효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근
Summary
G4 Resolvase1는 G4 결합 단백질에 대한 소감보고 된 친화 G-quadruplex (G4) 구조에 결합 HeLa 세포에서 G4-DNA 풀기 활동의 대부분을 나타냅니다. 우리는 특히 촉매 활성 재조합 G4R1를 정화 친 화성 및 G4-Resolvase1의 ATP 의존 풀기 활동을 마구를 채우는 새로운 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
고차 핵산 구조는 모두 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역에서 형성 할 수있는 G-quadruplexes (G4를, G4 구조)라는 높은 열적으로 안정하다. 이 인간 게놈에> 375,000 추정 G4 형성 서열이 있고, 그들은 프로모터 영역, 번역되지 않은 지역 (UTRs)에 충실하고, 텔로미어 반복 내에서. 때문에 이러한 구조는 복제 및 전사와 같은 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이있는 경우에, 셀들을 관리하는 효소를 진화했다. 하나의 효소는 생화학 실험실 및 나가미네 등에 의해 공동으로 특징이었다 G4 Resolvase 1 (G4R1)입니다. 매우 긴밀하게 (낮은 오후 범위에서 K d 개) 모두 G4-DNA와 G4-RNA에 결합하는 것으로. G4R1는 헬라 세포 용 해물에서 G4-해결 활동의 대부분의 원인과 이후 텔로미어 대사, 림프 개발, 유전자 전사, 조혈 및 면역 감시의 역할을 내포하고있다. EF 할 수있는 능력분히 표현하고 촉매 활성 G4R1는 G4의 구조와 G4-해결 효소의 운동의 상호 작용에 더 통찰력을 얻기에 관심이 실험실을 위해 중요하다 정화. 여기, 우리는 재조합 G4R1 (rG4R1)의 정제에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 설명 된 절차는 C- 말단 히스티딘 표지 된 효소의 전통적인 선호도 기반 정제 바인딩 및 ATP- 고도로 활성 효소를 정제 G4-DNA를 긴장을 rG4R1 능력의 이용 인간 코돈 최적화 된 세균의 발현 포함 종속 용출 단계. 프로토콜은 또한 rG4R1의 효소 활성 G4-DNA를 푸는 정제 효소의 능력을 조사하여 측정하는 품질 관리 단계를 포함한다. 방법도 정제 rG4R1의 정량화를 허용 것이 기재되어있다. 이 프로토콜의 대체 적응이 논의된다.
Introduction
G4 구조는 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역 내에 형성 안정성이 높은 핵산 차 구조이다. G4 구조 훅 스틴 – 결합 상호 작용을 통해 안정화 크게 G4 구조 (1, 2)의 주목할만한 열적 안정성에 기여하는 가의 양이온 (예. K +와 + 나)와 중앙 공동 내에 결합을 조정한다. 초기 생물 정보학 연구는 인간 게놈> 375,000 "잠재적 인 G4 형성 모티브"3, 4 포함하는 것이 좋습니다. 최근의 연구 평가는 다른 연구는 인간 게놈 6 716310 별개의 잠재적 인 G4 형성 순서를 예측하면서 G4 주제의 수는 2-5 5 배 정도 높은 것이 좋습니다. G4는-형성하는 서열은 진화 적으로 보존 무작위로 분산되지 않습니다게놈. G4 주제는 유전자의 코딩 지역에서 농축되고, 모든 유전자 프로모터의 40 %의 위쪽으로는 G4 모티브 (7)를 포함한다. 흥미롭게도, 유전자의 G4 모티프의 농축 정도는 유전자의 기능을 제시하는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 현상에 관여하는 프로토 – 암 유전자 및 유전자는 종양 억제 유전자 8,9보다 G4 구조 훨씬 더 농축있다.
높은 열 안정성으로 게놈 전체에서 거의 어디에나 존재 상당히 중요한 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이, 상기 셀은 이러한 구조를 관리하기 위해 효소를 진화 것을 발견 놀랍지이다. 우리는 인간 (헬라) 세포 10 tetramolecular G4-DNA 해결 활동의 대부분의 소스로 특징으로 하나의 효소는 G4 Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1)입니다. 그 이후로,이 표시되어 그쪽으로t G4R1 단단히 바인딩 및 촉매 G4 결합 단백질 11, 12, 13에 대한 엄격한보고 된 KDS와 tetramolecular 및 단 분자 G4-DNA와 G4-RNA가 풀릴. 또한 G4R1의 G4 분해하는 활성 텔로미어 / 텔로 머라 생물학 11, 14, 15, 16, 전사 및 접합 17, 18, 19, 20, 개발 21 조혈 포함 생화학 및 세포 과정의 다양한 연루되었는지 (21), 및 면역 조절 22, 23. G4 시퀀스의 우세는 특히 게놈 및 다양한 휴대 페이지에 걸쳐 위치하고로G4R1 최근 표현 효율적이 단백질의 생화학 적 메커니즘과 동작을 밝히기 위해 rG4R1가 매우 중요 할 것이다 활성이 높은 정화 능력에 관여하는 연루되었는지 rocesses.
여기서 우리는 새로운 표현하고 효율적으로 활성 효소를 분리 rG4R1의 ATP 의존, G4-해결 활동을 활용 정화 방식 (그림 1)를 보여줍니다. G4R1 대한 경우와 같이,이 방식은, 효소 반응의 생성물은 더 이상 바인딩 기재되는 다른 ATP 의존성 핵산 효소를 정제하도록 채택 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 DHX36 유전자 산물, G4-Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1) (그림 1)의 분리를위한 고효율 발현, 정제 및 정량 방식을 나타냅니다. G4-DNA 접합 구슬에 대한 그의 태그 친 화성 코발트 친 화성 구슬 정화 및 효소 정제 :이 프로토콜은 두 개의 정제 단계를 사용합니다. 후자 단계는 rG4R1는 G4 구조물 가진 꽉 선호도 높은 특이성 및 풀림 촉매 활성을 활용하는 것을 독특하다. G4 구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 (JPV까지) 도자기 재단의 관대 한 선물을 포함하여, 우리의 재원을 감사드립니다 (PJS에) (PJS에) HealthGrant T32-CA079448 및 볼 주립 대학 시작 기금의 국립 연구소. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
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