G4 Resolvase1는 G4 결합 단백질에 대한 소감보고 된 친화 G-quadruplex (G4) 구조에 결합 HeLa 세포에서 G4-DNA 풀기 활동의 대부분을 나타냅니다. 우리는 특히 촉매 활성 재조합 G4R1를 정화 친 화성 및 G4-Resolvase1의 ATP 의존 풀기 활동을 마구를 채우는 새로운 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
효소 활성 G4 Resolvase1의 정화를위한 G-quadruplex DNA 화성 접근
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이 논문에서
요약
초록
고차 핵산 구조는 모두 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역에서 형성 할 수있는 G-quadruplexes (G4를, G4 구조)라는 높은 열적으로 안정하다. 이 인간 게놈에> 375,000 추정 G4 형성 서열이 있고, 그들은 프로모터 영역, 번역되지 않은 지역 (UTRs)에 충실하고, 텔로미어 반복 내에서. 때문에 이러한 구조는 복제 및 전사와 같은 세포 과정에 영향을 미칠 가능성이있는 경우에, 셀들을 관리하는 효소를 진화했다. 하나의 효소는 생화학 실험실 및 나가미네 등에 의해 공동으로 특징이었다 G4 Resolvase 1 (G4R1)입니다. 매우 긴밀하게 (낮은 오후 범위에서 K d 개) 모두 G4-DNA와 G4-RNA에 결합하는 것으로. G4R1는 헬라 세포 용 해물에서 G4-해결 활동의 대부분의 원인과 이후 텔로미어 대사, 림프 개발, 유전자 전사, 조혈 및 면역 감시의 역할을 내포하고있다. EF 할 수있는 능력분히 표현하고 촉매 활성 G4R1는 G4의 구조와 G4-해결 효소의 운동의 상호 작용에 더 통찰력을 얻기에 관심이 실험실을 위해 중요하다 정화. 여기, 우리는 재조합 G4R1 (rG4R1)의 정제에 대한 자세한 방법을 설명합니다. 설명 된 절차는 C- 말단 히스티딘 표지 된 효소의 전통적인 선호도 기반 정제 바인딩 및 ATP- 고도로 활성 효소를 정제 G4-DNA를 긴장을 rG4R1 능력의 이용 인간 코돈 최적화 된 세균의 발현 포함 종속 용출 단계. 프로토콜은 또한 rG4R1의 효소 활성 G4-DNA를 푸는 정제 효소의 능력을 조사하여 측정하는 품질 관리 단계를 포함한다. 방법도 정제 rG4R1의 정량화를 허용 것이 기재되어있다. 이 프로토콜의 대체 적응이 논의된다.
서론
G4 구조는 DNA와 RNA의 구아닌이 풍부한 지역 내에 형성 안정성이 높은 핵산 차 구조이다. G4 구조 훅 스틴 - 결합 상호 작용을 통해 안정화 크게 G4 구조 (1, 2)의 주목할만한 열적 안정성에 기여하는 가의 양이온 (예. K +와 + 나)와 중앙 공동 내에 결합을 조정한다. 초기 생물 정보학 연구는 인간 게놈> 375,000 "잠재적 인 G4 형성 모티브"3, 4 포함하는 것이 좋습니다. 최근의 연구 평가는 다른 연구는 인간 게놈 6 716310 별개의 잠재적 인 G4 형성 순서를 예측하면서 G4 주제의 수는 2-5 5 배 정도 높은 것이 좋습니다. G4는-형성하는 서열은 진화 적으로 보존 무작위로 분산되지 않습니다게놈. G4 주제는 유전자의 코딩 지역에서 농축되고, 모든 유전자 프로모터의 40 %의 위쪽으로는 G4 모티브 (7)를 포함한다. 흥미롭게도, 유전자의 G4 모티....
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프로토콜
G4-DNA 구조 1. 준비 rG4R1 (바이오틴 G4-DNA G-Quadruplex의 형성)의 정제에 사용되는
- 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 비오틴 3': 1 μmole 규모의 Z33-바이오라는 다음 DNA 올리고머를 주문. 비오틴 부분이 올리고머의 3 '말단에 있는지 확인합니다.
- 450 mM 트리스 - 염산 pH를 8, 25 mM의 EDTA, 2,500 밀리미터의 NaCl : 10 배 G4 버퍼를 준비합니다.
- 물 250 μL에 Z33 올리고머를 재현 탁 (도록 올리고머 농도는 ~ 2.5 mm 인 경우). 10 배 G4 버퍼의 25 μL를 추가하고 혼합한다. ~ 48 시간 동안 50 ℃에서 인큐베이션 올리고머.
- 짧게 응축 (~ 1000 XG, 10 초)을 수집 튜브를 스핀 다운. 높은 질량 ~ 50 μL를 추가, (H 2 O의 30 % 피콜) 친수성 폴리 사카 라이드와 섞는다. 10 % 아크릴 아미드 / 1X를 TBE / 10 % 글리세롤 겔 (: 16cm X 16cm X 1mm 겔 치수)를 붓는다. 겔 중합되면, 1 배 TBE 및 부하와 우물을 씻어균등 겔의 대부분에 걸쳐 형성 Z33-바이오 올리고머 (샘플 레인 로딩은 ....
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결과
이 프로토콜 (그림 1)는 일상적으로 거의 순수, 촉매 활성 rG4R1을 산출한다. rG4R1 0.013 μL 범위 (도 위에서 설명한 G4 활성 분석으로 분석으로서, - TAMRA 표지 tetramolecular G4-DNA 0.2 pmol의 50 %가 0.2 이내에 단량체로 변환되는 효소 활성의 척도로서, 이는 전형적으로 관찰 2). 정제 rG4R1의 쿠마 염색은 G4-DNA 구슬을 결합 할 수 및 ATP 의존에서 용출 능력을 유지하고 그 rG4R1를 절단 나타낼 수 ~ 75 kDa의에서 작은 오염 밴드, 예상되는 120 kDa의 크기로 단일 밴드를 나타냅니다 방법 (그림 3). 관심의 밴드는 단백질 표준 곡선에 대해 정량화하고,이 프로토콜은 일반적으로 세균 배양의 20 ~ 100 nm의 정제 효소 1 당 L 200 μL를 가져옵니다.
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토론
이 프로토콜은 DHX36 유전자 산물, G4-Resolvase1 (또한 RHAU 및 DHX36라고 G4R1) (그림 1)의 분리를위한 고효율 발현, 정제 및 정량 방식을 나타냅니다. G4-DNA 접합 구슬에 대한 그의 태그 친 화성 코발트 친 화성 구슬 정화 및 효소 정제 :이 프로토콜은 두 개의 정제 단계를 사용합니다. 후자 단계는 rG4R1는 G4 구조물 가진 꽉 선호도 높은 특이성 및 풀림 촉매 활성을 활용하는 것을 독특하다. G4 구조물 타이트 화성 (낮은 오후 범위 K D는) 상당히 비 - 특이 단백질의 존재를 감소시키는 G4 비드로부터 높은 염 (염화나트륨의 용해도 한계에 가까운) 세탁 전 용출을 허용한다. G4 구조물에 G4R1의 촉매 활성에는 ATP와의 MgCl 2를 첨가시 활성화 rG4R1 특정 용출을 허용한다. 이러한 2 단계의 정제 기법은 일관 고순도 생산대부분의 생화학 적 분석에 적합한 수량 rG4R1 (.......
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공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 (JPV까지) 도자기 재단의 관대 한 선물을 포함하여, 우리의 재원을 감사드립니다 (PJS에) (PJS에) HealthGrant T32-CA079448 및 볼 주립 대학 시작 기금의 국립 연구소. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비에 아무런 역할을하지 않았다.
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참고문헌
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- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H.
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재인쇄 및 허가
