This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO•) probes (geNOps) to monitor single cell NO• fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO• formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.
Kväveoxid (NO •) är en liten radikal, som förmedlar flera viktiga cellfunktioner hos däggdjur, bakterier och växter. Trots förekomsten av ett stort antal metoder för att detektera NEJ • in vivo och in vitro, är mycket utmanande den realtidsövervakning av NO • vid enkelcellnivån. De fysiologiska eller patologiska effekterna av NO • bestäms av den verkliga koncentrationen och uppehållstid för denna radikal. Följaktligen metoder som gör att den encelliga detektering av NO • är mycket önskvärda. Nyligen utökade vi pallen av NO • indikatorer genom att införa enda fluorescerande protein-baserade genetiskt kodade kväveoxid (NO •) prober (geNOps) som direkt svara på cellulära NO • fluktuationer och därmed tar detta behov. Här visar vi användning av geNOps att bedöma intracellulära NO • signaler som svar på två olika kemiska NO • -liberating molekyler. Våra resultat also bekräfta att nyframställd 3- (2-hydroxi-1-metyl-2-nitrosohydrazino) -N-metyl-1-propanamin (NOC-7) har en mycket högre potential att framkalla förändringar i intracellulära NO • nivåer jämfört med den oorganiska NO • donator natriumnitroprussid (SNP). Vidare tvåfärgad levande cell imaging med hjälp av gröna geNOps (G-geNOp) och kemiska 2+ indikatorn Ca fura-2 utfördes för att visualisera den snäva reglering av Ca2 + -beroende NO • formation i enstaka endotelceller. Dessa representativa experiment visar att geNOps är lämpliga verktyg för att undersöka realtidsgenerering och nedbrytning av encelliga NO • signaler i olika experimentella uppställningar.
Vi har nyligen utvecklat en ny klass av genetiskt kodade fluorescerande NO • prober, kallade geNOps 1. Dessa sensorer består av en helt enkelt byggd, bakterier härledda, NEJ • bindande domän 2, som är konjugerad till en distinkt fluorescerande protein (FP) variant 3 (cyan, grönt eller orange FP). NO • bindning till icke-heme järn (II) centrum 4 inom de geNOps omedelbart minskar fluorescensintensiteten 1. Viktigt, återvinner geNOps fluorescens snabbt och fullständigt när intracellulära NO • nivån sjunker 1. Följaktligen geNOps tillåter realtid avbildning av (under) cellulära NO • fluktuationer. Även NO • avkänning mekanism för geNOps förblir oklara så länge har de visat sig vara utmärkta NO • reportrar, och därmed har styrkan att öppna upp en ny era av polykromatisk, kvantitativ NO • bioimaging med höga rumsliga och tidsmässiga resolutioner 1, 5. Andra tillgängliga fluorescerande Nej • sonder baserade på små kemiska föreningar, som måste laddas in i celler, och irreversibelt modifierade av NO • 6. Ytterligare nackdelar med NO • känsliga små fluoroforer är deras potentiella cytotoxicitet och relativt låg specificitet som gör det svårt att använda dem på ett tillförlitligt, analytisk och avgörande sätt 7, 8, 9. Även om effektiv användning av genetiskt kodade fluorescerande prober kräver effektiva genöverföringstekniker har FP-baserade genetiskt kodade sensorer framträtt som oumbärliga verktyg som har revolutionerat vår förståelse av den inre funktionen hos celler 10, 11. Innan utvecklingen av den inre FP-baserade geNOps, en Förster resonansenergiöverföring (FRET) -baserade NO • sensor, benämnd NOA-en 12, konstruerades. Sato et al. utformat denna sofistikerade sond som består av två subenheter av NO • -känsliga lösligt guanylatcyklas (SGC), båda konjugerade att gräma-baserade sensorer rapporterar cykliskt guanosinmonofosfat (cGMP) -nivåer 12. Eftersom denna sond svarar på cGMP, endast indirekt känner det intracellulära NO • fluktuationer 12. Även NOA-1 svarar på NO • höjder i nano molar intervall, har detta verktyg inte använts ofta så långt, förmodligen på grund av begränsningar när det gäller tillgänglighet och användbarhet av denna skrymmande tvådelad sensor.
Mångsidiga funktioner av NO •, som påverkar grundläggande biologiska processer har väl karakteriserade 13, 14. Många studier visat att NO • concentration inom celler och underdomäner bestämmer cellens öde i hälsa och sjukdomar 14, 15, 16. I däggdjur, NO • huvudsakligen genereras enzymatiskt i olika celltyper genom väl karakteriserade kväveoxidsyntas (NOS) familj 17. Hittills har tre isoformer av NOS beskrivits 18, 19, 20; dessa är de Ca2 + / calmodulin-beroende endotel NOS (eNOS eller NOS-3) 18 och neuronal NOS (nNOS eller NOS-1) 19, och Ca2 + / calmodulin oberoende konstitutivt aktiv inducerbart NOS (iNOS eller NOS- 2) 20. Dessutom har förekomsten av mitokondriell NOS (mtNOS) också föreslagits 21. Dock är mtNOS betraktas som en splitsvariant av nNOS och därför inte separat klassificeras som en isoform 21. En annan isoform, bortsett från dem i däggdjursceller, är den så kallade bakterie NOS (bNOS), främst i grampositiva bakterier 22. Den enzymatiska produktionen av NO • är mycket kontrollerad och beror på tillgängligheten av flera kofaktorer såsom nikotinamidadenindinukleotid-fosfat (NADPH), flavinadenindinukleotid (FAD), tetrahydrobiopterin (BH4), molekylärt syre och L-arginin 17. Den katjoniska aminosyran L-arginin är substratet som omvandlas till L-citrullin på NO • produktion 17. Förutom den i hög grad reglerad enzymatisk alstring av NO • Det har postulerats att radikalen kan reduceras icke enzymatiskt från nitrit pooler från mitokondrier under hypoxiska betingelser 23. När NO • produceras i en cell, kan det fritt diffundera genom biomembran 14,ref "> 15. Men mycket kort halveringstid denna radikala bestäms huvudsakligen av miljöförhållanden och olika vägar och kemiska reaktioner försämra NO • nivåer 24 effektivt. Så småningom bildandet, diffusion och nedbrytning av NO • beror på olika miljöparametrar som bestämmer den effektiva koncentrationen av den starkt biologiskt aktiva molekylen 24.
Den geNOps tekniken gör det möjligt att direkt detektion av (sub) cellulär NO • fluktuationer 1 och är därför lämplig att ny undersökning, och nyligen upptäcka mekanismer som ansvarar för uppbyggnad och nedbrytning av cellulära NO • signaler. Här ger vi enkla protokoll och representativa resultat för användning av geNOps att visualisera exogent framkallat och endogent genererade NO • profiler, på nivån av enskilda celler. Vidare kan geNOps teknik anpassas för apkomplikation i andra cellmodellsystem för att studera de komplexa mönster av NO • bildning, diffusion och nedbrytning som svar på olika cellulära stimuli och påfrestningar.
Sedan upptäckten av NO • som en viktig signalmolekyl i biologi 28, har särskilda realtidsmätning av den radikala i enskilda celler, vävnader och hela djur med hög upplösning i en genomförbar och tillförlitligt sätt har strävat efter. Här rapporterar vi tillämpningen av nyutvecklade genetiskt kodade fluorescerande NO • sonder (geNOps) som möjliggör exakt live-cell imaging av NO • signaler med brett fält fluorescensmikroskopi en.
Att kringgå arbetade och invasiva transfektion förfaranden HEK-cellklon som stabilt uttrycker grönt fluorescerande G-geNOp användes för att kvantifiera exogent genererade encelliga NO • profiler. Som HEK-celler som normalt inte producerar NO • endogent 29, är denna celltyp lämpliga för genereringen av en geNOp-baserad sensor-cellinjen, som kan vara användbar för många andra applikationer i sam-odlingsbetingelsermed NO • producera primära celler eller till och med i levande djur 30. Men i denna studie visar vi kapaciteten hos olika NO • -liberating föreningar av olika koncentrationer och stabiliteter, att framkalla intracellulära NO • signaler med hjälp av G-geNOp uttryck HEK cellmodell. Våra data visar att NO • -donor koncentration, kvalitet och appliceringsmetoden så småningom bestämma mönster av intracellulära Nej • profiler. Sådan information är nödvändig för in situ-farmakokinetiska karakterisering av olika NO • givare, som är indikativa för flera sjukdomar. I synnerhet har geNOps visat sig stabilt svara på flera upprepade ansökningar av NO • -donor pulser under en mycket lång tid en. Följaktligen experiment med användning av NO • -liberating föreningar som presenteras häri, tillåter halv kvantitativa slutsatser om de olika amplituder och kinetik respektive cellulär NO226; signaler (fig 1 och 2).
Även om stabilt uttryck HEK-cellklon kommer troligen från en enda cell, var en bred heterogenitet G-geNOps uttrycksnivåer observerades (Figur 1). Detta är ett vanligt inslag i stabila cellkloner som transkriptionen av den (genomet integrerade) genen av intresse är under kontroll av många faktorer, såsom olika miljöpåfrestningar 31 som påverkar celltillväxttakten 32 och cellcykeln status 33. De enkels FP-baserade geNOps är icke-kvotmetriska prober och följaktligen NO • -inducerad förlust av fluorescensintensitet ökar med geNOp expressionsnivån 1. Följaktligen är en förutsättning för att kvantifiera cellulära NO • signaler särskilt i händelse av en jämförande analys normalisering av geNOps signaler. Som framgår av vår senaste studie, en strikt linjär korrelation Bindexets basalfluorescensintensiteten hos geNOps och styrkan av NO • -inducerad fluorescensdämpning över ett brett område av fluorescensintensiteter har funnit en. Detta är ett viktigt inslag i geNOps för absolut kvantifiering av cellulära NO • signaler. Som visas i figur 1, normalisering av G-geNOps signaler som svar på NOC-7 och SNP avslöjade homogena NO • signaler i olika HEK celler från samma tallrik, vilket indikerar att HEK celler inte varierande med avseende på deras förmåga att ta upp och försämra NO • radikal som härstammar från NO • donator. Däremot använder geNOps i HeLa-celler visade tydliga heterogeniteter av cellulära NO • signaler mellan olika celler som svar på NOC-7. Dessa skillnader pekar på celltyp-specifika NO • metabolism och nedbrytningshastigheten, vilket kan ha flera konsekvenser i cell fysiologi och patologi, och kan avslöjade med hjälp av geNOps teknik.
Ändå två viktiga egenskaper hos geNOps måste noggrant övervägas för korrekt användning av sensorerna och tolkningar data: i) geNOps kräver tillräcklig järn (II) till fullo svara på NO • 1 och ii) beroende på FP-varianten, geNOps kan vara pH känsliga 1. Här beskriver vi ett protokoll som har befunnits vara lämplig för icke-toxisk järn (II) komplettering av geNOps, som uttrycks i endera HEK, HeLa eller EA.hy926 celler (se protokoll 2,6). Även om det har visats att cell behandling med järn (II) / vitamin C påverkade inte cellmorfologi, cell viabilitet och metaboliska aktiviteten hos celler 1, kan det vara nödvändigt att optimera detta viktiga steg för andra celltyper och vävnader. Men i vissa experimentella förhållanden, kan kravet på järn (II) laddar begränsa tillämpligheten av geNOps. Särskilt har det visat sig att askorbat kan minska NO • 35 och askorbat-järn (II) komplexen kan rensar NO • 36, 37. Dessutom kan överskott av järn (II) och askorbat inducera inflammatoriska svar 39 och koppla isär eNOS 41. Sådana effekter måste beaktas vid användning av geNOps teknik. Det har visat sig att under vissa experimentella betingelser, är den intracellulära pH kraftigt påverkat 34, som har potential att påverka geNOps fluorescens en. Notably, cyan och gröna geNOps varianter är relativt pH-känsligt som visar en minskning av fluorescens vid surgöring en. Därför kan akuta förändringar av (sub) cellulär pH simulera falska Nej • signaler vid användning av pH-känsliga geNOps. Som föreslagits i vårt tidigare arbete, den parallella användningen av NO • okänsliga geNOps (geNOps mut) som negativ controls rekommenderas att dissekera verklig cellulär NO • signalen från pH ändrar en. Dessutom cellulära pH-förändringar kan inspekteras med hjälp av pH-sonder såsom Sypher 34.
Vidare visualiseras vi den endogena enzymatiska NO • bildning som svar på en fysiologisk Ca 2 + -mobilizing agonist i endotelcellen surrogat EA.hy926. Den EA.hy926 cellinje är ett ofta använt modellsystem konsekvent uttrycka eNOS 38. Användning av geNOps transient uttryckta i EA.hy926 celler, bekräftade att IP3 medierad Ca2 + signaler framkalla djupgående NO • bildning i denna celltyp, som nästan helt blockerad av L-NNA. För att temporärt korrelera Ca2 + med nej • signaler, var G-geNOp-uttryckande celler laddade med UV-exciterbara kemisk Ca2 + -indicator fura-2 / AM. Den spektrala separationen av den Ca2 + bundet och obundet fura-2 fluo rescence från G-geNOp signal kan lätt uppnås med kommersiellt tillgängliga filteruppsättningar 40. Imaging båda sonderna avslöjades att Ca2 + -triggered enzymatisk NO • bildning sker mycket långsammare jämfört med den cytosoliska Ca 2 + ökning av denna typ endotelceller. Liknande kinetik encelliga NO • signaler i endotelceller från bovin lungartären vid cellbehandling med IP 3 -generating agonist bradykinin, samt skjuvspänningar har rapporterats med hjälp av NOA-1, en indirekt starkt NEJ • -känsliga sensor 12 . Följaktligen är dessa uppgifter understryka att Ca2 + -evoked eNOS-härledd NO • bildning kräver en viss starttid tills hela enzymatisk aktivitet har uppnåtts. Även om kinetiken för cellulär NO • bildning, diffusion och nedbrytning kan utvinnas ur andra uppgifter, till exempel spänningsbaserade mätningar av NO • inducerad kärl avkopplingss = "xref"> 26, den stora fördelen med fluorescerande Nej • prober är att de direkt omvandla cellulära NO • fluktuationer i synliga signaler i realtid. Därför, imaging cellulär NO • signaler med geNOps ger hög rumslig och tidsmässig upplösning, och erbjuder unika möjligheter i (åter) undersöker (sub) cellulär NO • homeostas. Exempelvis avbildnings eNOS shuttling 42 i kombination med geNOps tekniken i enkla endotelceller kan vara lämpliga för att korrelera NO • bildning med subcellulära lokalisering och translokation av NO • -producerande enzym eller andra relevanta proteiner såsom kalmodulin och caveolin 43.
Här beskriver vi praktiskt tillämpning av G-geNOp uttrycker HEK och EA.hy926 celler för att visualisera exogent och endogent genererad cellulära NO • signaler på encelliga nivå och i realtid på en konventionell brett fält fluorescens microscope. Våra data antyder att geNOps är lämpliga att specifikt spår (under) cellulära NO • dynamik under olika experimentella förhållanden med hjälp av alla typer av intressanta celltyper.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge C.J. Edgell, Pathology Department, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA for providing the EA.hy926 cells. Author E.E. is supported by Nikon Austria within the Nikon-Center of Excellence, Graz and is a fellow of the Ph.D. program in Molecular Medicine at the Medical University of Graz. The researchers are also supported by the Ph.D. program Metabolic and Cardiovascular Disease (DK-W1226) of the Medical University of Graz. This work was also funded by the FWF project P 28529-B27. Microscopic equipment is part of the Nikon-Center of Excellence, Graz that is supported by the Austrian infrastructure program 2013/2014, Nikon Austria Inc., and BioTechMed, Graz.
NaCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3957.20 | sodium chloride |
KCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6781.1 | potassium chloride |
CaCl2 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | T885.1 | calcium chloride dihydrate |
MgCl2 .6H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2189.2 | magnesium chloride hexahydrate |
HEPES | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 9105.3 | 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid |
NaHCO3 | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8551.1 | sodium hydrogencarbonate |
KH2PO4 | Merck, Darmstadt, Germany | 104873 | potassium dihydrogen phosphate |
Na2HPO4 .2H2O | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4984.1 | sodium hydrogenphosphate dihydrate |
D(+)-Glucose monohydrate | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | >99.5%; for cell culture, endotoxin free; |
EGTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 3054.2 | ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid; calcium chelating agent |
NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 6771.1 | sodium hydroxide |
HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4625.1 | hydrochloric acid, fuming, 37% (~10 N) |
DMSO | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | dimethyl sulfoxide; highly polar, aprotic organic solvent |
L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | G2128 | (S)-2-Aminoglutaric acid |
DMEM, low glucose | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | D5523 | Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – low glucose; with 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
MEM Vitamin solution (100X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11120037 | 100x the vitamins found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
MEM Amino acids solution (50X) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11130036 | 50X the essential amino acids (except L-glutamine) found in the standard Minimum Essential Medium (MEM) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15140122.00 | antibiotics to prevent bacterial contamination of cell cultures |
Amphotericin B | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 15290026.00 | Gibco Amphotericin B contains 250 µg of amphotericin B (Fungizone) and 205 µg of sodium deoxycholate; prevents the contamination of cell cultures by yeast and multicellular fungi |
FCS | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10270106 | Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin |
PBS, pH 7.4 | Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010031.00 | phosphate-buffered saline |
Fura-2 (AM) | Teflabs, Austin, TX, USA | 102 | fluorescent cytosolic calcium indicators |
Histamine dihydrochlorid | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | H7250 | 2-(4-Imidazolyl)ethylamine dihydrochloride; IP3-generating agonist |
Nω-Nitro-L-arginine | Sigma Aldrich, Vienna, Austria | N5501 | N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoic acid; L-NNA; inhibitor of nitric oxide synthase |
NOC-7 | Calbiochem/Merck, Darmstadt, Germany | 487952 | 3-(2-Hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine; nitric oxide (NO) donor short half-life of NO release |
Sodium nitroprusside dihydrate | Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA | sc-203395A | sodium nitroferricyanide(III) dihydrate; nitric oxide releasing compound |
30-mm Cover slips | Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhön, Germany | 41001130 | glass cover slips, HECHT "Assistent", size 1, round, 30-mm, (VE: 100 pcs.) |
Iron(II) booster solution | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | Iron(II) containing physiological buffer for non toxic iron(II) loading of cells; http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/ |
G-geNOp plasmid | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | plasmid DNA encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product/g-genop/ |
G-geNOp AAV5 | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | adenovirus encoding green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/ |
G-geNOp sensor cell line | Next generation fluorescent imaging (NGFI), Graz, Austria | n.a. | human embryonic kidney cell line (HEK293) stably expressing green NO sensitive probe (G-geNOp); http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/ |
HEK293A cell line | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R70507 | subclone of human embryonic kidney cell line (HEK293) |
EA.hy926 cell line | American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Germany | CRL-2922 | somatic cell hybrid clone of human umbilical vein cell line with a thioguanine-resistant clone of A549 |
TILL iMIC | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | digital microscope |
Polychrome V monochromator | Till Photonics, Graefling, Germany | n.a. | ultra fast switching |
AVT Stingray F145B | Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germany | n.a. | Versatile CCD camera with Sony ICX285 EXview HAD sensor, IEEE 1394b |
alpha Plan Fluar 40 | Zeiss, Göttingen, Germany | n.a. | x40 objective |
dichroic filters | Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, USA | n.a. | GFP emitter 514/3 nm (515dcxr) |
ValveBank8 Controller | AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA | 01-08 | programmable perfusion system control unit |
BVC control | Vacuubrand, Wertheim, Germany | 727200 | Chemistry diaphragm pump ME 1C; vacuum pump for perfusion system |
ImageJ software | NIH Image | Java image processing program inspired by NIH Image. http://imagej.net/Welcome |