passieren.
      6. Waschen Sie die 50 µm Zelle Sieb zwei weitere Male mit 1 mL FACS Puffer.
      7. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 X g für 5 min bei 4 ° C. Wieder aussetzen Sie-Zellen in kalten FACS-Puffer. Zählen der Zellen in einem Burker Kammer/Hemocytometer.
      8. Übertragen Sie 1 x 106 (für grundlegende Durchflusszytometrie) Zellen oder die gesamte Zellsuspension (für FACS) auf einem beschrifteten 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre. Weiter zu Abschnitt 2 für Durchflusszytometrie Färbeprotokoll.

(2) flow Cytometry und FACS Färbung

Fluorophor R-Phycoerythrin (PE) PE/Cyanin (Cy) 7 PE/Cyanin (Cy) 5 Pacific Blue (PB)
Laser (nm) Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm) Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm) Blau (488 nm) / gelb (561-570 nm) - grün (532 nm) Violett (405 nm)
ErregungMAX (nm) 496 496 496 401
EmissionMAX (nm) 578 785 667 455
Phänotypischer Marker F4/80 CD11c CD11b CD45
EMR1, Ly71 ΑX Integrin Integrin αX Kette, CR4, p150, ITGAX ΑM Integrin, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM T200, Ly-5, LCA
Gezielte Zelltyp Resident Gewebe Makrophagen (M1) klassisch aktivierte Makrophagen Monozyten / Makrophagen Leukozyten (Makrophagen / Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten)
Teilmenge von dendritischen Zellen Dendritische Zellen, NK-Zellen, aktiviert T-Zellen und eine Teilmenge der intestinalen intraepitheliale Lymphozyten (IEL) Teilmengen von T- und B-Zellen, Granulozyten, dendritische Zellen und NK-Zellen
Verdünnungsfaktor 01:50 1: 100 1: 100 1: 100
Isotype Kontrollen PE Ratte IgG2a PE/Cy7 armenischen Hamster IgG PE/Cy5 Ratte IgG2b Pacific Blue Ratte IgG2c

Tabelle 2: Liste der Fluorophor getaggt Antikörper spezifisch für anspruchsvolle Gewebe resident Makrophagen.

  1. Sammeln und bereiten Sie die folgenden Elemente: FACS Puffer 5 mL Rundboden Polystyrol Rohre, Anti-Maus-CD16/32 Fc-Rezeptor blockieren Antikörper, Fluorophor konjugiert oder unkonjugierten Primärantikörper, Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (If erforderlich), 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    Hinweis: Für große Mengen von Zellen beflecken, ist Antikörperkonzentration kritischste statt Handynummer. Beispielsweise wenn Färbung 10 x 106 die Färbung Puffervolumen Zellen und Antikörperkonzentration gleich sein sollte, als ob Färbung 1.0 x 10 Zellen6 in 100 µL Puffervolumen. Zum Beizen 1.0 x 108 Zellen, Erhöhung der Antikörper-Menge 5-Fach wird empfohlen.
  2. Jedes FACS-Rohr zusätzliche eiskalte FACS-Puffer hinzu, falls erforderlich, pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 751 X g für 5 min (4 ° C). Aspirieren Sie der Überstand folgende Zentrifugation.
  3. Fügen Sie Anti-Maus-CD16/CD32 Fc-Rezeptor blockieren Antikörper gegen alle Proben entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie für 15 min bei 4 ° C oder auf Eis.
  4. Fügen Sie Fluorophor konjugiert Primärantikörper cocktail direkt an den Fc-Rezeptor blockierende Antikörper enthaltende Zelle Aussetzung und inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 min. Protect Proben vom Licht zum Bleichen von Fluorophor-konjugierten Antikörpern zu minimieren.
    1. Im Falle unconjugated Primärantikörper verwendet wurden, gehen Sie folgendermaßen vor nach Abschluss von Schritt 2.4.
    2. Wash Primärantikörper gefärbten Proben durch Zentrifugation bei 751 X g für 5 min (4 ° C).
    3. Entfernen Sie überstand durch Dekantieren und wieder auszusetzen Sie Pellet in 100 µL FACS Puffer.
    4. Alle notwendigen Proben konjugierten Sekundärantikörper hinzu und 30 min bei 4 ° c inkubieren Fahren Sie mit Schritt 2.5.
  5. Folgende Antikörper Inkubationszeit, fügen Sie 2 mL Eis kalt FACS Puffer dann pellet-Zellen bei 751 X g für 5 Minuten (4 ° C). Abgießen Sie überstand und achten Sie darauf, nicht zu Pellets zu stören.
  6. Zellen vorsichtig mischen und mit 200-400 µL FACS Puffer wieder aussetzen dann halten Sie dies im Dunkeln bei 4 ° C bis standard Flow Cytometry-Analyse oder Zellsortierung.
  7. Fahren Sie für kurzfristige Fixierung der gefärbten Zellen mit Schritte 2,8 bis 2.10. Verwenden Sie Fixierung für standard Durchflusszytometrie nur.
  8. Unmittelbar nach Schritt 2.5 wieder auszusetzen, Zellen in 0,5 mL 2-4 % Paraformaldehyd (PFA) für 15-30 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Vorsicht: PFA ist ein bekanntes Ärgernis mit Karzinogenen und toxischen Wirkungen. Bei der Verwendung von PFA mit äußerster Sorgfalt zu behandeln. Achten Sie darauf, die geeignete persönliche Schutzausrüstung benutzen und Absaugung.
  9. Folgenden Fixierung waschen Zellen durch Zugabe von 2 mL FACS Puffer auf alle Proben und Zentrifugieren bei 751 X g bei 4 ° C für 5 min. entfernen überstand folgende Zentrifugation.
  10. Aufschwemmen Sie feste Zellen in 200 µL Eis kalt FACS-Puffer und Speicher bei 4 ° C. Shop Update Zellen bis zu 1 Woche bei 4 ° C, im Idealfall führen Flow Cytometry Erwerb innerhalb von 48 Stunden, Autofluoreszenz zu minimieren.
  11. Erwerben Sie Flow Cytometry Daten gemäß Anweisungen des Herstellers Flow Cytometer oder führen Sie fluoreszierende aktivierte Zellsortierung wie von Basu Et al.beschrieben. 23

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Representative Results

Bei der Verwendung von Apolipoprotein E mangelhaft (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) Mäuse auf einem hohen Fett hohe Cholesterin-Diät (HCHFD oder HCD) für 18 Wochen, 1 x 10-4 - 2 x 104 CD45 gepflegt+F4/80+ Aorten Makrophagen können isoliert werden, wenn zwei Proben zusammengefasst. Lebern von HFHCD gefütterten ApoE KO Mäusen seziert produziert größer als 5 x 105 sortiert Kupffer Zellen (die Sortierung zur Verfügung stehende Zeit abhängt). Wenn fettreiche Diät (HFD) mit Wildtyp (WT) C57BL/6 Mäusen gefüttert, kann 5 x 105 bis 1 x 106 resident Fettgewebe Makrophagen (ATMs) von den Stromazellen vaskulären Bruch (SVF) sortiert werden. Die genannten Gesamtzahl von Makrophagen, die von einem bestimmten Gewebe sortiert werden können war ausreichend für Genanalyse Ausdruck verwenden quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) durchführen. Für Gewebe, wo weniger Zahlen der Makrophagen Bevölkerung, wie z. B. der Aorta zurückgewonnen werden, empfiehlt es sich, verwenden Co Fällungsmitteln (z.B. Glykogen) und über Nacht Niederschlag, wenn RNA Isolierung für diese Analysen benötigt wird.

Hier fließen die Auswirkungen der Diät-induzierten Stoffwechselstörungen auf Makrophagen Phänotyp mit grundlegenden Zytometrie, Fluoreszenz-activated Cell sorting (FACS) und nachgeschalteten Post Art Analysen gezeigt werden. Diese Ergebnisse bestätigen die bisher veröffentlichte Beobachtungen, dass Mäuse eine HFD oder HFHCD Ausstellung erhöht Infiltration von klassisch aktivierte Makrophagen (M1) in den betroffenen Geweben wie der Aorta (Abbildung 1 b) gefüttert. Unter Ausnutzung der Durchflusszytometrie, FACS und Gene Expression profiling (über quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), der vorherrschenden Phänotyp für Ron-Rezeptor-Tyrosin-Kinase exprimierenden CD45+ F4/80+ Makrophagen abgeleitet Gewebe aus Diät-gefütterten Mäusen isoliert wurde beobachtet. Ron Rezeptor exprimierenden Aorten Makrophagen die eine entzündungshemmende Phänotyp gezeigt wurden in HFHCD gefütterten Mäusen (Abbildung 1 und D) gesenkt. Sortierte Ron Rezeptor exprimierenden Makrophagen abgeleitet verdaute Hauptschlagadern nachgewiesene erhöhte Arginase 1 (Arg1) gen-Expression, die eine etablierte M2-Makrophagen-Marker (Abbildung 1E) ist. Pro-inflammatorischen Makrophagen als CD45 charakterisiert+ F4/80+ CD11c+ wurden in den Hauptschlagadern isoliert von HFHCD gefütterten Mäusen (Abbildung 1 b und D) erhöht. Charakterisierung von Leber-Bewohner Makrophagen aufgeklärt weiter die vorherrschenden Phänotyp von Ron Rezeptor exprimierenden Subpopulationen (Abbildung 2A). CD11c + Pro-inflammatorischen Makrophagen Bevölkerung demonstriert eine Verringerung der Expression von Genen, die dringend eine entzündungshemmende (M2)-Phänotyp wie Arg1 und Ron (Abb. 2 b) zugeordnet sind. Ähnliche Tendenzen beobachtet in Makrophagen Populationen isoliert von verdaute weißen Fettgewebe (Abbildung 3). Makrophagen Bevölkerung mit einer Pro-inflammatorischen Signatur zeigte verminderte Oberflächenexpression von Ron-Rezeptor (Abbildung 3). Kombination der Ansätze, grundlegende Durchflusszytometrie und FACS, führte zu überzeugenden Daten, die weiter den Ron-Rezeptor als Regulator der alternative (M2)-Aktivierung in Makrophagen32überprüft. Diese Voreingenommenheit gegenüber eine entzündungshemmende (M2)-Phänotyp hat sich gezeigt, um eine schützende Rolle in der Entstehung und Progression von Adipositas, Atherosklerose und Steatohepatitis31spielen.

Figure 1
Abbildung 1: Charakterisierung von Makrophagen isoliert aus dissoziierten Aorta entfernt von ApoE KO Mäusen zu ein HCD für 18 Wochen beibehalten. (A) Zellen wurden zuerst auf CD45 gated+ Leukozyten, ausgenommen Zelltrümmer. (B) CD45 Färbung in Verbindung mit F4/80 wird verwendet, um doppelte positive Bevölkerung vermutet, Makrophagen abzugrenzen. Zusätzliche Anspritzung wurde verwendet, um den Prozentsatz der CD11c zeigen+CD45+F4/80+ (M1) und (C) Ron+CD45+F4/80+ (mögliche M2) Makrophagen in Aorten abgeleitet von Mäusen ernährten sich entweder eine normale Chow oder hohe Cholesterin-Diät für 18 Wochen. (D) erhöht Anteil an CD11c+CD45+F4/80+ (M1) Makrophagen sowie eine verminderte Anteil von Ron+CD45+F4/80+ (mögliche M2) Makrophagen wurden in den Hauptschlagadern beobachtet abgeleitet von Mäusen gefüttert HCD verglichen mit Mäusen, die eine normale Chow-Diät gefüttert. (E) gen Expressionsanalyse von sortierten Ron+CD45+F4/80+ Makrophagen zeigten erhöhte Expression von Arginase ich (ein bekannter murinen M2 Marker). Werte wurden ermittelt mit Hilfe des Schülers t-Test Analysen mit Hilfe statistischer Analyse-Software durchgeführt und dargestellt, wie meine ± SEM. P < 0,05 galt als statistisch signifikant (* P < 0,05, *** P < 0,001). Abbildung wurde von Yu Et Al. modifiziert (2016) 31. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: gen Transkript profiling von Kupffer Zellpopulationen sortiert aus verdauten Lebern von ApoE KO Mäusen gepflegt auf einem HCD für 18 Wochen seziert. (A) allgemeine gating Schema zur Charakterisierung und Sortierung Kupffer-Zell-Populationen. (B) gen Expressionsanalyse von sortierten Ron (Ron+) zum Ausdruck zu bringen und nicht-mit dem Ausdruck (Ron–) CD45+F4/80+ Makrophagen mittels quantitativer RT-PCR. Der Student t-Test-Analysen wurden mit Statistiksoftware durchgeführt und Werte vertreten waren, wie meine ± SEM. P < 0,05 als statistisch signifikant galt (* P < 0,05, *** P < 0,001). Abbildung wurde von Yu Et Al. modifiziert (2016) 31 . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Charakterisierung von Geldautomaten von weißen Fettgewebe seziert von WT BL6 Mäusen isoliert eine HFD für 18 Wochen gefüttert. (A) allgemeine gating Schema zur Charakterisierung und Sortierung Fettgewebe abgeleiteten Makrophagen Populationen (B) Prozentsatz von Ron + Zellen innerhalb von CD45+F4/80+CD11c– und CD45+F4/80+CD11c+ Makrophagen Populationen von WAT sortiert. Abbildung wurde von Yu Et Al. modifiziert (2016) 31 . Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Diät-induzierten Stoffwechselstörung Modelle, die Komorbiditäten wie Atherosklerose, einfache Steatose, Steatohepatitis zu imitieren und Typ-2-Diabetes, sind weitgehend verwendet, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Progression der Erkrankung besser zu verstehen. Kollagenase abhängigen Verdauung wird häufig verwendet, Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix (ECM)16,27zu befreien zu distanzieren. Enzyme wie Kollagenase stören Kollagen die strukturelle Unterstützung für die benachbarten Zellen bietet. Das Gewebe Strukturbild diktiert die Gewebe Matrix Steifigkeit (Widerstand gegen Verformung) und welches rohe Kollagenase-Produkt ist am effizientesten bei der Sicherstellung der erfolgreichen ECM Störung28. WAT, die "weiche Matrix" besteht ist oft mit Kollagenase Typ II, Adipozyten und resident Immunzellen zu befreien, bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Integritätdes der Zelle Oberfläche Insulin-Rezeptoren29verdaut. Der Mikroarchitektur der Fibrille Komponenten der Aorta trägt zur "steife Matrix", für die wirksame Aortenstenose Verdauung mit Kollagenase Typ XI (mit der höchsten Kollagenase-Aktivität) in Kombination mit zusätzlichen Enzymen verwendet wird. Im Gegensatz zu der Aorta nutzt die Leber Verdauung ein Kollagenase mit einer schwächeren enzymatische Aktivität, Kollagenase Typ IV, zu stören die Matrix und lebensfähige Parenchym und nicht parenchymal Zellen30zu befreien. Chronisch entzündete Gewebe abgeleitet vom Wildtyp Diät gefüttert oder Mangel der Apolipoprotein E (ApoE KO) Mäuse auf einem C57BL6 Hintergrund oft durchlaufen umgestaltet, die richtige enzymatische Verdauung verhindern kann. In diesem Abschnitt diskutieren Strategien zu minimieren bzw. zu eliminieren die Möglichkeit falsche Gewebe Dissoziation und niedrigen Zelle Erholung.

Ein gemeinsames Merkmal der Gewebe abgeleitet Diät gefüttert Mausmodelle, die Adipositas, Atherosklerose und/oder nicht-alkoholische Fettleber zu imitieren ist krankhaftes Gewebe umgestaltet. Im weißen Fettgewebe, die Aorta und die Leber ist ECM Zusammensetzung verändert, was häufig übermäßige Ablagerung von fibrillären Komponenten wie Kollagene. Wildtyp C57BL6 Mäuse auf eine fettreiche Ernährung für achtzehn Wochen gepflegt erleben gewebespezifischen Abnormitäten wie erweiterte weißen Fettgewebe und vergrößerte Fettleber (einfache Steatose). Oft sind diese metabolischen Funktionen nicht lästige Hindernisse zu überwinden, bei der Gewebe Dissoziation. Auf der anderen Seite kann in anderen Diät induziert-Modellen, die mehr verschärfte Phänotypen zu spiegeln, der umfangreiche Umbau des Gewebes während der Gewebe Verdauung problematisch. HFHCD ApoE KO Mäusen gefüttert werden oft verwendet, um Modell Arteriosklerose und Steatohepatitis. Ein gemeinsames Merkmal erweiterte Steatohepatitis zugeordnet ist die übermäßige Ablagerung von ECM in der Leber (oder Fibrose). Fibrotische Leber hat gezeigt, dass während der enzymatischen Gewebe Dissoziation recht problematisch werden und erzeugt häufig niedrige Zelle Ertrag31. Um Zellausbeute zu verbessern, ist es wichtig, dass die Verdauung Protokolle ohne Abweichung verfolgt werden. Obwohl normale Leber können gehackt und in Verdauung Puffer eingetaucht zu Dissoziation, maximiert Perfusion mit Verdauung Puffer Kontakt zwischen der extrazellulären Matrix der Leber und der Kollagenase-Lösung; und daher ist dieser Ansatz sehr empfehlenswert. Darüber hinaus ist 20-30 mL des Puffers Verdauung oft eine ausreichende Lautstärke für erfolgreiche Dissoziation der normalen Leber; Allerdings ist in Bezug auf Maus-Modellen, die erweiterten und/oder fibrotische Lebern entwickeln, Perfusion mit 50 mL des Puffers Verdauung lieber richtige Verdauung bei gleichzeitiger Minimierung der Zelltod zu gewährleisten. Für die Leber mit Gewichten, die deutlich mehr 1,5 g als, Erhöhung des Volumens der Verdauung Puffer empfiehlt sich erfolgreiche Verdauung zu garantieren.

Gewebe Problem Mögliche Ursache Lösung
Weißen Fettgewebe (WAT) Schlechte Zelle Dissoziation Schlechte Verdauung Stellen Sie sicher, Verdauung Puffer ist bei 37° C
Zelltod Übermäßige Kollagenase Verdauung Verkürzen der Verdauung
Reduzieren Sie die Lautstärke der Verdauung Puffer
Aorta Schlechte Zelle Dissoziation Schlechte Verdauung Stellen Sie sicher, dass Verdauung Puffer bei 37 ° C ist
Aorta Warenstücken Verdauung Puffer waren zu groß Sicherstellen Sie, dass die Aorta ist in ca. 1 mm Stücke geschnitten
Aorta Stücke wurden nicht im Puffer Dissoziation während der Inkubation schütteln Sicher sein, dass die Aorta Stücke in der Aufschlusslösung Zittern
Zelltod Übermäßige Kollagenase Verdauung Verkürzen der Verdauung
Reduzieren Sie die Lautstärke der Verdauung Puffer
Leber Schlechte Zelle Dissoziation Schlechte Verdauung Stellen Sie sicher, dass Verdauung Puffer bei 37 ° C ist
Erhöhen Sie die Lautstärke der Verdauung Puffer
Unsachgemäße Kanülierung der IVC (Schwellung des Gewebes, die umliegenden IVC auftritt) Sicher sein, dass die Nadel richtig in die IVC eingefügt wird
Geplatzten IVC Nadel in IVC vor Perfusion ordnungsgemäß zu sichern
Perfusion Geschwindigkeit reduzieren
Gerissene Gewebe Perfusion Geschwindigkeit reduzieren
Zelltod Unzulässige Veröffentlichung von Zellen aus der Glisson Kapsel Achten Sie darauf, Zellen aus der Kapsel mit distanzieren beschrieben Methode streicheln
Übermäßige Kollagenase Verdauung Verkürzen der Verdauung
Reduzieren Sie die Lautstärke der Verdauung Puffer

Tabelle 3: Fehlersuche erfolglos Gewebe Dissoziation. Flow Cytometry basierte Zellsortierung oder FACS ist eine leistungsfähige Technik für die Isolierung von Zell-Populationen in hoher Reinheit ist eine Notwendigkeit. Wenn Zellen durch Zelle sortieren zu reinigen, erfordert hohe Zellausbeute, sondern auch eine Art von hoher Reinheit zu erreichen mit der richtigen Sortierstrategien. In diesem Abschnitt fließen Methoden zur Verbesserung der Multi-Fluorophor Zytometrie basierende Zellsortierung des Gewebes resident Makrophagen Diät gefütterten Mäusen abgeleitet werden beschrieben. Für verschiedene Gewebe resident Makrophagen Isolierung ist Surface Marker Auswahl ein entscheidender Schritt. Makrophagen, abgeleitet von WAT, Aorta und Leber sind oft ausgezeichnet mit einem CD45+, CD11b+, F4/80+ Anspritzung Strategie. Zusätzlichen Flow durchflusszytometrischen Paneele können verwendet werden, um resident Gewebe Makrophagen zu identifizieren. Diese Platten sind Antikörper, die für die Oberflächenexpression von Makrophagen bestimmte Glykoproteine (CD64, CD68 und CD14), große Histocompatibility komplexe (ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG) Sonde und Apoptotic Zellen Tyrosin-Kinase-Rezeptoren (MerTK)32, 33. spezifischen Makrophagen Phänotyp kann dann durch Sondierung für die selektive Oberflächenexpression von M2 abgegrenzt werden (CD163, CD209 und CD206) oder M1 Marker (CD38, CD40, CD80 und CD86)34,35. Auto-Fluoreszenz erzeugt durch Lipid-beladene Makrophagen kann einige Probleme darstellen, wenn Populationen gating. Mit Antikörpern markiert mit Fluorochromes, die begeistert sind von der gelb-grüne Laser (z. B. PE, PE/Cy5, PE/Cy7) oder roter Laser (z.B. APC, APC Cy7) emittierte Fluoreszenz, die deutlich heller ist als die Auto-Fluoreszenz führt und somit verbessern können Ergebnisse36. Bei der Auswahl der Fluorophor mit solch hohen Färbung Index und Potenzial Emissionsspektren Überlappung konjugiert, ist Einbeziehung geeigneter Kontrollen entscheidend. Wenn gating Grenzen erkennen, Einbeziehung der einzigen Fleck (SS) Steuerelemente und Isotype Steuerelemente ermöglichen für die Abgrenzung der positiven/negativen Bevölkerungen und die Messung der unspezifischen Hintergrundsignal verursacht durch primäre Antikörper bzw. 37. Umstände wo Zellen knapp sind, wir empfehlen die Verwendung von Entschädigung Partikel für SS und Isotype Steuerelemente. Vergütung Partikel in der Regel Strahlen heller Signale als biologische Kontrollen und haben auch weniger Varianz im Hintergrundfluoreszenz. Darüber hinaus Fluoreszenz minus 1 (FMO) Steuerelemente sind ideal für gating Grenzziehungen. Durch die Einbeziehung FMO-Steuerelemente, die maximale Fluoreszenz erwartet für eine Färbung Teilmenge in einem bestimmten Kanal zeigt sich, wenn der Fluorochrom-markierte Antikörper, der spezifisch für diesen bestimmten Fluoreszenz-Kanal ausgeschlossenen38ist. Nach unserer Erfahrung neben Einzelkompensation gefärbten Partikel Kontrollen beizufügen eine ungefärbte biologischen Vergleich-Steuerung für präzisere positiv/negativ-Grenzen setzen.

Ohne Zelltrümmer und Zelle-Aggregate in der gating-Strategie ist auch eine zusätzliche Ansatz verwendet, um Auto-Fluoreszenz zu minimieren. Um Zelltrümmer aus der lebensfähigen Zellenbevölkerung zu unterscheiden, ist die Verwendung forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) der häufigste gating-Strategie. Für isolierte Zellen, die für Post Art Analysen verwendet werden und erfordern höhere Rentabilität für DNA/RNA Extraktion, wird empfohlen, Lebensfähigkeit Flecken nicht mit jeder Fixierung und/oder Permeabilisierung Verfahren verwendet werden. Nukleinsäure-Integrität durch Nukleinsäure-Protein-Vernetzung und so zu begrenzen, Isolierwirkung, Erkennung und genaue Quantifizierung kann Formaldehyd Fixierung der Zellen. Zelle Aggregate wie bereits erwähnt können nicht nur dazu beitragen, emittierten Auto-fluoreszierende Signale, sondern auch in "Zufall bricht". Diese Aktion tritt Aufrechterhaltung hohen Reinheit in einer Art, aber wenn zu häufig, es reduziert die sortierten Zellausbeute. Sortier-Puffer (FACS-Puffer) ergänzt mit DNAse und MgCl2 während der Zelle Färbung kann Zelle Aggregation minimieren. Es wird empfohlen, nicht EDTA in Kombination mit DNAse verwenden, wie es die Enzymaktivität hemmt. Filterung der einzelnen Zellsuspension durch ein 70 µm Zelle Sieb vor der Sortierung kann auch Zellen von Aggregaten befreien. Es ist unbedingt zu beachten, dass zur Minimierung von Aggregation Zellsuspensionen in einer Konzentration von 5 Millionen Zellen pro mL in ein Mindestvolumen von 0,4 mL sein sollten. Zellen von Lipid-beladenen Gewebe isoliert sind in der Regel anfälliger für Aggregation und können dadurch Zufall abgebrochen und niedrige Art Ertrag. Es wird empfohlen, dass Proben weiter verdünnt werden, wenn Aggregation weiterhin besteht. Sortierte Makrophagen können in Polypropylen Rundboden Röhrchen mit fetalen bovine reiche Mittel zur Maximierung der Zelle Erholung gesammelt werden. Eine hohe FBS Ausgangskonzentration sorgt für Zelle Erholung, da die Konzentration schließlich mit jeder sortierten Tropfen verdünnt wird. Für das Sammeln von Zellen, die DNA oder RNA Analyse verwendet werden, können direkt in das entsprechende Extraktion Reagenz (z.B. TriZol), RNAse Kontamination zu verhindern Zellen sortiert werden. Bei hohe Lautstärken zu sortieren, Sortieren von Zellen zuerst in Kulturmedien ergänzt mit niedrigeren Konzentrationen von FBS, empfiehlt. Unmittelbar nach der Sortierung, Zellen sollten dann pelleted und lysiert für DNA/RNA-Extraktion. Das isolierte genetische Material kann dann veränderten Genexpression profiliert werden. Pro-inflammatorischen Genen einschließlich TNF, IL1-β, IL-6, IL-12, 1L-23, IFNγ, Nos2 und MCP1 (CCL2) sind oft hochreguliert in Makrophagen eine klassisch aktivierte (M1) Phänotyp39ausstellen. Auf der anderen Seite Alternativ aktivierten (M2)-Phänotyp in Makrophagen zeichnet sich oft durch Induktion von Genen Codierung Chi3l3 (Ym1), Fizz1, Arginase 1, CD206, CD163, CD209 1L-10 und TGFβ34,40. Vor kurzem wurden CD38, Fpr2 und Gpr18 als M1-spezifischen Gene und c-Myc und Egr2 als M2-spezifischen Genen34validiert.

Obwohl Multi-Color Flow Cytometry-basierte Zellsortierung ein wertvolles Werkzeug für die Isolierung von Makrophagen in hoher Reinheit ist, kann dieser Ansatz kostspielig sein. Leistungsstarke Vorteile der FACS vermittelte Sortierung sind abhängig von Betriebspersonal, die einen Zelle Sorter zusätzlich zu den hohen Kosten der Zelle Sorter Wartung Reagenzien manövrieren können. Alternative Ansätze können in Ersatz für teure Flow Cytometry basierte Zellsortierung verwendet werden. Dazu gehören magnetisch aktivierte Zelle sortieren (MACS) oder Dichte-Gradienten-Zentrifugierung. Die erste alternative Zelle Sortierung Methode erwähnt umfasst magnetische und/oder Microbead Spalte Isolierung Kits, Zellen des Interesses von Blut oder festen Geweben41zu trennen. Die zweite Zelle sortieren Ansatz trennt eine heterogene Zellsuspension basierend auf Dichte und Kraft der Zentrifugation. Leider, Dichte vermittelte Zentrifugation ist nicht praktisch für die Isolierung von Makrophagen aus einzelnen Zellsuspensionen Aorta oder WAT abgeleitet. Oft das Produkt aus differentielle Zentrifugation ist verseucht, und der geringen Ausbeute. Infolgedessen sind kleinere Gewebe (z. B. Aorta oder WAT), die in einigen Zellen zunächst nach enzymatische Verdauung führen nicht ideale Kandidaten für differentielle Zentrifugation. Auf der anderen Seite können Zellsuspensionen von dissoziierten Lebern abgeleitet eine ausreichende Anzahl von sortierten Makrophagen produzieren, die in Post Art Experimente und Analysen wie Kultur Stimulationen, qPCR oder western Blot Analyse verwendet werden können. Diese alternativen Ansätze können auch zur Bevölkerung vor FACS, zulassend sauberere Art bereichern. Der Hinweis bilden Gewebe resident Makrophagen ein kleiner Prozentsatz der gesamten Zellpopulation in WAT, Leber und der Aorta. Anreicherung der Zellen vor FACS Sortierung wurde ein Ansatz verwendet, wenn die Bevölkerungen der Zelle zu isolieren, die weniger häufig sind. Eine Frage, die häufig in kleinen Populationen zu isolieren ist die große Zelle Zahlen verarbeitet werden müssen, um genügend Zellen für die spätere Analyse zu erhalten. Bereicherung oder Vorsortierung kann verwendet werden, um so ein Problem zu lösen. Diese Methode hilft bei der Beschaffung einer prägnanten Bevölkerung der Zellen durch positive und negative Selektion, sondern erlaubt es auch Erhaltung der Zeit wie FACS Sortierung einen dauerhaften Prozess für dichtes Gewebe Quellen wie der Leber sein kann.

Jüngste Fortschritte in der Entzündung Biologie betonen die Bedeutung der phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Makrophagen Heterogenität fördern das Verständnis für die komplexe Rolle diese Immunzellen bei der Regulierung der chronischen Entzündung. Kurz gesagt, bietet dieses umfassende Protokoll einen mehrdimensionalen Ansatz zur Charakterisierung Gewebe residente Makrophagen aus drei Markenzeichen Geweben in etablierten Diät induzierten Adipositas und Entzündung Modelle untersucht. Noch wichtiger ist dieses Protokoll berücksichtigt die Schwierigkeit und die erforderlichen Maßnahmen, um sauber isolieren einzelner Zellsuspensionen von Dysregulated Geweben wie WAT, Aorten-Plaques und fetthaltige Leber entzündet. Das Protokoll ermöglicht die Forscherin zuzutreffen Durchflusszytometrie und FACS Sortiertools in eine innovative Dimension resident Gewebe Makrophagen, wichtige Regulatoren der Entzündung bei Adipositas zu charakterisieren. Ausführliche Charakterisierung von Makrophagen Populationsdynamik kann Einblick in Monocyte Handel mit entzündetem Gewebe und anhaltende mechanistischen Auswertungen durch eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen auf sortierte Makrophagen ermöglichen. Weitere Charakterisierung von Makrophagen Populationen bieten einen zentralen Einblick in die biologischen Grundlagen, die Makrophagen Heterogenität in Gesundheit und Krankheit zu regulieren.

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Disclosures

Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir möchten den Flow Cytometry Core Facility in The Pennsylvania State University Millennium Science Complex danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
26 G x 5/8 in Needles BD 305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set BD 367297 Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles BD 305156
1 mL syringe with rubber stops BD 309659
10 mL Syringes BD 309604
1 mL Syringe BD 309659
F4/80 PE Biolegend 123110
CD11c PE/Cy7 Biolegend 117318
CD11b PE/Cy5 eBioscience 15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block  Biolegend 101320
CD45 Pacific Blue Biolegend 103126
PE Rat IgG2a Biolegend 400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG Biolegend 400922
PE/Cy5 Rat IgG2b Biolegend 400610
Pacific Blue Rat IgG2c Biolegend 400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)  Cellgro 15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS) Cellgro 21-031-CV
70 μm cell strainers Corning, Inc. 352350
1.7 mL microcentrifuge tube  Denville C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x Electron Microscopy Sciences CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp  Stoelting 52132-10P Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm Stoelting 52102-37P  Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge  Fine Science Tool 15000-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps Fine Science Tool 11297-10 Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved) Fine Science Tool 13021-12
Heparin Sodium Salt Fischer Scientific 9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes Fischer Scientific 12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid Fischer Scientific 08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene) Fischer Scientific 14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes  Fischer Scientific 14-959-5
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-Products 100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous) Millipore EX0285-1
Bovine Serum Albumin Rockland BSA-50
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885
Collagenasse Type XI Sigma-Aldrich C7657
Hyaluronidase Type I Sigma-Aldrich H3506
DNAse Sigma-Aldrich DN25
Collagenase Type I Sigma-Aldrich C0130
NaOH Sigma Aldrich 1310-73-2 
CaCl2 Sigma Aldrich 449709-10G
500 mL beaker  Sigma Aldrich 02-540M
4 cm Hemostatic clamp Stoelting 52120-40
Toothed forceps Stoelting 52104-33P
50 μm Disposable filters Systemex 04-0042-2317
Collagenase Type IV ThermoFischer Scientific 17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK) ThermoFischer Scientific  A1049201
Razors (0.22 mm (0.009")) VWR International 55411-050
Texas Red Live/Dead stain Red viability stain (in Figure 1A)

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Immunologie Ausgabe 122 Adipositas Diät-induzierten Entzündung Makrophagen enzymatische Gewebe Verdauung Zellsortierung einzelne Zellsuspension monoklonale Antikörper FACS Leber Perfusion Aorta Verdauung Fettgewebe Verdauung
Isolierung, Charakterisierung und Reinigung der Makrophagen aus den Geweben von Fettleibigkeit bedingte Entzündung betroffen
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