This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
Nitrogenoxid (NO •) er en lille gruppe, som medierer flere forskellige vigtige cellulære funktioner i pattedyr, bakterier og planter. På trods af eksistensen af et stort antal metoder til påvisning NEJ • in vivo og in vitro, real-time overvågning af NO • på enkeltcelle-niveau er meget udfordrende. De fysiologiske eller patologiske virkninger af NO • bestemmes af den faktiske koncentration og opholdstiden for denne gruppe. Følgelig metoder, der tillader enkeltcelle-påvisning af NO • er særdeles ønskelige. For nylig udvidede vi pallen af NO • indikatorer ved at indføre enkelt fluorescerende protein-baseret genetisk kodet nitrogenoxid (NO •) prober (geNOps), der direkte reagerer på cellulære NO • udsving og dermed rettet mod dette behov. Her demonstrerer vi brugen af geNOps at vurdere intracellulære NO • signaler som reaktion på to forskellige kemiske NEJ • -liberating molekyler. Vores resultater also bekræfter, at frisk fremstillet 3- (2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino) -N-methyl-1-propanamin (NOC-7) har en meget højere potentiale til at fremkalde ændringer i intracellulære NO • niveauer i forhold til den uorganiske NEJ • donor natriumnitroprussid (SNP). Endvidere blev tofarvet live-cell imaging anvendelse af de grønne geNOps (G-geNOp) og den kemiske Ca2 + indikator Fura-2 udført for at visualisere den stramme regulering af Ca2 + -afhængige NEJ • dannelse i enkelte endotelceller. Disse repræsentative eksperimenter viser, at geNOps er egnede redskaber til at undersøge realtid generation og nedbrydning af encellede NO • signaler i forskellige forsøgsopstillinger.
Vi har for nylig udviklet en ny klasse af genetisk indkodede fluorescerende NO • prober, kaldet geNOps 1. Disse sensorer består af en enkelt bygget, bakterie-afledt, NO • bindingsdomæne 2, som er konjugeret til et særskilt fluorescerende protein (FP) variant 3 (cyan, grønt eller orange FP). NO • binding til det ikke-hæm jern (II) center 4 inden for de geNOps vendte reducerer fluorescensintensitet 1. Vigtigere er det, geNOps fluorescens aflastning straks og fuldt når intracellulære NO • niveauet falder en. Derfor geNOps give real-time billeder af (under) cellulære NO • udsving. Selvom NO • sensing mekanisme geNOps fortsat uklare hidtil, har de vist sig at være fremragende NO • reportere, og dermed har styrken til at åbne op for en ny æra af polykromatisk, kvantitativ NEJ • bioimaging med høje rumlige og tidsmæssige resolutioner 1, 5. Andre tilgængelige fluorescerende Nej • sonder er baseret på små kemiske forbindelser, som skal indlæses i cellerne, og er uigenkaldeligt ændret af NO • 6. Yderligere ulemper ved INGEN • følsomme små fluoroforer er deres potentiale cytotoksicitet og relativt lav specificitet, som gør det vanskeligt at bruge dem i en pålidelig, analytisk og overbevisende måde 7, 8, 9. Selvom effektiv brug af genetisk indkodede fluorescerende prober forudsætter effektive genoverførselsteknikker, har FP-baserede genetisk indkodede sensorer opstået som uundværlige redskaber som har revolutioneret vores forståelse af den indre cellernes funktion 10, 11. Før udviklingen af de enkelte FP-baserede geNOps, et Förster resonans (FRET) -baserede NEJ • sensor, benævnt NOA-1 12, blev konstrueret. Sato et al. designet denne sofistikerede sonde, der består af to underenheder af NO • -følsom opløselig guanylatcyclase (SGC), både konjugerede at ærgre-baserede sensorer rapportering cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP) niveauer 12. Da denne sonde reagerer på cGMP, det kun indirekte registrerer intracellulære NO • udsving 12. Selvom NOA-1 reagerer på NO • stigninger i nano-molære sortiment, har dette værktøj ikke er blevet brugt hyppigt hidtil, sandsynligvis på grund af begrænsninger med hensyn til tilgængelighed og praktiske muligheder for denne omfangsrige todelte sensor.
Alsidige funktioner NEJ •, hvilket indvirkning grundlæggende biologiske processer er blevet godt karakteriseret 13, 14. Mange undersøgelser bevist, at NO • concentration i celler og subdomæner bestemmer celleskæbnen i sundhed og sygdomme 14, 15, 16. I pattedyr, NO • hovedsageligt genereres enzymatisk i forskellige celletyper ved velkarakteriseret nitrogenoxidsyntase (NOS) familie 17. Hidtil har tre isoformer af NOS blevet beskrevet 18, 19, 20; disse er de Ca2 + / calmodulin-afhængig endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 og neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, og Ca2 + / calmodulin-uafhængig konstitutivt aktiv inducerbar NOS (iNOS eller NOS- 2) 20. Desuden har tilstedeværelsen af mitokondrie NOS (mtNOS) også blevet foreslået 21. Dog mtNOS betragtes som en splejsning variant af nNOS, og er derfor ikke særskilt klassificeret som en isoform 21. En anden isoform, bortset fra de i pattedyrceller, er den såkaldte bakterielle NOS (bNOS), hovedsageligt findes i grampositive bakterier 22. Den enzymatiske produktion af NO • er meget kontrolleret og afhænger af tilgængeligheden af flere cofaktorer såsom nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH), flavinadenindinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylært oxygen og L-arginin 17. Den kationiske aminosyren L-arginin er det substrat, som omdannes til L-citrullin på NEJ • produktion 17. Foruden den meget reguleret enzymatisk dannelse af NO • er det blevet postuleret, at gruppen kan reduceres ikke-enzymatisk fra nitrit puljer af mitokondrier under hypoxiske betingelser 23. Når NEJ • produceres inden i en celle, kan det frit diffundere gennem biomembraner 14,ref "> 15. Men den meget korte halveringstid af denne radikale er hovedsageligt bestemt af de miljømæssige forhold, og forskellige veje og kemiske reaktioner effektivt nedbryde NO • niveauer 24. Til sidst, dannelse, diffusion, og nedbrydning af NO • afhænger på forskellige miljøparametre som bestemme den effektive koncentration af det stærkt biologisk aktive molekyle 24.
Den geNOps teknologi gør det muligt direkte påvisning af (sub) cellulære NEJ • udsving 1 og er derfor velegnet til at undersøge forholdet, og nyligt opdage de mekanismer, der er ansvarlige for opbygning og nedbrydning af cellulære NO • signaler. Her giver vi simple protokoller og repræsentative resultater for brugen af geNOps at visualisere exogent fremkaldte og endogent genererede NO • profiler på de enkelte celler. Endvidere kan geNOps teknologi tilpasses til apdelsen i andre celle modelsystemer til at studere de komplekse mønstre af NO • dannelse, diffusion, og nedbrydning som reaktion på forskellige cellulære stimuli og spændinger.
Siden opdagelsen af NO • som et vigtigt signalmolekyle i biologi 28 har realtids-måling af den radikale i enkelte celler, væv og hele dyr med høj opløsning i en gennemførlig og pålidelig måde blevet stræbt. Her rapporterer vi anvendelsen af nyligt udviklede genetisk kodet fluorescerende NO • prober (geNOps), der muliggør nøjagtig leve-cell imaging af NO • signaler ved hjælp wide-field fluorescensmikroskopi 1.
For at omgå kunstfærdige og invasive transfektion procedurer HEK-celle-klon, der stabilt udtrykker grønt fluorescerende G-geNOp blev anvendt til at kvantificere eksogent genererede encellede NO • profiler. Som HEK-celler normalt ikke producerer NO • endogent 29, denne celletype er egnet til generering af en geNOp-baserede sensor cellelinie, som kan være nyttigt til mange andre anvendelser i co-dyrkningsbetingelsermed NO • producerer primære celler eller endda i levende dyr 30. Men i denne undersøgelse viser vi kapaciteten af forskellige NEJ • -liberating forbindelser, af forskellige koncentrationer og stabiliteter, at fremkalde intracellulære NO • signaler under anvendelse af G-geNOp udtrykkende HEK-celle model. Vores data viste, at NO • -donor koncentration, kvalitet og anvendelsesmetode sidste ende bestemme mønstre af intracellulære NO • profiler. Sådanne oplysninger er uundværlige for in situ farmakokinetiske karakterisering af forskellige NO • donorer, som er tegn på flere sygdomme. Navnlig er geNOps blevet vist at stabilt svare til flere gentagne anvendelser af NO • -donor impulser over en meget lang tid 1. Følgelig er de eksperimenter med NEJ • -liberating forbindelser præsenteret heri, tillader semikvantitative konklusioner vedrørende de forskellige amplituder og kinetik respektive cellulære NO226; signaler (figur 1 og 2).
Selv om der stabilt udtrykker HEK celleklon formentlig stammer fra en enkelt celle, blev et bredt heterogenitet G-geNOps ekspressionsniveauer observeret (figur 1). Dette er et fælles træk ved stabile cellekloner som transkriptionen af (genomet-integrerede) genet af interesse er under kontrol af mange faktorer såsom forskellige miljøbelastninger 31, der påvirker cellevæksthastigheder 32, og cellecyklus status 33. Enkelt FP-baserede geNOps er ikke-ratiometriske prober og dermed NO • -inducerede tab af stigninger fluorescensintensitets med geNOp ekspressionsniveauet 1. Følgelig normalisering af geNOps signaler er afgørende for kvantificering cellulære NO • signaler navnlig i tilfælde af en komparativ analyse. Som det fremgår af vores seneste undersøgelse, en streng lineær korrelation between den basale fluorescensintensitet geNOps og styrken af NO • induceret fluorescens quenching over et bredt område af fluorescensintensiteter er fundet 1. Dette er et vigtigt element i geNOps for absolut kvantificering af cellulære NO • signaler. Som vist i figur 1, normalisering af G-geNOps signaler som reaktion på NOC-7 og SNP afslørede homogene NO • signaler i forskellige HEK-celler fra den samme plade, hvilket indikerer, at HEK-celler er ikke forskellige med hensyn til deres evne til at optage og forringe NO • radikal, der stammer fra NO • donor. I modsætning hertil ved hjælp geNOps i HeLa-celler påvist klare heterogeniteter af cellulære NO • signaler mellem forskellige celler som reaktion på NOC-7. Disse forskelle peger på celle typespecifikke NO • metabolisme og nedbrydning satser, som kan have flere konsekvenser i celle fysiologi og patologi, og kan afdækkes ved hjælp af geNOps teknologi.
Ikke desto mindre er to vigtige elementer i geNOps har skal overvejes nøje for korrekt brug af sensorer og data fortolkninger: i) geNOps kræver tilstrækkelig jern (II) til fuldt ud at besvare NEJ • 1, og ii) afhængigt af FP variant kan geNOps være pH-følsomme 1. Her beskriver vi en protokol, der har vist sig at være egnet til den ikke-toksiske jern (II) supplering af geNOps, som er udtrykt i enten HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se protokol 2.6). Mens det er blevet påvist, at celle behandling med jern (II) / C-vitamin påvirkede ikke cellemorfologi, cellelevedygtighed og metabolisk aktivitet af celler 1, kan det være nødvendigt at optimere dette vigtige skridt for andre celletyper og væv. Men i nogle eksperimentelle betingelser, kan kravet om jern (II) loading begrænse anvendelsen af geNOps. Især er det blevet vist, at ascorbat kan reducere NO • 35 og ascorbat-jern (II) komplekser er i stand til at fjerne NO • 36, 37. Desuden kan overskydende jern (II) og ascorbat inducerer inflammatoriske responser 39 og frakoble eNOS 41. Sådanne virkninger skal overvejes, når du bruger geNOps teknologi. Det har vist sig, at under visse eksperimentelle betingelser, er den intracellulære pH påvirkes markant 34, som har potentiale til at påvirke geNOps fluorescens en. Især de cyan og grønne geNOps varianter er relativt pH-følsom viser et fald på fluorescens ved forsuring 1. Derfor kan akutte ændringer i (sub) cellulære pH simulere falske INGEN • signaler ved brug af pH-følsomme geNOps. Som foreslået i vores tidligere arbejde, den parallelle anvendelse af NO • ufølsomme geNOps (geNOps mut) som negativ controls anbefales at dissekere ægte cellulære NEJ • signal fra pH ændrer en. Desuden kan inspiceres cellulær pH-ændringer ved hjælp pH-sonder som SYPHER 34.
Yderligere har vi visualiseret den endogene enzymatiske NO • dannelse som reaktion på en fysiologisk Ca2 + -mobilizing agonist i endotelcelle surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellelinie er et hyppigt anvendt modelsystem konsekvent udtrykker eNOS 38. Anvendelse af geNOps transient udtrykt i EA.hy926-celler, bekræftede, at IP3-medieret Ca2 + signaler fremkalde dybe NO • dannelse i denne celletype, som blev næsten fuldstændig blokeret af L-NNA. For at tidsmæssigt korrelere Ca2 + med nej • signaler, blev G-geNOp-udtrykkende celler fyldt med UV-exciteres kemisk Ca2 + -indicator fura-2 / AM. Den spektrale adskillelse af Ca2 + bundne og ubundne fura-2 fluo rescence fra G-geNOp signal kan let opnås med kommercielt tilgængelige filtersæt 40. Imaging begge prober afslørede, at Ca2 + -triggered enzymatisk NO • dannelse forekommer meget langsommere sammenlignet med den cytosoliske Ca2 + stigning i denne endothelcelletype. Lignende kinetik af encellede NO • signaler i endotelceller fra bovin pulmonal upon celle behandling med IP3 -generating agonist bradykinin, samt forskydningsspændinger er blevet rapporteret under anvendelse NOA-1, en indirekte stærkt NEJ • -følsom sensor 12 . Følgelig data understrege, at Ca2 + -evoked eNOS-afledte NO • formation kræver en vis starttidspunkt indtil hele enzymatiske aktivitet er nået. Selv kinetikken for cellulær NO • dannelse, diffusion og nedbrydning kan ekstraheres fra andre data, fx spændinger-baserede målinger af NO • -induceret karrelaksationss = "xref"> 26, den store fordel ved fluorescerende INGEN • sonder er, at de direkte konvertere cellulære NO • udsving i synlige signaler i real-tid. Derfor billedbehandling cellulære INGEN • signaler med geNOps giver høj rumlig og tidsmæssig opløsning, og tilbyder unikke muligheder i (gen) undersøge (sub) cellulære NEJ • homeostase. For eksempel imaging eNOS shuttling 42 i kombination med den geNOps teknologi i enkelte endotelceller kan være egnet til at korrelere NEJ • formation med den subcellulære lokalisering og translokation af NO • producerende enzym eller andre relevante proteiner, såsom calmodulin og caveolin 43.
Her beskriver vi den praktisk anvendelse af G-geNOp udtrykker HEK og EA.hy926 celler til at visualisere eksogent og endogent genereret cellulære NO • signaler på single-celle-niveau og i realtid på en konventionel bredt felt fluorescens microscope. Vores data indebærer, at geNOps er velegnede til specifikt at spore (under) cellulære NO • dynamik under forskellige eksperimentelle betingelser ved hjælp af alle former for interessante celletyper.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |