Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

Published: May 16, 2017 doi: 10.3791/55448
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 2, 1, 1
1Department of Structural Biochemistry, Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Texas Medical School at Houston

Summary

Dette papiret presenterer en protokoll for behandling av kryo-EM-bilder ved hjelp av programvarepakken SPHIRE. Den nåværende protokollen kan brukes for nesten alle single-partikkel-EM-prosjekter som retter seg mot nær-atomoppløsning.

Abstract

SPHIRE (SPARX for høyoppløselig elektronmikroskopi) er en ny åpen kildekode, brukervennlig programvarepakke for halvautomatisert behandling av enkeltpartikkel-elektronkryo-mikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen som presenteres her, beskriver i detalj hvordan man oppnår en nær-atomoppløsningsstruktur som starter fra cryo-EM mikrograph-filmer ved å lede brukerne gjennom alle trinnene i enkeltpartikkelstrukturbestemmelsesrørledningen. Disse trinnene styres fra det nye grafiske brukergrensesnittet SPHIRE og krever minimum brukerintervensjon. Ved bruk av denne protokollen ble en 3,5 Å-struktur av TcdA1, et Tc- toksinkompleks fra Photorhabdus luminescens , avledet fra bare 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinjeformede tilnærmingen vil hjelpe nybegynnere uten omfattende behandlingserfaring og a priori strukturell informasjon for å oppnå støyfrie og upartiske atommodeller av deres rensede makromolekylære komplekser i deres opprinnelige tilstand.

Introduction

Etter utviklingen av direkte elektrondetektorteknologien omformes den bemerkelsesverdige fremdriften i single particle cryo-EM for tiden strukturell biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi krever denne teknikken kun en liten mengde proteinmateriale uten behov for krystallisering, samtidig som det stilles færre restriksjoner på renhet av prøven og fortsatt tillater bestemmelse av strukturer ved næratomisk oppløsning. Viktig er at forskjellige komposisjoner eller tilstander nå kan beregnes separat og strukturbestemmelse av de forskjellige konformasjoner kan utføres på enestående detaljnivå. Nylig kunne tetthetskart av utfordrende molekyler bli produsert ved oppløsninger som tillater de novo modellbygging og dermed dyp forståelse av deres virkemåte 2 , 3 , 4 , 5.

Et bredt utvalg av programvare for bildebehandling er tilgjengelig i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfunnet (https://no.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste av dem er under kontinuerlig utvikling. Nær-atomoppløsning er oppnådd for proteiner som har forskjellige molekylvekter og symmetrier med flere forskjellige programvarepakker, inkludert EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke krever et annet nivå av brukerkompetanse og gir et annet nivå av brukerveiledning, automatisering og utvidbarhet. Dessuten, mens noen programmer gir komplette miljøer for å lette alle trinnene i bildeanalyse, er andre designet for å optimalisere bestemte oppgaver, for eksempel forfining av justeringsparametere som starter fra en kjent rEference struktur. I nyere tid har flere plattformer blitt utviklet, inkludert APPION 12 og SCIPION 13 , som gir en enkeltbehandlingsrørledning som integrerer tilnærminger og protokoller fra de forskjellige programvarepakker som er oppført ovenfor.

For å bidra til den nåværende utviklingen av cryo-EM, ble SPARX videreutviklet til en ny frittstående og komplett plattform for enkeltpartikkelanalyse, kalt SPHIRE (SPARX for High Resolution Electron Microscopy). For å øke tilgjengeligheten av teknikken til nye forskere på feltet og å takle den store mengden data produsert av moderne fullautomatiserte high-end elektronmikroskoper, ble prosesseringsrøret redesignet og forenklet ved å introdusere en brukervennlig Grafisk brukergrensesnitt (GUI) og automatisering av de viktigste trinnene i arbeidsflyten. Videre ble nye algoritmer tilsatt for å tillate rask, reproduserbar og automatisert strukturbestemmelse fra crYo-EM bilder. Videre ble validering ved reproduserbarhet introdusert for å unngå vanlige artefakter produsert under raffinering og heterogenitetsanalyse.

Selv om programmet var omfattende endret, ble de verdsatt kjernefunksjonene opprettholdt: rettferdig åpen kildekode, det moderne objektorientert design og Python-grensesnitt for alle grunnleggende funksjoner. Dermed ble det ikke endret til et svart boks program, slik at brukerne kan studere og enkelt endre Python-koden, for å lage flere applikasjoner eller endre den samlede arbeidsflyten. Dette er spesielt nyttig for ikke-standardiserte kryo-EM-prosjekter.

Her presenterer vi en protokoll for å skaffe et nær-atom-oppløsningstetthetskart fra cryo-EM-bilder ved hjelp av SPI-GUI. Det beskriver i detalj alle trinn som kreves for å generere et tetthetskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilmer og er ikke begrenset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokollen skal primært veilede newcOmers i feltet gjennom arbeidsflyten og gi viktig informasjon om viktige trinn i behandlingen, samt noen av de mulige fallgruvene og hindringene. Mer avanserte funksjoner og den teoretiske bakgrunnen bak SPHIRE vil bli beskrevet andre steder.

Protocol

MERK: For å følge denne protokollen er det nødvendig å installere SPHIRE riktig på et system med en MPI-installasjon (for øyeblikket en Linux-klynge). Last ned SPHIRE og TcdA1 datasettet fra http://www.sphire.mpg.de og følg installeringsinstruksjonene: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Denne prosedyren installerer også EMAN2. SPHIRE bruker for tiden EMAN2s e2boxer til partikkelvalg og e2display for visning av bildefiler. For dosevektet bevegelseskorreksjon av de rå mikrograffilmene bruker SPHIRE unblur 14 . Last ned programmet og følg installeringsinstruksjonene (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff lab). For interaktiv visualisering av de resulterende strukturer, vil protokollen bruke det molekylære grafikkprogrammet Chimera 15 (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). En fin opplæring for å bli kjent med funksjonene som brukes i denne protokollen, kan være fouNd her: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Instruksjoner for hvordan du sender inn en parallell jobb til en klynge fra SPHIRE GUI, finner du her: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. Den overordnede organisasjonen av SPHIRE GUI og de viktigste trinnene i arbeidsflyten utført gjennom denne protokollen er illustrert i figur 1 .

1. PROJEKT: Still inn konstante parameterverdier for dette prosjektet

  1. Start SPHIRE GUI-programmet ved å skrive " spire &" og ENTER-tasten i et terminalvindu .
  2. Juster de hele prosjektparametrene ( f.eks. Pikselstørrelse, partikkeldiameter og symmetri) i de respektive inntastingsfeltene på prosjektinnstillingssiden, og registrer deretter disse verdiene for alle påfølgende trinn i arbeidsflyten.
    1. Klikk på "PROJECT" -ikonet nederst til høyre i venstre panel for å åpne prosjektinnstillingssiden.
      2. f.eks. Hvis en partikkel er 200 Å lang og pikselstørrelsen er 1,2 Å / piksel, så er partikkelens lengste akse 200 / 1,2 = ~ 166 piksler og radius 166/2 = 83 piksler).
    2. Sett "Partikkelboksstørrelse" til minst 1,5 ganger partikkelstørrelsen. Unngå vindusstørrelser som inneholder stort hovednummer. Husk også at 3D-raffinementalgoritmen krever en jevn nummerert boksestørrelse.
      MERK: Vinduet bør inkludere en margin for å ta hensyn til initial senterfeil som skyldes plukkingen (behovet for å skifte partikler i vinduet) og for tilstrekkelig bakgrunnsregion utenfor partikkelgrensen for en riktig CTF-korreksjon (spesielt viktig for store defokusverdier
    3. Sett "CTF vindu størrelse" til "av partikkel boks størrelse". For prosjekter med lav kontrastdata, bruk et større vindu for å oppnå jevnere estimater av effektspekter.
    4. Sett "Point-group symmetri" av komplekset ( f.eks. "C5"). Hvis symmetrien til målstrukturen ikke er kjent, la den stå på "C1" (asymmetrisk). Hvis imidlertid en bestemt høyordenssymmetri blir identifisert senere under behandlingen, endrer du denne symmetriinnstillingen tilsvarende og gjentar trinnene etter 2D-justering med ISAC.
    5. Sett "Proteinmolekylmasse" i kDa (omtrentlig verdi vil være tilstrekkelig). Trykk på "Registrer innstillinger" -knappen.

2. MOVIE: Juster rammene til hver filmmikrograf for å korrigere den samlede bevegelsen av prøven

  1. For alle filmmikrografer, beregne x / y-skiftene for alle rammer, og opprett deretter deres dosevektede og dosevektede moKorrigert gjennomsnitt (se Diskusjon). Merk at den førstnevnte er nødvendig bare for CTF-estimeringen fordi estimeringen ikke virker bra med de doseveide gjennomsnittene mens sistnevnte brukes for alle de andre trinnene i strukturbestemmelsen.
    1. Klikk på "MOVIE" -ikonet og deretter "Micrograph Movie Alignment" -knappen. Sett "Unblur executable path" ved å velge den kjørbare filen. Sett "Input micrograph path pattern" ved å velge en rå, ujustert filmmikrograph og erstatte den variable delen av filnavnene med wildcard "*" ( f.eks. TcdA1 _ *. Mrc). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Sett "Summovie kjørbar bane" ved å velge den kjørbare filen.
    3. Sett "Antall filmbilder" til antall bilder i hver filmmikrograf. Still inn "Mikroskopespenning" og "Eksponering per ramme" til verdiene som brukes ved datainnsamling. (For eksempelLe, hvis den totale dosen er 60 e / / 2 med 20 bilder registrert uten forhåndseksponering, er eksponeringen for hver ramme 60/20 = 3 e / A 2. ) Trykk på "Run Command" -knappen for å justere Rammer av hver film mikrografi.
      MERK: Dette vil automatisk lage to utgangskataloger som inneholder henholdsvis dosis uvektet og dosevektet bevegelsesrettet gjennomsnittlig mikrograf.

3. CTER: Estimere defokus- og astigmatismeparametrene til CTF

  1. Estimere CTF parametrene (defokus og astigmatisme, de andre er satt av brukeren) for hver dose-uvektet gjennomsnittlig mikrografi.
    1. Klikk på "CTER" -ikonet og deretter på "CTF Estimation" -knappen. For å angi "Input micrograph path pattern", velg en dose uvevet bevegelsesrettet mikrograph, og erstatt deretter den variable delen av filnavnene med jokertegnet"*". Angi også banen for "Output-katalog".
    2. Sett "Amplitudkontrast" til verdien som brukes rutinemessig for typen data (istykkelse er en viktig faktor) og mikroskopspenning i laboratoriet ( f.eks. 10%). Typiske verdier er i 7-14% -området 17 .
    3. Sett "Mikroskop sfærisk aberrasjon (Cs)" og "Mikroskop spenning" som brukes under datainnsamling.
    4. Still inn "Laveste frekvens" og "Høyeste frekvens" av søkeområdet for CTF-modellmontering til henholdsvis 0,0285 og 0,285 Å -1 (40-4 Å). Trykk på "Kjør kommando" knappen for å estimere CTF parametrene.
      MERK: CTF-parametrene lagres automatisk i partres.txt-filen i den angitte utgangskatalogen. CTF-estimeringen av de 112 mikrografene ble beregnet på 96 kjerner og ferdig etter ~ 3 min på Linux-klyngen som ble brukt til å oppnå de representative resultatene.

4. VINDU: Ekstra partikler fra de dosevektede gjennomsnittlige mikrografer

  1. Velg partikler manuelt eller automatisk fra mikrografer med e2boxer 6 og opprett koordinatfiler, som hver inneholder en liste over partikkel xy-koordinater i tilhørende mikrografi.
    1. Klikk på "WINDOW" -ikonet og deretter på "Particle Picking" -knappen. Trykk på "Kjør kommando" -knappen for å starte e2boxer 6 og velg partiklene for hver mikrograph manuelt eller automatisk 18 (se Diskusjon ). Oppbevar de endelige partikkelkoordinatene for hver mikrografi i EMAN1 filformat (.box). Alternativt kan du importere koordinatfiler fra andre programmer etter å ha konvertert dem til EMAN1-formatet.
  2. Opprett partikkelstabler ved å ekstrahere partikkelbilder fra de doseveide mikrografer (i SPHIRE er partikkelbunken ofteEn kalles bare "stack").
    1. Trykk på "Particle Extraction" -knappen. Spesifiser "Input micrograph path pattern" ved å velge en dosevektet bevegelsesrettet mikrograph og deretter erstatte den variable delen av filnavnene med jokertegnet "*" ( f.eks. TcdA1 _ *. Mrc). Tilsvarende angir du "Input coordinates path pattern" ved å velge en koordinatfil ( f.eks. TcdA1 _ *. Boks). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Sett "CTF parametere kilde" ved å velge CTF parameter fil (partres.txt produsert i trinn 3.1). Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.
  3. Kombiner de ekstraherte partikkelbildestablene i en enkelt.
    1. Klikk på "Partikkel Stack" -knappen. Angi banen til "Output virtual image stack" ved hjelp av et BDB filbaneformat ( f.eks. "Bdb: Particles / stack", der "Partikler" peker tilE-katalogen som inneholder en BDB-databasekatalog hvor navnet alltid er EMAN2DB og "stabel" refererer til en bestemt bildestabel i denne databasen). Angi "Input BDB image stack pattern" ved å velge en katalog som starter med "mpi_proc" og deretter erstatte den variable delen av katalognavnet med wildcard "*" ( f.eks. Partikler / mpi_proc_000 til Particles / mpi_proc_ *). Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.

5. ISAC: Klassifisering av partikkelbilder i 2D

  1. Beregn 2D klasse gjennomsnitt ved å justere partikler og klare dem i henhold til deres 2D utseende.
    MERK: De resulterende 2D-gjennomsnittene har et forbedret signal-støyforhold (SNR) sammenlignet med de enkelte partikkelbilder, og brukes dermed til å visuelt vurdere kvaliteten og heterogeniteten til datasettet, samt å sortere ut uønskede bilder fra stakken ( F.eks. Iskrystaller, karbonkanter,Aggregater, fragmenter og etc. ) 19 . Videre vil de senere bli brukt til å bestemme en innledende 3D-modell.
    1. Klikk på "ISAC" -ikonet og deretter på "ISAC - 2D Clustering" -knappen. Sett "Input image stack" ved å velge stakkfilen som inneholder de ekstraherte partiklene. Angi banen for "Output-katalog".
    2. Bruk 200 - 1000 for "Bilder per klasse". Velg riktig tall med tanke på forventet antall 2D-klasser (totalt antall partikler dividert med antall bilder per klasse). Juster denne parameteren avhengig av SNR og størrelsen på datasettet. Øk antall medlemmer per klasse dersom datasettet er for mye støy. Reduser tallet når et lavt antall partikler er tilgjengelig.
      MERK: På grunn av minnebegrensninger, for ganske store datasett (> 100 000 partikler), del opp hele datasettet i delsett, utfør ISAC for hvert delsett uavhengig, og kombinerResultatene på slutten. Detaljert instruks for dette behandlingsscenariet er gitt på http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php.
    3. Sjekk avkrysningsruten "Fase-flip". Oppbevar standardverdiene for "Målpartikkelradius" og "Mål partikkeldimensjonsstørrelse" for å øke hastigheten på prosessen ved automatisk å krympe alle partikkelbilder med disse innstillingene. Trykk på "Kjør kommandoen" knappen for å beregne 2D klasse gjennomsnitt.
      MERK: Dette trinnet er beregnende krevende og kjøretiden øker betydelig med antall partikler og klasser, samt målradius og bildestørrelse. På en klynge med 96 prosesser ble 2D-klassifiseringen av ~ 10.000 partikler ferdig etter ca 90 minutter.
  2. Vis og visuelt inspiser de resulterende ISAC 2D-gjennomsnittene for å sikre at kvaliteten er tilfredsstillende (se Diskusjon).
    1. Trykk på "Display Data" knappen under "UTILITIES". Sett "; Input-filer "ved å velge filen som inneholder ISAC 2D-gjennomsnittene (class_averages.hdf produsert i trinn 5.1). Trykk på" Kjør kommandoen "-knappen for å vise de endelige reproduserbare og validerte klassemidlene levert av ISAC.
  3. Opprett en ny stabel, inkludert kun partikkelmedlemmene i de validerte klassemidlene.
    1. Trykk på "Create Stack Subset" -knappen. Angi "Input image stack" ved å velge den samme stakkfilen som i trinn 5.1.1. Angi "ISAC-gjennomsnitt" ved å velge ISAC 2D-gjennomsnittene (class_averages.hdf produsert i trinn 5.1). Angi banen for "Output-katalog". Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.

6. VIPER: Beregn en innledende 3D-modell

  1. Velg et lite sett av klassens gjennomsnitt (≥100 bilder) ved å slette alle dårlige klasse gjennomsnitt og identiske syn på partikkelen (se Diskusjon) og bruk dem til å beregne en representantRoducible første modell ved hjelp av VIPER. Husk at valget skal inneholde minst 60-80 høykvalitets gjennomsnitt med ~ 200-500 medlemmer hver.
    1. Klikk på "VIPER" -ikonet og deretter "Display Data" -knappen. Angi "Input-filer" ved å velge ISAC 2D-gjennomsnittene (class_averages.hdf produsert i trinn 5.1). Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.
    2. Trykk på musens midtre knapp et eller annet sted i grafikkvinduet på e2displayet, og aktiver "DEL" -knappen i popup-vinduet. Slett alle dårlige klasse gjennomsnitt og identiske syn på partikkelen (se Diskusjon ). Trykk på "Save" -knappen for å lagre de gjenværende 2D-klassens gjennomsnitt til en ny fil.
  2. Fra de valgte ISAC-gjennomsnittene, generer en initial referanse for den etterfølgende 3D-raffinement.
    1. Klikk på "Initial 3D Model - RVIPER" -knappen. Sett "Input images stack" ved å velge den skjermede klassenGjennomsnitt (produsert i trinn 6.1). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Pass på at du bruker samme verdi for "Mål partikkeldiameter" som ISAC trinn 5.1.3. Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen for å generere en reproduserbar ab initio 3D-modell.
      MERK: Dette trinnet er beregnende krevende og kjøretiden øker betydelig med antall gjennomsnitt og størrelse på partiklene. På en klynge med 96 prosesser ble denne jobben (~ 100 klasse gjennomsnitt) ferdig etter ~ 15 min.
  3. Sjekk om den resulterende 3D-modellen er rimelig ved å ta hensyn til klassens gjennomsnitt og i tillegg dens strukturelle integritet ( dvs. ingen frakoblede deler og / eller retningsartefakter). For å vise kartet, bruk programmet Chimera 15 . På dette tidspunkt, utfør en første sammenligning med en krystallstruktur av et homologt protein eller et domene av proteinet av interesse hvis det eksisterer (et eksempel er vist i avsnittet RepreseNtative resultater).
  4. For den etterfølgende 3D-raffinementen, generer du en innledende 3D-referanse og en 3D-maske fra en ab initio 3D-modell ved å fjerne den omgivende støyen og rescaling den for å matche den opprinnelige pixelstørrelsen.
    1. Klikk på "Create 3D Reference" -knappen. Angi "Input Volume" ved å velge ab initio 3D-modellen (average_volume.hdf produsert i trinn 6.2). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Sett "Resample Ratio Source" ved å velge ISAC-krympforholdsfilen (README_shrink_ratio.txt produsert i trinn 5.1). Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.

7. MERIDIEN: Forbedre den innledende 3D-volumet

  1. Forbedre 3D-volumet fra begynnelsen av 3D-modellen.
    1. Klikk på "MERIDIEN" ikonet, og deretter "3D Refinement" knappen. Sett "Input image stack" og "Initial 3D reference" av seleCting partikkelbunken og ab initio 3D-modellen (produsert i henholdsvis trinn 5.3 og 6.4). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Sett "3D-maske" ved å velge 3D-maskefilen (produsert i trinn 6.4). Bruk alltid en 3D-maske, men spesielt i et tidlig stadium av analyse, bruk en sfærisk maske eller en mykkantet maske som er løst tilpasset referansen for å unngå å innføre forkastelse av feil maskering.
    3. Merk av i boksen "Bruk hard 2D maske". Sett "Startoppløsning" til en cutoff-frekvensverdi mellom 20 - 25 Å. Husk at et lavpassfilter med denne cutofffrekvensen vil bli brukt på den innledende 3D-strukturen for å redusere innledende modellforspenning.
    4. Kontroller spesifikasjonene for klyngen som brukes til denne prosessen, og sett deretter "Minne per node" til tilgjengelig minne i gigabyte. Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen for å finjustere 3D-volumet fra den første 3D-modellen på en fullstendig automatisert måte.
  2. Opprett en myk-edged 3D-maske fra det raffinerte volumet for det etterfølgende skarphetrinnet.
    1. Klikk på knappen "Adaptive 3D Mask". Angi "Input Volume" ved å velge en av de ufiltrerte halvvolumene (produsert i trinn 7.1). Angi banen for "Output mask".
    2. Angi en verdi av "Binarization threshold". Bruk chimera for å sikre at ved denne spesielle terskelen er støyen klart utenfor volumet av interesse i løsningsområdet av de ufiltrerte halvkartene, og alle densiteter av proteinet er fortsatt cUnnviktet mot hverandre. Trykk på "Kjør kommando" -knappen for å lage 3D-masken i bløtkanten.
      MERK: Hovedkroppen til den resulterende masken (bestående av voxeller hvis verdier er> 0,5) bør passe partikkelstrukturen tett, men dekker fortsatt alle tetthetene av interesse. Bløtkanten faller av skal være minst 8-10 piksler bred.
  3. Slå sammen de to ufiltrerte halvvolumene oppnådd ved 3D-raffinement. Deretter skjermer du det sammenslåtte volumet ved å justere effektspekteret basert på modulatoroverføringsfunksjonen (MTF) til detektoren, den estimerte B-faktoren og FSC (Fourier Shell Correlation) estimatet av oppløsningen.
    1. Velg "Skarphet" -knappen. Sett "Første ufiltrert halvvolum" og "Andre ufiltrert halvvolum" ved å velge de tilsvarende filene (vol_0_unfil.hdf og vol_1_unfil.hdf produsert i trinn 7.1). Bruk alltid "B-faktor ekstrautstyr". Vanligvis behold standardverdien for å eSkjerm B-faktorverdien fra inngangsdatasettet ved hjelp av området mellom sluttoppløsningsfrekvensen og 10 Å. Du kan også angi en ad hoc- verdi ( f.eks. -100).
    2. Hold standardverdien for "Lavpassfilterfrekvens" for å bruke et FSC-basert filter.
    3. Sett "Bruker-utstyrt maske" ved å velge 3D-masken (produsert i trinn 7.2). Husk at den rapporterte oppløsningen vil bli bestemt ved hjelp av FSC med denne masken. Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen for å skarpere det raffinerte 3D-volumet.
  4. Generer 3D-vinkeldistribusjonskartet fra projeksjonsretningene til alle partiklene estimert ved 3D-raffineringstrinnet ovenfor.
    1. Klikk på "Angular Distribution" -knappen. Sett "Justeringsparameterfil" ved å velge filen (final_params.txt produsert i trinn 7.1), og trykk på "Kjør kommando" -knappen.
  5. Visuelt inspiser den skarpe 3D-modellen ved hjelp av Chimera. Sørg for at strukturen ser rimelig ut i forhold til den oppnådde oppløsningen (se Diskusjon ).
  6. Visuelt inspiser vinkelfordelingen ved bruk av Chimera. Kontroller at distribusjonen dekker omtrent jevnt hele 3D-vinkelen. Husk at for symmetriske strukturer er distribusjonen begrenset innenfor den unike asymmetriske trekanten.

8. SORT3D: Sorter 3D Heterogenity ved å fokusere på de høyt variable områdene

  1. Beregn 3D-variabilitetskartet fra partikkelbunken som brukes i 3D-raffinementet.
    1. Klikk på "SORT3D" ikonet og deretter "3D Variability Estimation" -knappen. Sett "Input image stack" ved å velge den samme skjermede partikkelbunken som er gitt til 3D-raffinementstrinnet 7.1.1. Angi banen for "Output-katalog".
    2. Hold standardverdien for "Antall projeksjoner".
      MERK: Bildene fra den vinklede naboenHette vil bli brukt til å estimere 2D-variansen ved hver 3D-projeksjonsvinkel. Jo større tallet, jo mindre støyende estimatet, men jo lavere oppløsning og rotasjonsartefakter er mer uttalt.
    3. Merk av i boksen Bruk CTF. Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.
  2. Bruk 3D-variabilitetskartet til å lage en fokusmaske for 3D-klustringstrinnet nedenfor.
    1. Velg "Binary 3D Mask" -knappen. Angi "Input Volume" ved å velge 3D-variabilitetskartet (produsert i trinn 8.1). Angi filbanen for "Output mask".
    2. Sett inn "Binarization threshold" ved å bruke utgangen av "Level" feltet i "Volume Viewer" av Chimera. Trykk på "Kjør kommandoen" -knappen.
  3. Sorter partikkelbilder i homogene strukturelle grupper ved å fokusere på strukturelt svært variable regioner.
    1. Trykk på "3D Clustering - RSORT3D" -knappen.Angi "Input 3D-raffinementskatalog" ved å velge utdatakatalog for 3D-raffinement (produsert i trinn 7.1). Angi banen for "Output-katalog".
    2. Sett "3D-maske" ved å velge den mykgjorte 3D-masken (produsert i trinn 7.2). Sett "Focus 3D mask" ved å velge det binære 3D-variabilitetskartet (produsert i trinn 8.2).
    3. For store datasett, bruk minst 5000 til 5000 for "Bilder per gruppe". Husk at programmet alltid holder antall bilder per gruppe lavere enn denne innstillingen. Juster verdien ved å vurdere det forventede antallet 3D-grupper (totalt antall partikler dividert med verdien "Bilder per gruppe"), datasettet, SNR og graden av heterogenitet. Start med ~ 5-10 innledende 3D-grupper, dersom et tilstrekkelig antall partikler er tilgjengelig, med mindre det forventes et høyere antall forskjellige strukturelle tilstander i datasettet.
    4. Bruk minst 3.000-5.000 partikler for "minste gruppestørrelse".Vær oppmerksom på at programmet vil se bort fra grupper som inneholder et lavere antall bilder enn innstillingen for "minste gruppestørrelse". Trykk på "Kjør kommandoen" knappen for å utføre 3D-clustering.
      MERK: RSORT3D er oppdelt i to trinn. Det første "sort3d" -trinnet utgjør 3D-heterogenitet. Deretter rekonstruerer den volumene til hver homogen strukturell gruppe ved hjelp av 3D-justeringsparametrene bestemt av 3D-raffineringstrinnet ovenfor. Det andre trinnet "rsort3d" finner ut reproduserbare medlemmer av hver gruppe ved å utføre en toveis-sammenligning av de to uavhengige sorteringsrørene. Deretter rekonstruerer den homogene strukturer ved å bruke bare de reproduserbare partiklene. På en klynge med 96 kjerner, ble denne jobben (~ 8 000 partikler, 352 kasse størrelse) ferdig etter ca. 3 timer.
  4. Når programmet er ferdig, bruk Chimera til å velge en homogen 3D-gruppe. Velg strukturen av den høyeste tilsynelatende oppløsningen, vanligvis knyttet til de fleste poPulous gruppe. Kontroller at den valgte strukturen er visuelt rimelig ved å ta hensyn til 2D-klassens gjennomsnitt og biologiske aspekter av proteinet av interesse (se Diskusjon ). Hvis det finnes andre volumer som har en nesten identisk struktur ved tilsvarende oppløsning, betrakt dem som fremvoksende fra en enkelt homogen 3D-gruppe.
  5. Utfør en lokal forfining mot partikkelmedlemmene i den mest homogene 3D-gruppen (med høyeste oppløsning).
    1. Klikk på "Local Subset Refinement" -knappen. Sett "Subset Text File path" ved å velge tekstfilen som inneholder partikkel-IDene til den valgte gruppen ( f.eks. Cluster0.txt produsert i trinn 8.3). Sett "3D-raffinementskatalog" ved å velge utdatakatalogen for den forrige 3D-raffinementet (produsert i trinn 7.1).
    2. Sett "Restart iteration" til den der den høyeste oppløsningen er oppnådd i forrige 3D-raffinement. trykk"Kjør kommando" -knappen for å utføre en lokal forfining av den valgte befolkningen av partikler.
  6. I likhet med trinn 7.2 lager du en myk-edged 3D-maske fra et ufiltrert slutthalvvolum rekonstruert av den lokale delmarginalen.
  7. I likhet med trinn 7.3 slås sammen to ufiltrerte endelige halvvolumer utledet av den lokale subset-raffinement og skjerp det fusjonerte volumet. Du må imidlertid ikke filtrere det skarpe volumet denne gangen.
    MERK: Hvis heterogenitetsanalysen i trinn 8.4 angir flere forskjellige tilstander med sammenlignbar oppløsning, kan det være lurt å forfine alle forskjellige tilstander uavhengig.

9. LOCALRES: Estimere den lokale oppløsningen til den endelige 3D-volumet

  1. Estimere den lokale oppløsningen av 3D-volumet oppnådd fra det homogene partikkelpartiet.
    1. Klikk på "LOCALRES" ikonet og deretter "Local Resolution" knappen. Sett "Første halvvolum" og "Andre halvdel-volum "ved å velge de ufiltrerte endelige halvvolumene av den lokale subset-raffinementet (fremstilt i trinn 8.5). Sett" 3D-maske "ved å velge den mykgjorte 3D-masken som ble produsert i trinn 8.6. Angi filbanen for" Utgangsvolum " .
    2. Hold standardverdien på 7 piksler for "FSC-vinduets størrelse". Husk at denne innstillingen definerer størrelsen på vinduet der lokal-ekte-rom korrelasjonen beregnes; Større vindusstørrelser gir jevnere oppløsningskart på bekostning av lokal oppløsning.
    3. Hold standardverdien 0,5 av "Oppløsningsavbrudd" for oppløsningskriterium.
      MERK: For hver voxel vil programmet rapportere den lokale oppløsningen som frekvensen der den lokale FSC faller under den valgte oppløsningsgrensen. En terskel lavere enn 0,5 anbefales ikke, fordi lavere korrelasjonsverdier har høy statistisk usikkerhet. Derfor vil den tilsvarende lokale oppløsningen variere sterkt mellom voxels.
    4. For "OveraLl oppløsning ", angi den absolutte oppløsningen som er estimert i skjæringen etter den lokale subset-raffinementet (trinn 8.7). Trykk på" Kjør kommandoen "-knappen for å beregne lokal oppløsning av volumet.
  2. Bruk det lokale 3D-filteret til volumet skjerpet etter den lokale delmetningsforbedringen ved å bruke det lokale 3D-oppløsningskartet.
    1. Klikk på "3D Local Filter" -knappen. Angi "Input Volume" ved å velge det skarpe, men ufiltrerte 3D-volumet (produsert i trinn 8.7). Tilsvarende, sett "Local Resolution File" og "3D mask" (produsert i henholdsvis trinn 9.1 og 8.6). Husk at 3D-masken definerer regionen der lokal filtrering skal brukes. Angi filbanen for "Utgangsvolum". Trykk på "Run command" -knappen for å bruke det lokale 3D-filteret.
  3. Bruk Chimera til å visuelt inspisere den endelige 3D-modellen og det lokale 3D-oppløsningskartet (produsert i trinn 9,2 og 9,1, resp.ectively). Velg "Surface color" -alternativet for å fargelegge 3D-volumet i henhold til den lokale oppløsningen. Husk at fordelingen av lokal oppløsning skal være jevn (se Diskusjon ).

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor ble utført ut fra 112 direkte detektorfilmer av A-komponenten i Photorhabdus luminescens Tc-komplekset (TcdA1) 20 , 21 , 22 . Dette datasettet ble registrert på et Cs-korrigert elektronkryo-mikroskop med en høylysstyrkefeltgasspistol (XFEG), som drives ved en akselerasjonsspenning på 300 kV. Bildene ble kjøpt automatisk med en total dose på 60 e - / Å -2 ved en pikselstørrelse på 1,14 Å på prøveskalaen. Etter justering av filmrammer (Protokoll trinn 2 ) hadde de resulterende bevegelseskorrigerte gjennomsnittene isotrope Thon-ringer som strekker seg til høyoppløsningen ( figur 2a ). De enkelte partikler var lett synlige og godt separerte ( figur 2b ). Partikler ble deretter plukket ved hjelp av swarm-verktøyet til e2boxerLass = "xref"> 18 ( protokoll trinn 4.1 ). I dette tilfellet ble det satt en passende terskel ved hjelp av det mer selektive alternativet ( figur 2c ). De 112 digitale mikrografene ga 9.652 partikler. Flertallet av de ekstraherte bildene (Protokoll Trinn 4.2 ) inneholdt veldefinerte partikler og deres boksestørrelse var ~ 1,5 ganger større enn partikkelstørrelsen, som anbefalt ( figur 2d ). Ved bruk av ISAC ble en 2D heterogenitetsanalyse utført (protokoll trinn 5 ). Det ga 98 klasse gjennomsnitt ( figur 3a ). Ved å bruke disse 2D-klassenes gjennomsnitt ble en ab initio- modell beregnet ved hjelp av VIPER (protokoll trinn 6 ) ved mellomoppløsning ( figur 3b ). Denne modellen viser utmerket avtale med krystallstrukturen til TcdA1 som tidligere ble løst ved 3,9 Å oppløsning 22 ( figur 3c ). Denne ab initio- modellen ble brukt som et innledende tema Plate for 3D-raffinement (MERIDIEN), og gir en 3,5 Å (0,143 kriterium) rekonstruksjon (Protokoll Trinn 7 ) fra bare ~ 40.000 asymmetriske enheter ( Figur 4 ). Dette nær-atomoppløsningskartet ble oppnådd innen 24 timer, ved bruk av opptil 96 CPUer for trinnene i arbeidsflyten som drar nytte av flere kjerner.

For 3D-variabilitetsanalysen ( Protokollstrinn 8) ble det bare brukt 2000 partikkelbilder per gruppe i trinn 8.3.3 ( dvs. prosessen starter med 5 innledende 3D-grupper) og 200 bilder for den minste gruppestørrelsen i trinn 8.3.4 på grunn av Det lille antall partikler (~ 10.000). Analysen viste lokalisert fleksibilitet hovedsakelig i den N-terminale regionen i komplekset som inneholder His-merken som ble brukt til rensing ( Figur 5a ). Faktisk ble tolv N-terminale rester og His-taggen ikke løst i den tidligere publiserte krystallstrukturen av TcdA1"> 22 og denne sannsynligvis forstyrrede regionen forblir uløst i den nåværende cryo-EM-tettheten, sannsynligvis på grunn av sin fleksibilitet. Ytterligere variabilitet ble påvist ved reseptorbindende domener og BC-bindingsdomene ( Figur 5a ). Tilfredsstillende oppløsning av strukturen og den relativt små størrelsen på datasettet, ble denne heterogeniteten bestemt til å være tolererbar og derfor ble det ikke utført en fokusert 3D-klassifikasjon 23. Til slutt ble den lokale oppløsningen av det endelige tetthetskartet beregnet (protokoll trinn 9.1, figur 5b ) og det skarpe 3D-kartet ble filtrert lokalt (Protokoll trinn 9.2) . Et volum av denne kvaliteten kan brukes til de novo modellbygging ved hjelp av Coot 24 eller et annet foredlingsverktøy ( figur 6 ).

Figur 1
<Strong> Figur 1: Bildebehandling ved hjelp av SPHIRE. ( A ) GUI i SPHIRE programvarepakken. Et bestemt trinn i arbeidsflyten kan aktiveres ved å velge det respektive piktogrammet på venstre side av GUI ("arbeidsflytstrinn"). Kommandoene og verktøyene som er knyttet til dette trinnet i arbeidsflyten, vises i det sentrale området av GUI. Etter at du har valgt en av kommandoene, vises de respektive parameterne i høyre del av GUI. Avanserte parametere krever vanligvis ikke modifisering av de forhåndsinnstilte standardverdiene. ( B ) Stages i arbeidsflyten av enkeltpartikkel bildebehandling ved hjelp av SPHIRE GUI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Bevegelseskorrigering og partiskLe utvinning. ( A , b ) Typisk høyverdig, lavdosis, drift-rettet digital mikrograph registrert ved en defokus på 1,7 μm. Legg merke til at de isotropiske Thon-ringene strekker seg til en oppløsning på 2,7 Å i effektspekteret (a) og de velkennbare partiklene i 2D-bildet ( b ). ( C ) Partikkelvalg ved bruk av e2boxer. Grønne sirkler indikerer utvalgte partikler. ( D ) Typiske råpartikler ekstrahert fra den doseveide mikrografen. Skalestenger = 20 nm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: 2D Clustering og Initial Model Generation. ( A ) Galleri av 2D klasse gjennomsnitt, med flertallet representant sidevisninger o F partikkelen. Skalbjelke = 20 nm. ( B ) Ab initio 3D-kart over TcdA1 oppnådd ved hjelp av RVIPER fra referansefri klasse gjennomsnitt. ( C ) Kraftig montering av TcdA1-krystallstrukturen (bånd) (pdb-id 1VW1) i den opprinnelige kryo-EM-tettheten (gjennomsiktig grå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4
Figur 4: Cryo-EM 3D struktur av TcdA1. ( A , b ) Endelig 3,5 Å tetthetskart over TcdA1 beregnet ved bruk av ~ 9 500 partikkelbilder: ( a ) side og ( b ) toppvisning. ( C ) Representative områder av kryo-EM-tettheten for en a-helix og en p-ark.Arge.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5
Figur 5: Variabilitetsanalyse og lokal oppløsning. ( A ) Overflaten på det skarpe TcdA1 cryo-EM-kartet (grått) og variabilitetskartet (grønt). For bedre klarhet ble variabilitetskortet lavpassfiltrert til 30 Å. ( B ) Overflatefjernelse av TcdA1-skarpt kryo-EM-kart farget i henhold til lokal oppløsning (Å). Legg merke til den topologiske avtalen mellom områder med stor variasjon og lav lokal oppløsning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6
Figur 6: 3D ModEl Bygning av TcdA1 ved hjelp av Coot. Representative regioner av kryo-EM-tettheten og atommodellen er vist for en a-helix. Atommodellen ble bygget de novo ved hjelp av Coot. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Enkeltpartikkel-kryo-EM har vist en rask utvikling i de senere år og levert mange atomoppløsningsstrukturer av makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For å støtte det store antallet nybegynnere som går inn i feltet, utviklet vi single-particle image analyse plattformen SPHIRE og presenterer her en gjennomgående protokoll for hele arbeidsflyten, inkludert filmjustering, partikkel plukking, CTF estimering, innledende modell Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, 3D-raffinement med høy oppløsning og lokal oppløsning estimering og filtrering.

Protokollen beskrevet her er ment som en kort guide til 3D-strukturbestemmelse ved bruk av cryo-EM mikrografer av proteinet av interesse og ved hjelp av beregningsverktøy som tilbys av det frittstående GUI av SPHIRE.

Hovedtrekk i arbeidsflyten er det mestAv prosedyrene må bare kjøres én gang, siden de stoler på konseptet om validering ved reproduserbarhet 19 og krever ingen parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanismen er en hovedfordel for SPHIRE over andre programvarepakker, siden resultatene pleier å være objektive samt reproduserbare og, viktigst, oppnåelig ved en akseptabel beregningskostnad. Rørledningen gir i tillegg et vell av diagnostisk informasjon for erfarne brukere å gjennomføre ytterligere uavhengig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynner som har minst elementær teoretisk bakgrunn i strukturell biologi og elektronmikroskopi, kunne oppnå nær-atomoppløsningskonstruksjoner ved å bruke egne data og de automatiserte valideringsprosedyrene.

Imidlertid er det ikke alltid lett å skaffe seg en nær-atomoppløsningskonstruksjon, og resultatet vil høyt avhenge av kvaliteten på prøven og inngangsdataeten. For prosedyrene som presenteres her antas det at et tilstrekkelig antall ujevnede rå EM-filmer av høy kvalitet er tilgjengelige, med gjennomsnitt som viser tydelig merkbare homogene og tilfeldig orienterte enkeltpartikler. Generelt er det ingen begrensninger for molekylets symmetri, størrelse eller overordnede form, men en lavmolekylvekt kan være en begrensende faktor, spesielt når proteinet har en featurløs kuleform. Vanligvis er analyse av større, velordnede partikler med høypunkts-gruppesymmetri mindre krevende. Derfor anbefales det sterkt for nybegynnere å kjøre dagens protokoll først med et godt karakterisert cryo-EM datasett. Enten SPHIRE opplæringsdataene (http: /sphire.mpg.de) eller et av EMPIAR-innsendte datasettene (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilmer er et godt utgangspunkt .

Når du behandler egne data, er det svært sannsynlig at enkelte datasett eller noen av bildene ikke tilfredsstiller visse kvalifikasjonerTy kriterier. I tillegg til dette, i tillegg til de automatiserte stabilitets- og reproduserbarhetskontrollene som utføres av programmet for de viktigste trinnene i arbeidsflyten, anbefales det fortsatt at brukerne visuelt inspiserer resultatene ved bestemte "kontrollpunkter" i protokollen, spesielt hvis den endelige rekonstruksjonen Er ikke tilfredsstillende.

Den første visuelle inspeksjonen kan gjøres på mikrografnivået etter filmjusteringen (protokoll trinn 2 ) og CTF estimeringen (protokoll trinn 3 ). De resulterende bevegelseskorrigerte gjennomsnitt skal vise klart merkbare og velskilte partikler, og deres effektspekter skal vise tydelige, isotrope Thon-ringer. Den romlige frekvensen som de er synlige, definerer i de fleste tilfeller den høyeste oppløsningen som strukturen i utgangspunktet kan bestemmes til slutt. Eksempler på et bevegelseskorrigert gjennomsnitt av tilstrekkelig kvalitet og dens strømspektrum er vist i avsnittet & #34; Representative resultater. "Outlier bilder som kan ha en negativ innvirkning på sluttresultatet, kan fjernes ved hjelp av SPHIREs GUI-verktøy for drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).

Med hensyn til partikkelscreening er det avgjørende trinnet i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifiseringen ved bruk av ISAC (protokoll trinn 5.2) . Her skal brukeren kontrollere at de reproduserbare 2D-klassens gjennomsnitt identifiseres automatisk ved at programmet vedtar en rekke retninger som er tilstrekkelig til å kvasjevikt dekke vinkelrommet. Hvis kvaliteten på klassenes gjennomsnitt ikke er tilfredsstillende (støyende og / eller uskarpe bilder) og / eller antall reproduserbare klasse gjennomsnitt er svært lav, bør du vurdere å forbedre automatisk plukkingskvalitet, optimalisere datasettbilder eller prøvepreparering. I de fleste tilfeller er det ikke mulig å beregne en pålitelig rekonstruksjon fra et datasett som ikke gir gode 2D klasse gjennomsnitt. Eksempler på høy kvalitet 2D klasse aveRaser er vist i avsnittet "Representative resultater".

Det kreves minst 100 klassemidlere for å oppnå en pålitelig innledende 3D-modell ved hjelp av RVIPER på en automatisk måte (protokoll trinn 6.1 ). For dette trinnet bør brukeren velge gjennomsnittet med høyeste kvalitet og inkludere så mange forskjellige orienteringer av partikkelen som mulig. Kvaliteten på den innledende modellen er kritisk for suksessen til den etterfølgende 3D-raffinement med høy oppløsning.

I andre programvarepakker utføres noen ganger 3D-klassifisering for å fjerne "dårlige" partikler 8 , 9 . Imidlertid i SPHIRE elimineres de fleste av disse partiklene automatisk allerede under 2D-klassifisering ved bruk av ISAC. Det anbefales derfor å utføre det beregningsintensive trinnet med 3D-sortering bare hvis rekonstruksjonen og 3D-variabilitetsanalysen indikerer heterogenitet av datasettet.

Viktigst av alt, må brukeren nøye inspisere de resulterende 3D-volumene nøye (Protokoll trinn 9.3 ), og bekrefte at egenskapene til den aktuelle tettheten stemmer godt overens med den nominelle oppløsningen. Ved en oppløsning på <9 Å blir stangliknende tettheter tilsvarende a-helixer synlige. Ved en oppløsning <4.5 Å, er tettheter som tilsvarer tråder i β-ark, normalt godt separert og omfangsrike aminosyrer blir synlige. Et kart med høy oppløsning (<3 Å) skal vise tydelig merkbare sidekjeder, slik at byggingen av en nøyaktig atommodell kan bygges.

Resultatene som er oppnådd hittil, viser at ved hjelp av SPHIREs automatiserte reproduksjonsprøver og minimal visuell inspeksjon, er foreliggende protokoll generelt anvendelig for alle typer enkeltpartikkel-kryo-EM-prosjekter. Representative resultater fra hvert behandlingstrinn er vist for rekonstruksjon av TcdA1-toksinet avPhotorhabdus luminescens 21 , som har blitt løst til nær-atomoppløsning. Tetthetskart av tilsvarende kvalitet kan brukes til å konstruere pålitelige atommodeller ved hjelp av de novo ryggradssporing samt gjensidig eller real-space-raffinering, og derved gi et solidt strukturelt rammeverk for forståelse av komplekse molekylære mekanismer.

TILTAK KODER:

Koordinatene for EM-strukturen og de ubehandlede filmene er deponert i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltaksnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker D. Roderer for å gi oss TcdA1 mikrografer. Vi takker Steve Ludtke for hans løpende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Max Planck Society (til SR) og Det europeiske råd under EUs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (stipend nr. 615984) (til SR) og tilskudd fra National Institutes of Helse R01 GM60635 til PAP).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SPHIRE Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas  http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur Janelia Farm Research Campus, Ashburn http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2 Baylor College of Medicine, Houston http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores Max Planck Institute of Molecular Physiology Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope  FEI 300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector FEI
EPU (automated data acquisition software) FEI https://www.fei.com/software/epu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , Oxford University Press. (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Tags

Biochemistry strukturell biologi elektronmikroskopi elektronkryo-mikroskopi kryo-EM TEM enkeltpartikkel bildebehandling programvareutvikling enkeltpartikkelanalyse Tc-toksin
Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M.,… More

Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M., Merino, F., Voicu, H., Huang, Z., Penczek, P. A., Raunser, S., Gatsogiannis, C. High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE. J. Vis. Exp. (123), e55448, doi:10.3791/55448 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter