Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende nitrogenoxid (NO •) Probes, de geNOps, for Real-time Imaging af NO • Signaler i enkeltceller

Published: March 16, 2017 doi: 10.3791/55486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Molecular Biology and Biochemistry, Medical University of Graz

Abstract

Nitrogenoxid (NO •) er en lille gruppe, som medierer flere forskellige vigtige cellulære funktioner i pattedyr, bakterier og planter. På trods af eksistensen af et stort antal metoder til påvisning NEJ • in vivo og in vitro, real-time overvågning af NO • på enkeltcelle-niveau er meget udfordrende. De fysiologiske eller patologiske virkninger af NO • bestemmes af den faktiske koncentration og opholdstiden for denne gruppe. Følgelig metoder, der tillader enkeltcelle-påvisning af NO • er særdeles ønskelige. For nylig udvidede vi pallen af ​​NO • indikatorer ved at indføre enkelt fluorescerende protein-baseret genetisk kodet nitrogenoxid (NO •) prober (geNOps), der direkte reagerer på cellulære NO • udsving og dermed rettet mod dette behov. Her demonstrerer vi brugen af ​​geNOps at vurdere intracellulære NO • signaler som reaktion på to forskellige kemiske NEJ • -liberating molekyler. Vores resultater also bekræfter, at frisk fremstillet 3- (2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino) -N-methyl-1-propanamin (NOC-7) har en meget højere potentiale til at fremkalde ændringer i intracellulære NO • niveauer i forhold til den uorganiske NEJ • donor natriumnitroprussid (SNP). Endvidere blev tofarvet live-cell imaging anvendelse af de grønne geNOps (G-geNOp) og den kemiske Ca2 + indikator Fura-2 udført for at visualisere den stramme regulering af Ca2 + -afhængige NEJ • dannelse i enkelte endotelceller. Disse repræsentative eksperimenter viser, at geNOps er egnede redskaber til at undersøge realtid generation og nedbrydning af encellede NO • signaler i forskellige forsøgsopstillinger.

Introduction

Vi har for nylig udviklet en ny klasse af genetisk indkodede fluorescerende NO • prober, kaldet geNOps 1. Disse sensorer består af en enkelt bygget, bakterie-afledt, NO • bindingsdomæne 2, som er konjugeret til et særskilt fluorescerende protein (FP) variant 3 (cyan, grønt eller orange FP). NO • binding til det ikke-hæm jern (II) center 4 inden for de geNOps vendte reducerer fluorescensintensitet 1. Vigtigere er det, geNOps fluorescens aflastning straks og fuldt når intracellulære NO • niveauet falder en. Derfor geNOps give real-time billeder af (under) cellulære NO • udsving. Selvom NO • sensing mekanisme geNOps fortsat uklare hidtil, har de vist sig at være fremragende NO • reportere, og dermed har styrken til at åbne op for en ny æra af polykromatisk, kvantitativ NEJ • bioimaging med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner 1, 5. Andre tilgængelige fluorescerende Nej • sonder er baseret på små kemiske forbindelser, som skal indlæses i cellerne, og er uigenkaldeligt ændret af NO • 6. Yderligere ulemper ved INGEN • følsomme små fluoroforer er deres potentiale cytotoksicitet og relativt lav specificitet, som gør det vanskeligt at bruge dem i en pålidelig, analytisk og overbevisende måde 7, 8, 9. Selvom effektiv brug af genetisk indkodede fluorescerende prober forudsætter effektive genoverførselsteknikker, har FP-baserede genetisk indkodede sensorer opstået som uundværlige redskaber som har revolutioneret vores forståelse af den indre cellernes funktion 10, 11. Før udviklingen af ​​de enkelte FP-baserede geNOps, et Förster resonans (FRET) -baserede NEJ • sensor, benævnt NOA-1 12, blev konstrueret. Sato et al. designet denne sofistikerede sonde, der består af to underenheder af NO • -følsom opløselig guanylatcyclase (SGC), både konjugerede at ærgre-baserede sensorer rapportering cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP) niveauer 12. Da denne sonde reagerer på cGMP, det kun indirekte registrerer intracellulære NO • udsving 12. Selvom NOA-1 reagerer på NO • stigninger i nano-molære sortiment, har dette værktøj ikke er blevet brugt hyppigt hidtil, sandsynligvis på grund af begrænsninger med hensyn til tilgængelighed og praktiske muligheder for denne omfangsrige todelte sensor.

Alsidige funktioner NEJ •, hvilket indvirkning grundlæggende biologiske processer er blevet godt karakteriseret 13, 14. Mange undersøgelser bevist, at NO • concentration i celler og subdomæner bestemmer celleskæbnen i sundhed og sygdomme 14, 15, 16. I pattedyr, NO • hovedsageligt genereres enzymatisk i forskellige celletyper ved velkarakteriseret nitrogenoxidsyntase (NOS) familie 17. Hidtil har tre isoformer af NOS blevet beskrevet 18, 19, 20; disse er de Ca2 + / calmodulin-afhængig endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 og neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, og Ca2 + / calmodulin-uafhængig konstitutivt aktiv inducerbar NOS (iNOS eller NOS- 2) 20. Desuden har tilstedeværelsen af mitokondrie NOS (mtNOS) også blevet foreslået 21. Dog mtNOS betragtes som en splejsning variant af nNOS, og er derfor ikke særskilt klassificeret som en isoform 21. En anden isoform, bortset fra de i pattedyrceller, er den såkaldte bakterielle NOS (bNOS), hovedsageligt findes i grampositive bakterier 22. Den enzymatiske produktion af NO • er meget kontrolleret og afhænger af tilgængeligheden af flere cofaktorer såsom nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH), flavinadenindinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylært oxygen og L-arginin 17. Den kationiske aminosyren L-arginin er det substrat, som omdannes til L-citrullin på NEJ • produktion 17. Foruden den meget reguleret enzymatisk dannelse af NO • er det blevet postuleret, at gruppen kan reduceres ikke-enzymatisk fra nitrit puljer af mitokondrier under hypoxiske betingelser 23. Når NEJ • produceres inden i en celle, kan det frit diffundere gennem biomembraner 14,ref "> 15. Men den meget korte halveringstid af denne radikale er hovedsageligt bestemt af de miljømæssige forhold, og forskellige veje og kemiske reaktioner effektivt nedbryde NO • niveauer 24. Til sidst, dannelse, diffusion, og nedbrydning af NO • afhænger på forskellige miljøparametre som bestemme den effektive koncentration af det stærkt biologisk aktive molekyle 24.

Den geNOps teknologi gør det muligt direkte påvisning af (sub) cellulære NEJ • udsving 1 og er derfor velegnet til at undersøge forholdet, og nyligt opdage de mekanismer, der er ansvarlige for opbygning og nedbrydning af cellulære NO • signaler. Her giver vi simple protokoller og repræsentative resultater for brugen af ​​geNOps at visualisere exogent fremkaldte og endogent genererede NO • profiler på de enkelte celler. Endvidere kan geNOps teknologi tilpasses til apdelsen i andre celle modelsystemer til at studere de komplekse mønstre af NO • dannelse, diffusion, og nedbrydning som reaktion på forskellige cellulære stimuli og spændinger.

Protocol

1. Forberedelse af kemiske Buffere og løsninger

  1. Forbered en opbevaringspuffer indeholdende 135 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM NaHCO3, 0,44 mM KH 2 PO 4, 0,34 mM Na 2 HPO 4, 10 mM D- glucose, 2 mM L-glutamin, 1x MEM vitaminer, 1x MEM aminosyrer, 1% pen STREP og 1% amphotericin B. Opløs alle bestanddele i destilleret vand og rør bufferen i 20 minutter under anvendelse af en magnetisk omrører ved stuetemperatur. PH justeres til 7,44 ved anvendelse af 1 M NaOH. Efter dråbevis tilsætning af NaOH, måle pH under anvendelse af en pH-meter under kontinuerlig omrøring.
  2. Forbered en fysiologisk Ca2 + -holdig buffer, som består af 140 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glucose og 10 mM HEPES. PH justeres til 7,4 under anvendelse af NaOH som beskrevet i trin 1.1.
  3. Forbered en Ca2 + -fri buffer, som består af de samme bestanddelesom anført i trin 1.2. Brug 1 mM EGTA i stedet for 2 mM.
  4. Opløse Fura-02:00 i DMSO for at opnå en 1 mM stamopløsning. Alikvot stamopløsningen i tætsluttende hætteglas og opbevares ved -20 ° C i op til en måned. Hvis frosset, tillade stamopløsning til ligevægt ved stuetemperatur i mindst 1 time beskyttet mod lys. Fortynd Fura-2:00 stamopløsning i 1 ml opbevaringspuffer (trin 1.1) for at opnå en slutkoncentration på 3,3 uM.
  5. Forbered 1 ml af en 100 mM histamin stamopløsning i destilleret vand (pH 7,0). Fortynd 100 mM histamin stamopløsning i 100 ml Ca2 + -holdig fysiologisk buffer til en slutkoncentration på 100 uM histamin.
  6. Solubilisere Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) i 100 ml calcium-indeholdende fysiologisk buffer til opnåelse af en slutkoncentration på 300 uM. Opbevar opløsningerne ved 37 ° C vandbad i mindst 1 time, indtil L-NNA er fuldstændigt opløst.
  7. Solubilisere 10 mg NOC-7 i destilleret water (pH 7,0) til opnåelse af en 10 mM stamopløsning. Alikvot stamopløsningen i små portioner i tæt lukkede hætteglas og opbevares straks ved -70 ° C. Fortynd NOC-7 stamopløsning i en fysiologisk buffer til opnåelse af en slutkoncentration på 10 uM NOC-7.
    BEMÆRK: NOC-7 er en lille kemisk forbindelse, som spontant frigør NO med en kort halveringstid. forberede altid arbejder buffere, der består NOC-7 lige før hvert forsøg.
  8. Lav en 1 mM natriumnitroprussid (SNP) opløsning i en fysiologisk calcium buffer og forberede en 10 uM fortynding.
    BEMÆRK: forberede altid små mængder (~ 10 ml) af NO-donor-løsninger på grund af den hurtige nedbrydning sats.
  9. Der fremstilles en phosphatpufret opløsning (PBS) bestående af 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 9,2 mM Na 2 HPO 4, og 1,5 mM KH 2 PO 4. Juster pH-værdien til 7,44 med NaOH / HCI.

2. Cell Fremstilling

BEMÆRK: I order at opnå en ensartethed i udførelsen af måling nitrogenoxid (NO •) i enkelte celler ved hjælp geNOps, skal præinkuberes med en jern (II) / vitamin C indeholdende buffer før billeddannelse eksperimenter for at genoprette Fe2 + celler inden for NO •-bindende domæne af NO • -probes. I tilfælde af EA.hy926 og HEK293-celler, inkubation i 20 minutter med jern (II) booster løsning fører til fuld aktivering af NO • sensorer.

  1. Seed 5.5 x 10 5 EA.hy926 eller HEK293 celler til næste dag eller 3,5 x 10 5 celler for dagen efter næste dag, den 30.-mm mikroskop dækglas i en brønd i en 6-brønds plade. Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en fugtig miljø med 5% CO2.
    BEMÆRK: Detaljerede oplysninger om adenoviral infektion af pattedyrceller og virus konstruktion er blevet beskrevet af Zhang et al. 25. Dette trin gælder ikke for HEK 293 celler stabilt udtrykker G-geNOp.
  2. Tag føtalt kalveserum (FCS) og antibiotika-fri Dulbeccos eagle modificerede medium (DMEM) og tilsæt adenoassocieret virus type 5 (AAV5) vektor, der bærer det gen, der koder for G-geNOp (MOI: 500 for EA.hy926-celler, hvilket gav næsten 100 % positive celler; MOI: 1 er effektiv til HEK293-celler).
    Bemærk: Brug af adenoassocierede virale vektorer er tildelt risikogruppe 2. biosikkerhed niveau 2 inddæmning kræves generelt for arbejdet med denne vektor. Om nødvendigt kan virusinfektion også udføres i FCS indeholdende medium. Alternativt kan celler transient transficeret under anvendelse lipidbaserede bærere 1.
  3. Fjern kulturmediet, og vask cellerne med foropvarmet (37 ° C) PBS. Der tilsættes 1 ml DMEM / AAV5 medium på hver brønd i 1 time. Dette trin gælder ikke for HEK 293 celler stabilt udtrykker G-geNOp.
  4. Der tilsættes 1 ml 20% FCS-holdigt DMEM på hver brønd til en slutkoncentration på 10% FCS. Fjern ikke AAV5-holdige medier fra cellerne. Gently vippe pladen at homogenisere mediet inden brøndene. Cellerne inkuberes i 48 timer ved 37 ° C i en fugtig miljø med 5% CO2. Dette trin gælder ikke for de HEK 293 celler stabilt udtrykker G-geNOp.
  5. Efter 48 timer vaskes cellerne med forvarmet PBS. Efterfølgende tilsættes 2 ml foropvarmet storage buffer (afsnit 1.1) til hver brønd og inkuberes celler ved stue stuetemperatur i mindst 1 time beskyttet mod lysstråling.
  6. Erstatte opbevaringspuffer med 1 ml / brønd af jern (II) booster opløsning ved stuetemperatur (RT). Cellerne inkuberes i nøjagtigt 20 minutter i mørke.
    BEMÆRK: Du må ikke overstige eller reducere det optimale inkubationstid, da dette kan påvirke lydhørhed af NO • sonder.
  7. Vask cellerne en gang med opbevaringsbuffer og inkuberes hver brønd med 2 ml opbevaringspuffer i mindst 2 timer ved stuetemperatur for at tillade cellerne at ækvilibrere.
  8. Erstatte opbevaringspuffer med 3,3 uM Fura-2:00 i 1 ml opbevaringspuffer i 45 minutter ved stuetemperatur, beskyttetmod lys.
  9. Vask cellerne to gange med opbevaringsbuffer og inkuberes igen i mindst 30 minutter for at tillade celler at ækvilibrere.

3. Levende Cell Imaging af NO • og Ca 2+ Signaler i individuelle celler

  1. Løs et 30 mm dækglas belagt med EAhy.926 eller HEK293 celler (fra trin 2.1) i en metal perfusion kammer og placere den på mikroskopet. Tilslut tilstrømningen rør til bufferreservoirer og udstrømningen til en vakuumpumpe. Sikre en ensartet flow og undgå dræning af dækglasset.
  2. Start grovhed-drevne perfusion med fysiologisk calcium buffer (fra trin 1.2) ved anvendelse af en halvautomatisk perfusion system.
    BEMÆRK: Et sådant system består af bufferreservoirer, respektive slanger, magnetiske ventiler, der er elektronisk styrede og en vakuumpumpe (se figur 1 B). Strømningshastigheden kan variere fra 1 til 3 ml / min, afhængig af højden af ​​perfusionen reservoirer. For konsekvente lokale drug ansøgkation, bør strømningshastigheden af ​​alle anvendte reservoirer være omtrent ens. Dette bør afprøves før billeddannelse eksperimenter. Overvej, at endotelceller imødekomme det øgede forskydningsspænding som kan induceres ved stringent perfusion.
  3. Tænd for billeddannende system og tillade opvarmning af alle enheder i 30 minutter.
  4. Definer imaging indstillinger ved hjælp respektive software. Vælg excitationsbølgelængde 340 nm og 380 nm for fura-2 billedbehandling og 480 nm for spændende G-geNOp. For at minimere fluorescens blegning øge kameraet binning til 4 og reducere excitations- intensiteter og eksponeringstider. Se også trin 3,6-3,8.
    BEMÆRK: Imaging indstillinger og parametre afhænger af de anvendte enheder, fura-2 lastning effektivitet og G-geNOp ekspressionsniveauerne.
  5. Vælg imaging region ved at flytte xyz-tabellen af ​​mikroskopet indtil flere fluorescerende celler er i fokus. Så definere områder af interesse (ROI) via den respektive software-værktøj. Tegn regioner, der dækker flere hele single fluorescerende celler pr Billedfeltet manuelt. Desuden definerer en baggrund region af tilsvarende størrelse.
    BEMÆRK: Når billederne er blevet erhvervet og lagret ROI'er kan også defineres nylig efter den billeddannende proces til yderligere analyse ved hjælp af respektive billedbehandling analyse software (se Materialer List).
  6. Begynd at indsamle data om en inverteret og avanceret fluorescerende mikroskop med en motoriseret prøve fase, og en monokromatisk lyskilde. Skiftevis excite ved 340 nm og 380 nm for Fura-2 am og 480 nm for G-geNOp hhv. Set respektive eksponeringstider så der for alle kanaler, et klart fluorescenssignal kan detekteres over tid. Se også trin 3.4.
    BEMÆRK: Dette afhænger af intensiteten af ​​excitationslyset og kameraet Binning. Brug for eksempel 15% intensitet af excitationslyset, et kamera Binning på 4 og 150 ms for 340 nm, 50 ms for 380 nm, og 300 ms for 480 nm. Se også trin 3.4.
  7. Indsamle det udsendte lys ved 510 nm for fura-2 / AM, 520 nm for G-Genop ved anvendelse af en ladningskoblet indretning (CCD) kamera med passende filter sæt, bestående af 500 nm exciter, et 495 nm dikroisk og et 510-520 nm emitter. Optag en samlet ramme hver 3 sek.
  8. Optage de første minutter (om nødvendigt op til 3 min) i fysiologisk buffer Ca2 + (1,2) for at opnå grundlinjen i respektive fluorescenssignaler over tid.
  9. Når der observeres en stabil basislinje fluorescens, skifte til 100 uM histamin eller ATP (1 uM eller 100 uM) indeholdende fysiologisk Ca2 + buffer til at stimulere celler i 3 min.
    BEMÆRK: EA.hy926-celler, der reagerer på agonisterne viser en kraftig stigning af fura-2-forhold (fluorescens exciteret ved 340 nm divideret gennem fluorescens exciteret ved 380 nm) og et klart fald i G-geNOp fluorescenssignal.
  10. Skift tilbage til den fysiologiske Ca2 + puffer uden histamin eller ATP og L-NNA i 5 minutter til fjernelse af forbindelserne fra cellerne. Dette trin kan forlænges indtil Lysstofrørblomsterstand ændringer udvindes fuldstændigt.
  11. Administrere 10 uM NOC-7 i fysiologisk Ca2 + puffer i 2 min ved anvendelse perfusionssystemet. NO-donor påvirker kraftigt G-geNOp fluorescens som normalt falder med> 20% som respons på 10 uM NOC-7. I EA.hy926-celler NOC-7 effekt er ca. 3 gange stærkere i forhold til den agonistinduceret G-geNOp fluorescens bratkøling.
  12. Skyl NO • -releasing stof til ca. 10 minutter med fysiologisk Ca2 + buffer og stoppe optagelsen, når basal fluorescens genvindes.

4. Data Analysis

  1. Eksport erhvervet gennemsnitlige fluorescensintensitet data for enkelte celler over tid, til dataanalyse software.
  2. Fratræk respektive baggrundsværdier og beregne forholdet mellem 340 nm ved 380 nm af de respektive Fura-2 signaler af hver enkelt celle over tid.
  3. Fratræk baggrundsværdier af G-geNOp kanal til opnåelse af faktiske fluorescence intensitet NO probe (F) med tiden under anvendelse af nogen beregning software.
  4. Tag basisliniefluorescensen værdier som F 0 (F 0 er fluorescensen af NO sonden med tiden uden stimulation). Se også trin 4.5 og figur 1C.
  5. Beregne en funktion over tid for de fluorescens blegning effekter ved hjælp af følgende ligning: F 0 = F inital • exp (-K • Time) + F plateau. F inital: maksimal fluorescens signal når billedbehandling er startet; K: hastighedskonstant af fluorescens blegning over tid; F plateau: fluorescens minimum nået ved blegning over tid; Se også trin 4.3- 4.4 og figur 1C.
    BEMÆRK: tilnærmelse, kan alle fluorescens-værdier over tid før og efter celle stimulation anvendes. Yderligere detaljer er angivet af Bentley et al. 27.
  6. For at normalisere G-geNOp signal over tid, beregne en-F / F0 (trin 4,3-4,5). Se figur 1C og 1D.

Representative Results

Visualisering af Single-celle Nej • Profiler i Reaktion på Forbigående Applied NO donorer

Vi brugte en HEK-celle-klon, som stabilt udtrykker G-geNOp (figur 1A), med henblik på at visualisere INGEN • signaler på enkelt celle-niveau som reaktion på to forskellige NO-befriende små kemiske forbindelser, NOC-7 og SNP. De NO • donorer blev konsekutivt påføres og fjernes fra celler under billeddannelse ved hjælp af en tyngdekraft-baseret perfusion system, der sikrede kontinuerlig strøm (figur 1B). Alle celler, der udtrykker G-geNOp med forskellige intensiteter viste en tydelig reduktion af fluorescens som respons på NOC-7 og SNP (fig 1C), hvilket indikerer hurtig NO • akkumulering i celler ved tilsætning af NO • donorer. Normaliserede fluorescens-signaler (1-F / F 0) viste, at både NO • donorer fremkaldte homogen cellular NEJ • højder der fuldstændig genvundet ved udvaskning af NO • -releasing forbindelser (Figur 1D). Men 10 pM SNP inducerede kun 50% af den cellulære NO • signal (9,63 ± 1,05%, n = 3/38), der blev nået ved 10 uM NOC-7 (18.10 ± 1,20%, n = 3/38, p < 0,0001). For at opnå lige intracellulære NO • niveauer med både NEJ • donorer, blev en koncentration på 1 mM SNP påkrævet (figur 1C, 1D).

Dernæst testede vi kapaciteten af ​​frisk fremstillet versus udløbet NOC-7 til at hæve intracellulære NO • niveauer i HEK-celler. Til dette formål har vi udarbejdet fire eksperimentelle buffere indeholdende 5 uM NOC-7. NO • donor blev enten tilsat frisk lige før målingen, eller holdes inden reservoirer i 1 time, 2 timer og 3 timer ved stuetemperatur inden måling. De forskellige puffere blev konsekutivt påføres og fjernes fROM G-geNOp udtrykkende celler under anvendelse af et perfusionssystem (figur 2B). Denne fremgangsmåde afslørede stabiliteten af vandige NOC-7 løsninger, der, som forventet, viste nedsat kapacitet over tid for at hæve intracellulære NO • niveauer (figur 2A, 2C). Interessant NO • signaler genvundet betydeligt hurtigere ved fjernelse af udløbne buffere, sammenlignet med den intracellulære NO • respons, der blev fremkaldt af frisk NOC-7 (figur 2C), måske antyder adhæsion af intakte NO • -liberating molekyler på cellulære komponenter .

Samtidig Visualisering af Ca 2+ og NEJ • Signaler i Single endotelceller

For at studere Ca 2+ -triggered NEJ • dannelse i endotelceller, den almindeligt anvendte endotel udødeliggjort celle-surrogat, EA.hy926 cellelinie, var transiently transficeret med G-geNOp og fyldt med Fura-2 / AM (se protokol 2.8). Transfektion gav ca. 10% af G-geNOp positive endothelceller (n = 6, figur 3A), hvilket er tilstrækkeligt til at optage Ca2 + -evoked NEJ • produktion af niveauet af enkelte endotelceller. Men vi opnået næsten 100% G-geNOp positive EA.hy926-celler under anvendelse af en adenoassocieret viral vektor (n = 6; se protokol 2.2). Før multikanal målinger blev celler inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur i opbevaringsbuffer bestående L-NNA, en potent irreversible NOS-inhibitor 26. Kontrolceller blev holdt i samme opbevaringsbuffer uden L-NNA (se protokol 1.1) (figur 3B). Behandling af kontrol celler med histamin, et potent inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3) -generating agonist, øjeblikkeligt forhøjet cytosole Ca 2 + niveauer efterfulgt af en gradvis forøgelse af intracellulær NEJ • indtil agonist var fjernd (figur 3C, 3D). Celler præ-behandlet med NOS-inhibitor viste lignende cytosoliske Ca 2 + signaler, mens det intracellulære NEJ • niveau forblev næsten upåvirket som reaktion på histamin (figur 3E). EA.hy926-celler, der udtrykker G-geNOp blev også behandlet med 1 pM og 100 pM af undersøgelsesperioden 3 -generating agonist ATP for at teste, om geNOps er egnede til at overvåge NO • signaler i reaktion på både lav fysiologisk og supra-fysiologiske koncentrationer af en agonist (figur 3F). I endotelcelle linje 1 uM ATP fremkaldte en klar cytosolisk NEJ • signal, som var ca. halvdelen af det opnåede signal med 100 pM ATP (figur 3F).

figur 1
Figur 1: Intracellulær INGEN profiler som reaktion på forskellige NO-Liberati ng molekyler. (A) Wide field billeder af HEK celler, der stabilt udtrykker cytosolisk G-geNOp. Scale bar = 20 um. (B) Skematisk illustration af en tyngdekraft baseret halv-automatiske perfusion system til den kontrollerede anvendelse og fjernelse af NOC-7 og SNP. (C) repræsentant (ud af 3 uafhængige forsøg) ikke-normaliserede encellede fluorescensintensitet spor i arbitrære enheder versus tid af HEK-celler, der stabilt udtrykker cytosolisk G-geNOp som respons på 10 uM NOC-7, 10 pM SNP, og 1 mM SNP. Sort fed kurve repræsenterer den gennemsnitlige kurve af 26 encellede spor (lysegrå kurver). Punkteret sorte kurve repræsenterer F 0, som blev anvendt til normalisering. (D) Normaliserede og inverterede enkelt spor (1-F / F 0, lysegrå kurver), og middelkurven (sort fed kurve) over tid som respons på 10 uM NOC-7, 10 pM SNP, og 1 mM SNP ekstraheret fra panel C.es / ftp_upload / 55.486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Stabilitet test af NOC-7 ved anvendelse af stabilt G-geNOp udtrykkende HEK-celler. (A) Repræsentant NEJ •-koncentration-respons-kurve over tid stabilt G-GeNOps udtrykker HEK celler efter ansøgning af friske og gamle NOC-7 bufferopløsninger. Alle NOC-7 indeholdende buffere blev fremstillet i første omgang med en endelig koncentration på 5 uM, der anvender samme stamopløsning (50 mM). Den forløbet tid af de respektive løsninger efter fremstilling indtil billedbehandling udgør 1 time, 2 timer, og 3 timer som angivet. (B) Skematisk illustration af en tyngdekraft baseret halv-automatiske perfusionssystem til fortløbende tilføje og fjerne NOC-7 opløsninger under billedbehandling. (C) Tidsmæssige korrelationer afcellulære NO • signaler som reaktion på frisklavet og gamle NOC-7 buffere. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Samtidig multikanal billeddannelse af NO • og Ca 2 + signaler i enkelte EA.hy926 celler. (A) Repræsentative wide-field fluorescens billeder af EAhy.926 celler, der udtrykker G-geNOp (venstre panel), der er fyldt med fura-2 / am (midterste og højre paneler). Scale bar = 20 um. (B) Skematisk illustration af behandling af EAhy.926 celler med 500 pM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) i 20 min i en seks-brønds plade inden målingen. (C) Repræsentant tidsforløbet af en samtidig registrering af fura-2 (excitation: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) og G-geNOp signaler (excitation: 480 nm; emission: 520 nm) i respons på 100 uM histamin. Som anført histamin blev fjernet efter 3 min under anvendelse af et perfusionssystem. (D) Kurver repræsenterer samtidige optagelser af cytosolisk Ca2 + (Fura-2 forholdet signaler, F 340 / F 380 er grå optrukket linie) og NEJ • (normaliseret og omvendt kurve, 1-F / F 0 er grøn solid linje) signaler over tid af en enkelt fura-2 / aM indlæst endotelcelle transient udtrykkende G-geNOp. Celler blev stimuleret med 100 uM histamin i 3 minutter i en Ca2 + (2 mM CaCl2) indeholdende buffer (n = 8/3). (E) repræsentant samtidigt registreres Ca2 + (grå optrukket linje) og NO • (grøn optrukket linje) signaler over tid af en EA.hy926 celle, der blev forbehandlet med 500 pM Nω-nitro-L-arginin (L-NNA) før til måling (n = 12/3). Celler blev behandlet med 100 pM histamin i nærvær af 2 mMCa2 +. (F) Gennemsnitlige kurver repræsenterer cytosoliske NO • signaler i reaktion på 1 uM ATP efterfulgt af en anden celle stimulering med 100 uM ATP. Barer repræsenterer middelværdier ± SD af maksimale G-geNOp signaler som reaktion på en uM ATP (hvid bar) og 100 uM ATP (grøn bar) på 4 uafhængige forsøg; p <0,001 vs. 1 uM ATP. P-værdi blev beregnet ved anvendelse af en uparret t-test. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Siden opdagelsen af NO • som et vigtigt signalmolekyle i biologi 28 har realtids-måling af den radikale i enkelte celler, væv og hele dyr med høj opløsning i en gennemførlig og pålidelig måde blevet stræbt. Her rapporterer vi anvendelsen af nyligt udviklede genetisk kodet fluorescerende NO • prober (geNOps), der muliggør nøjagtig leve-cell imaging af NO • signaler ved hjælp wide-field fluorescensmikroskopi 1.

For at omgå kunstfærdige og invasive transfektion procedurer HEK-celle-klon, der stabilt udtrykker grønt fluorescerende G-geNOp blev anvendt til at kvantificere eksogent genererede encellede NO • profiler. Som HEK-celler normalt ikke producerer NO • endogent 29, denne celletype er egnet til generering af en geNOp-baserede sensor cellelinie, som kan være nyttigt til mange andre anvendelser i co-dyrkningsbetingelsermed NO • producerer primære celler eller endda i levende dyr 30. Men i denne undersøgelse viser vi kapaciteten af ​​forskellige NEJ • -liberating forbindelser, af forskellige koncentrationer og stabiliteter, at fremkalde intracellulære NO • signaler under anvendelse af G-geNOp udtrykkende HEK-celle model. Vores data viste, at NO • -donor koncentration, kvalitet og anvendelsesmetode sidste ende bestemme mønstre af intracellulære NO • profiler. Sådanne oplysninger er uundværlige for in situ farmakokinetiske karakterisering af forskellige NO • donorer, som er tegn på flere sygdomme. Navnlig er geNOps blevet vist at stabilt svare til flere gentagne anvendelser af NO • -donor impulser over en meget lang tid 1. Følgelig er de eksperimenter med NEJ • -liberating forbindelser præsenteret heri, tillader semikvantitative konklusioner vedrørende de forskellige amplituder og kinetik respektive cellulære NO226; signaler (figur 1 og 2).

Selv om der stabilt udtrykker HEK celleklon formentlig stammer fra en enkelt celle, blev et bredt heterogenitet G-geNOps ekspressionsniveauer observeret (figur 1). Dette er et fælles træk ved stabile cellekloner som transkriptionen af (genomet-integrerede) genet af interesse er under kontrol af mange faktorer såsom forskellige miljøbelastninger 31, der påvirker cellevæksthastigheder 32, og cellecyklus status 33. Enkelt FP-baserede geNOps er ikke-ratiometriske prober og dermed NO • -inducerede tab af stigninger fluorescensintensitets med geNOp ekspressionsniveauet 1. Følgelig normalisering af geNOps signaler er afgørende for kvantificering cellulære NO • signaler navnlig i tilfælde af en komparativ analyse. Som det fremgår af vores seneste undersøgelse, en streng lineær korrelation between den basale fluorescensintensitet geNOps og styrken af NO • induceret fluorescens quenching over et bredt område af fluorescensintensiteter er fundet 1. Dette er et vigtigt element i geNOps for absolut kvantificering af cellulære NO • signaler. Som vist i figur 1, normalisering af G-geNOps signaler som reaktion på NOC-7 og SNP afslørede homogene NO • signaler i forskellige HEK-celler fra den samme plade, hvilket indikerer, at HEK-celler er ikke forskellige med hensyn til deres evne til at optage og forringe NO • radikal, der stammer fra NO • donor. I modsætning hertil ved hjælp geNOps i HeLa-celler påvist klare heterogeniteter af cellulære NO • signaler mellem forskellige celler som reaktion på NOC-7. Disse forskelle peger på celle typespecifikke NO • metabolisme og nedbrydning satser, som kan have flere konsekvenser i celle fysiologi og patologi, og kan afdækkes ved hjælp af geNOps teknologi.

Ikke desto mindre er to vigtige elementer i geNOps har skal overvejes nøje for korrekt brug af sensorer og data fortolkninger: i) geNOps kræver tilstrækkelig jern (II) til fuldt ud at besvare NEJ • 1, og ii) afhængigt af FP variant kan geNOps være pH-følsomme 1. Her beskriver vi en protokol, der har vist sig at være egnet til den ikke-toksiske jern (II) supplering af geNOps, som er udtrykt i enten HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se protokol 2.6). Mens det er blevet påvist, at celle behandling med jern (II) / C-vitamin påvirkede ikke cellemorfologi, cellelevedygtighed og metabolisk aktivitet af celler 1, kan det være nødvendigt at optimere dette vigtige skridt for andre celletyper og væv. Men i nogle eksperimentelle betingelser, kan kravet om jern (II) loading begrænse anvendelsen af ​​geNOps. Især er det blevet vist, at ascorbat kan reducere NO • 35 og ascorbat-jern (II) komplekser er i stand til at fjerne NO • 36, 37. Desuden kan overskydende jern (II) og ascorbat inducerer inflammatoriske responser 39 og frakoble eNOS 41. Sådanne virkninger skal overvejes, når du bruger geNOps teknologi. Det har vist sig, at under visse eksperimentelle betingelser, er den intracellulære pH påvirkes markant 34, som har potentiale til at påvirke geNOps fluorescens en. Især de cyan og grønne geNOps varianter er relativt pH-følsom viser et fald på fluorescens ved forsuring 1. Derfor kan akutte ændringer i (sub) cellulære pH simulere falske INGEN • signaler ved brug af pH-følsomme geNOps. Som foreslået i vores tidligere arbejde, den parallelle anvendelse af NO • ufølsomme geNOps (geNOps mut) som negativ controls anbefales at dissekere ægte cellulære NEJ • signal fra pH ændrer en. Desuden kan inspiceres cellulær pH-ændringer ved hjælp pH-sonder som SYPHER 34.

Yderligere har vi visualiseret den endogene enzymatiske NO • dannelse som reaktion på en fysiologisk Ca2 + -mobilizing agonist i endotelcelle surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellelinie er et hyppigt anvendt modelsystem konsekvent udtrykker eNOS 38. Anvendelse af geNOps transient udtrykt i EA.hy926-celler, bekræftede, at IP3-medieret Ca2 + signaler fremkalde dybe NO • dannelse i denne celletype, som blev næsten fuldstændig blokeret af L-NNA. For at tidsmæssigt korrelere Ca2 + med nej • signaler, blev G-geNOp-udtrykkende celler fyldt med UV-exciteres kemisk Ca2 + -indicator fura-2 / AM. Den spektrale adskillelse af Ca2 + bundne og ubundne fura-2 fluo rescence fra G-geNOp signal kan let opnås med kommercielt tilgængelige filtersæt 40. Imaging begge prober afslørede, at Ca2 + -triggered enzymatisk NO • dannelse forekommer meget langsommere sammenlignet med den cytosoliske Ca2 + stigning i denne endothelcelletype. Lignende kinetik af encellede NO • signaler i endotelceller fra bovin pulmonal upon celle behandling med IP3 -generating agonist bradykinin, samt forskydningsspændinger er blevet rapporteret under anvendelse NOA-1, en indirekte stærkt NEJ • -følsom sensor 12 . Følgelig data understrege, at Ca2 + -evoked eNOS-afledte NO • formation kræver en vis starttidspunkt indtil hele enzymatiske aktivitet er nået. Selv kinetikken for cellulær NO • dannelse, diffusion og nedbrydning kan ekstraheres fra andre data, fx spændinger-baserede målinger af NO • -induceret karrelaksationss = "xref"> 26, den store fordel ved fluorescerende INGEN • sonder er, at de direkte konvertere cellulære NO • udsving i synlige signaler i real-tid. Derfor billedbehandling cellulære INGEN • signaler med geNOps giver høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og tilbyder unikke muligheder i (gen) undersøge (sub) cellulære NEJ • homeostase. For eksempel imaging eNOS shuttling 42 i kombination med den geNOps teknologi i enkelte endotelceller kan være egnet til at korrelere NEJ • formation med den subcellulære lokalisering og translokation af NO • producerende enzym eller andre relevante proteiner, såsom calmodulin og caveolin 43.

Her beskriver vi den praktisk anvendelse af G-geNOp udtrykker HEK og EA.hy926 celler til at visualisere eksogent og endogent genereret cellulære NO • signaler på single-celle-niveau og i realtid på en konventionel bredt felt fluorescens microscope. Vores data indebærer, at geNOps er velegnede til specifikt at spore (under) cellulære NO • dynamik under forskellige eksperimentelle betingelser ved hjælp af alle former for interessante celletyper.

Disclosures

EE, MW, RM og WFG, medarbejdere i det medicinske universitet i Graz, har indgivet en britisk patentansøgning (patentansøgning nummer WO2015EP74877 20.151.027, prioritet nummer GB20140019073 20.141.027), som beskriver dele af forskningen på dette manuskript. Licenser relateret til dette patent leveres til Next Generation Fluorescence Imaging (NGFI) GmbH ( http://www.ngfi.eu/ ), et spin-off selskab af det medicinske universitet i Graz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3957.20 sodium chloride
KCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6781.1 potassium chloride
CaCl2·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany T885.1 calcium chloride dihydrate
MgCl2·6H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2189.2 magnesium chloride hexahydrate
HEPES Carl Roth, Karlsruhe, Germany 9105.3 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
NaHCO3 Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8551.1 sodium hydrogencarbonate
KH2PO4 Merck, Darmstadt, Germany 104873 potassium dihydrogen phosphate
Na2HPO4·2H2O Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4984.1 sodium hydrogenphosphate dihydrate
D(+)-Glucose monohydrate Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6780.1 >99.5%; for cell culture, endotoxin free
EGTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 3054.2 ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N⁠,⁠N⁠,⁠N⁠′⁠,⁠N⁠′⁠-tetraacetic acid; calcium chelating agent
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany 6771.1 sodium hydroxide
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4625.1 hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N)
DMSO Carl Roth, Karlsruhe, Germany 4720.1 dimethyl sulfoxide;  highly polar, aprotic organic solvent
L-Glutamic acid hydrochloride  Sigma Aldrich, Vienna, Austria G2128 (S)-2-Aminoglutaric acid
DMEM, low glucose Sigma Aldrich, Vienna, Austria D5523 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose; with 1,000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture 
MEM Vitamin solution (100x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11120037 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
MEM Amino acids solution (50x) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 11130036 50x the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15140122.00 antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures
Amphotericin B Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 15290026.00 Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi
FCS Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10270106 Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin
PBS, pH 7.4 Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010031.00 phosphate-buffered saline
Fura-2 (AM) Teflabs, Austin, TX, USA 102 fluorescent cytosolic calcium indicators
Histamine dihydrochlorid Sigma Aldrich, Vienna, Austria H7250 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist 
Nω-Nitro-L-arginine Sigma Aldrich, Vienna, Austria N5501 N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA;  inhibitor of nitric oxide synthase
NOC-7 Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany 487952 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release
Sodium nitroprusside dihydrate Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA sc-203395A sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound
30 mm Cover slips Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany 41001130 glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30 mm, (VE: 100 pcs.) 
Iron(II) booster solution Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells;  http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plasmid Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5 Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
G-geNOp sensor cell line Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria n.a. human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp);  http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A cell line Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA R70507 subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) 
EA.hy926 cell line American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany CRL-2922 somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549
TILL iMIC Till Photonics, Graefling, Germany n.a. digital microscope
Polychrome V monochromator Till Photonics, Graefling, Germany n.a. ultra fast switching
AVT Stingray F145B Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany n.a. Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40 Zeiss, Göttingen, Germany n.a. 40X objective
dichroic filters Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA n.a. GFP emitter 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA 01-08 programmable perfusion system control unit
BVC control Vacuubrand, Wertheim, Germany 727200 Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system
ImageJ software  NIH Image  Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Eroglu, E., et al. Development of novel FP-based probes for live-cell imaging of nitric oxide dynamics. Nat Commun. 7, 10623 (2016).
  2. Bush, M., et al. The structural basis for enhancer-dependent assembly and activation of the AAA transcriptional activator NorR. Mo. Microbiol. 95 (1), 17-30 (2015).
  3. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat. Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  4. D'Autréaux, B., Tucker, N., Spiro, S., Dixon, R. Characterization of the Nitric Oxide-Reactive Transcriptional Activator NorR. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins, Part B. Poole, ed.P. oole,R. .K. .,(ed)., 437, 1st edition, Elsevier textbooks, s.l. 235-251 (2008).
  5. Strack, R. Sensors and probes: Yes to genetically encoded NO• sensors. Nat Methods. 13 (4), 288 (2016).
  6. Auten, R. L. Response to 'The use of diaminofluorescein for nitric oxide detection: Conceptual and methodological distinction between NO and nitrosation. Free Radic. Biol. Med. 50 (12), 1812 (2011).
  7. Sivaraman, G., Anand, T., Chellappa, D. A Fluorescence Switch for the Detection of Nitric Oxide and Histidine and Its Application in Live Cell Imaging. ChemPlusChem. 79 (12), 1761-1766 (2014).
  8. Ye, X., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Detection of nitric oxide in single cells. Analyst. 133 (4), 423-433 (2008).
  9. Thyagarajan, B., Malli, R., Schmidt, K., Graier, W. F., Groschner, K. Nitric oxide inhibits capacitative Ca2+ entry by suppression of mitochondrial Ca2+ handling. Br J Pharmacol. 137 (6), 821-830 (2002).
  10. Germond, A., Fujita, H., Ichimura, T., Watanabe, T. M. Design and development of genetically encoded fluorescent sensors to monitor intracellular chemical and physical parameters. Biophy. Rev. 8, 121-138 (2016).
  11. Malli, R., Eroglu, E., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F. Filling a GAP-An Optimized Probe for ER Ca2+ Imaging In Vivo. Cell Chem Biol. 23 (6), 641-643 (2016).
  12. Sato, M., Hida, N., Umezawa, Y. Imaging the nanomolar range of nitric oxide with an amplifier-coupled fluorescent indicator in living cells. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (41), 14515-14520 (2005).
  13. Weidinger, A., Kozlov, A. V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5 (2), 472-484 (2015).
  14. Paolo, S. Nitric Oxide in Human Health and Disease. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  15. Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease. Physiol Rev. 87 (1), 315-424 (2007).
  16. Bonafe, F., Guarnieri, C., Muscari, C. Nitric oxide regulates multiple functions and fate of adult progenitor and stem cells. J Physiol Biochem. 71 (1), 141-153 (2015).
  17. Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33 (7), 829-837 (2012).
  18. Dudzinski, D. M., Igarashi, J., Greif, D., Michel, T. The regulation and pharmacology of endothelial nitric oxide synthase. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 46, 235-276 (2006).
  19. Zhou, L., Zhu, D. -Y. Neuronal nitric oxide synthase: structure, subcellular localization, regulation, and clinical implications. Nitric Oxide. 20 (4), 223-230 (2009).
  20. Aktan, F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life Sci. 75 (6), 639-653 (2004).
  21. Ghafourifar, P., Cadenas, E. Mitochondrial nitric oxide synthase. Trends Pharmacol Sci. 26 (4), 190-195 (2005).
  22. Crane, B. R., Sudhamsu, J., Patel, B. A. Bacterial nitric oxide synthases. Annu Rev Biochem. 79, 445-470 (2010).
  23. Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
  24. Kelm, M. Nitric oxide metabolism and breakdown. Biochim Biophys Acta. 1411 (2-3), 273-289 (1999).
  25. Zhang, Y., et al. Estrogen-related receptors stimulate pyruvate dehydrogenase kinase isoform 4 gene expression. J Biol Chem. 281 (52), 39897-39906 (2006).
  26. Holzmann, S., Kukovetz, W. R., Windischhofer, W., Paschke, E., Graier, W. F. Pharmacologic differentiation between endothelium-dependent relaxations sensitive and resistant to nitro-L-arginine in coronary arteries. J Cardiovasc Pharmacol. 23 (5), 747-756 (1994).
  27. Bentley, M., et al. Vesicular calcium regulates coat retention, fusogenicity, and size of pre-Golgi intermediates. Mol Biol Cell. 21 (6), 1033-1046 (2010).
  28. Ignarro, L. J. Nitric oxide: a unique endogenous signaling molecule in vascular biology. Biosci Rep. 19 (2), 51-71 (1999).
  29. Upreti, M., Kumar, S., Rath, P. C. Replacement of 198MQMDII203 of mouse IRF-1 by 197IPVEVV202 of human IRF-1 abrogates induction of IFN-β, iNOS, and COX-2 gene expression by IRF-1. Biochem Biophys Res Com. 314 (3), 737-744 (2004).
  30. Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J Vis Exp. (111), (2016).
  31. de Nadal, E., Ammerer, G., Posas, F. Controlling gene expression in response to stress. Na. Rev Genet. 12 (12), 833-845 (2011).
  32. Latchman, D. S. Transcriptional Gene Regulation in Eukaryotes. Encyclopedia of life sciences. , Wiley. Chichester. (2005).
  33. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  34. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  35. Suarez, S. A., et al. Nitric oxide is reduced to HNO by proton-coupled nucleophilic attack by ascorbate, tyrosine, and other alcohols. A new route to HNO in biological media. J Am Chem Soc. 137 (14), 4720-4727 (2015).
  36. Kuropteva, Z. V., Kudryavtsev, M. E. Ferrous-ascorbate complexes as carriers of nitric oxide. Gen Physiol Biophys. 16 (1), 91-96 (1997).
  37. Vanin, A. F., Huisman, A., Stroes, E. S., Ruijter-Heijstek, F. C., Rabelink, T. J., van Faassen, E. E. Antioxidant capacity of mononitrosyl-iron-dithiocarbamate complexes: implications for NO trapping. Free Radic Biol Med. 30 (8), 813-824 (2001).
  38. Lindberg, R. A., Dewhirst, M. W., Buckley, B. J., Hughes, C. S., Whorton, A. R. Ca2+-dependent nitric oxide release in endothelial but not R3230Ac rat mammary adenocarcinoma cells. Am J Physiol. 271 (1), 332-337 (1996).
  39. Campo, G. M., et al. The SOD mimic MnTM-2-PyP(5+) reduces hyaluronan degradation-induced inflammation in mouse articular chondrocytes stimulated with Fe (II) plus ascorbate. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1610-1619 (2013).
  40. Waldeck-Weiermair, M., et al. Spatiotemporal correlations between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signals using a novel red-shifted mitochondrial targeted cameleon. PLOS ONE. 7 (9), 45917 (2012).
  41. Kuzkaya, N., Weissmann, N., Harrison, D. G., Dikalov, S. Interactions of peroxynitrite with uric acid in the presence of ascorbate and thiols: implications for uncoupling endothelial nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol. 70 (3), 343-354 (2005).
  42. Liu, J., Hughes, T. E., Sessa, W. C. The first 35 amino acids and fatty acylation sites determine the molecular targeting of endothelial nitric oxide synthase into the Golgi region of cells: a green fluorescent protein study. J Cell Biol. 137 (7), 1525-1535 (1997).
  43. Feron, O. The Endothelial Nitric-oxide Synthase-Caveolin Regulatory Cycle. J Biol Chem. 273 (6), 3125-3128 (1998).

Tags

Molekylærbiologi Ca ENOS Fluorescence Microscopy Fura-2 Genetisk kodede Probes live-cell Imaging Multichannel Imaging nitrogenoxid NO • -Donors NOC-7 Single Cell Analysis SNP
Anvendelse af genetisk indkodede fluorescerende nitrogenoxid (NO •) Probes, de geNOps, for Real-time Imaging af NO • Signaler i enkeltceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H.,… More

Eroglu, E., Rost, R., Bischof, H., Blass, S., Schreilechner, A., Gottschalk, B., Depaoli, M. R., Klec, C., Charoensin, S., Madreiter-Sokolowski, C. T., Ramadani, J., Waldeck-Weiermair, M., Graier, W. F., Malli, R. Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO•) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO• Signals in Single Cells. J. Vis. Exp. (121), e55486, doi:10.3791/55486 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter