Summary

نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

G4 Resolvase1 بربط (G4) هياكل G-quadruplex مع أشد تقارب الإبلاغ عنها من بروتين ملزمة G4 ويمثل غالبية النشاط الفك G4 الحمض النووي في خلايا هيلا. نحن تصف بروتوكول رواية تسخر تقارب والنشاط الفك ATP التي تعتمد على G4-Resolvase1 لتنقية تحديدا G4R1 المؤتلف نشاطا تحفيزيا.

Abstract

العليا الهياكل الحمض النووي تسمى G-quadruplexes (G4S، والهياكل G4) يمكن أن تشكل في المناطق جوانين الغنية على حد سواء DNA و RNA وهي غاية مستقرة حراريا. هناك> 375،000 المفترضة تسلسل تشكيل G4 في الجينوم البشري، ويتم إثراء هم في مناطق المروج والمناطق غير مترجمة (UTRs)، وخلال تكرار telomeric. نظرا لإمكانية هذه الهياكل تؤثر على العمليات الخلوية، مثل التكرار والنسخ، وتطورت الخلية الانزيمات لإدارتها. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase 1 (G4R1)، الذي كان كيميائيا شارك في تتميز مختبرنا ونغامين وآخرون. وجدت لربط بإحكام على حد سواء G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي (K د في المنخفض مساء المدى) للغاية. G4R1 هو مصدر معظم النشاط حل G4 في الخلية لست] هيلا ومنذ ذلك الحين تورط للعب دور في عملية التمثيل الغذائي التيلومير والتنمية الليمفاوية، النسخ الجيني، تكون الدم، والمراقبة المناعية. القدرة على EFficiently التعبير وتنقية نشاطا تحفيزيا G4R1 هو من أهمية للمختبرات المهتمة في الحصول على مزيد من التبصر في التفاعل الحركي هياكل G4 والإنزيمات حل G4. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لتنقية G4R1 المؤتلف (rG4R1). الإجراء الموضح يشتمل على تنقية التقليدية القائمة على تقارب من إنزيم الحامض الاميني الموسومة C-محطة أعربت في البكتيريا الأمثل كودون الإنسان مع الاستفادة من قدرة rG4R1 لربط وفك G4 الحمض النووي لتنقية انزيم نشط للغاية في ATP- خطوة شطف التابعة. ويشمل البروتوكول أيضا خطوة لمراقبة الجودة حيث يتم قياس النشاط الأنزيمي من rG4R1 عن طريق فحص قدرة الانزيم النقي للاسترخاء G4 الحمض النووي. ووصف الأسلوب أيضا أن يسمح لتقدير حجم rG4R1 تنقيته. وتناقش التعديلات بديلة من هذا البروتوكول.

Introduction

هياكل G4 هي هياكل الثانوية الحمض النووي مستقرة للغاية التي تشكل داخل الأقاليم جوانين الغنية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. واستقرت الهياكل G4 عبر التفاعلات Hoogsteen-الترابط والتنسيق الترابط داخل تجويف مركزي مع الكاتيونات الأحادي التكافؤ (أي. K + و + نا) التي تساهم إلى حد كبير في الاستقرار الحراري ملحوظا هياكل G4 1 و 2. وتشير دراسات المعلوماتية الحيوية في وقت مبكر أن الجينوم البشري يحتوي على> 375000 "الزخارف المكونة G4 المحتملة" 4. وتشير تقديرات عن دراسة حديثة أن عدد من الزخارف G4 أعلى بعامل 02-05 مايو، في حين تتوقع دراسة أخرى 716310 تسلسل تشكيل G4 المحتملة متميزة في الجينوم البشري 6. G4 تشكيل متواليات يتم حفظها تطويريا وليس فرقت عشوائيا فيالجينوم. يتم إثراء الزخارف G4 في المناطق ترميز الجينات، وأكثر من 40٪ من جميع المروجين الجين يحتوي G4 الزخارف 7. ومن المثير للاهتمام، وقد تجلى درجة تخصيب الزخارف G4 في جين تشير إلى وظيفة الجين. على سبيل المثال، بروتو الجينات المسرطنة والجينات المسؤولة عن تطوير لها تخصيب أكبر بكثير من الهياكل G4 من الجينات الكابتة للورم 8 و 9.

مع بثبات الحرارية العالية، وجود في كل مكان تقريبا في جميع أنحاء الجينوم، ويمكن أن يؤثر بشكل كبير العمليات الخلوية الرئيسية، فمن غير المستغرب أن نجد أن الخلية قد تطور من الأنزيمات لإدارة هذه الهياكل. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase1 (G4R1، ويسمى أيضا RHAU وDHX36)، وهو ما وصفها بأنها مصدر لغالبية tetramolecular G4 الحمض النووي النشاط حل في خلايا (هيلا) الإنسان 10. ومنذ ذلك الحين، فقد تبين ثار G4R1 بإحكام الربط وحفزي بالمرافعة tetramolecular وunimolecular G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي مع أشد KDS ذكرت لبروتين ملزمة G4 11 و 12 و 13. بالإضافة إلى ذلك، فقد نسب النشاط، حل G4 من G4R1 في مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية والخلوية، بما في ذلك التيلومير / التيلوميراز علم الأحياء 11، 14، 15، 16، النسخ والربط 17، 18، 19، 20، والتنمية 21، تكون الدم 21، والمناعة اللائحة 22، 23. مع كثرة متواليات G4 تقع تحديدا في جميع أنحاء الجينوم وص الخلوية المتنوعةrocesses أن G4R1 تم مؤخرا تورط في المشاركة مع والقدرة على التعبير وتنقية نشطة للغاية وrG4R1 تكون ذات أهمية قصوى لتوضيح الآليات والسلوكيات الحيوية من هذا البروتين بكفاءة.

هنا، علينا أن نظهر التعبير الرواية ونظام تنقية (الشكل 1) أن يستفيد من لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد على والنشاط، حل G4 من rG4R1 لعزل بكفاءة الإنزيم النشط. ويمكن تكييف هذا المخطط لتنقية ATP التي تعتمد على أنزيمات الحمض النووي الأخرى التي نتاج رد فعل الأنزيمي لم يعد الركيزة ملزمة، كما هو الحال بالنسبة لG4R1.

Protocol

1. إعداد الهياكل G4 الحمض النووي لاستخدامها لتنقية rG4R1 (تشكيل البيروكسيديز G4 الحمض النووي G-Quadruplex) تأمر قليل وحدات التالية الحمض النووي، ودعا Z33-بيو، على نطاق μmole-1: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG غا GGA عقاري GGA CCT البيوتين 3 ". تأكد من أ…

Representative Results

هذا البروتوكول (الشكل 1) ينتج بشكل روتيني نقية تقريبا، نشاطا تحفيزيا rG4R1. كإجراء والنشاط الأنزيمي، وعادة ما وحظ أن يتم تحويل 50٪ من 0.2 بمول من المسمى طمرة-tetramolecular G4 الحمض النووي إلى أحادية ضمن 0.2 – مجموعة ميكرولتر 0.013 من rG4R1، كما يعاير بواسطة فحص النشاط G4 المذكورة…

Discussion

ويمثل هذا البروتوكول على كفاءة عالية التعبير، وتنقية، ونظام القياس الكمي لعزل الجين المنتج DHX36، G4-Resolvase1 (G4R1، وتسمى أيضا RHAU وDHX36) (الشكل 1). هذا البروتوكول يستخدم خطوتين تنقية: صاحب العلامة تقارب تنقية على حبات تقارب الكوبالت وتنقية الأنزيمية على حبات G4 الحمض ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر مصادر تمويلنا، بما في ذلك هدية سخية من مؤسسة وير (لJPV)، والمعاهد الوطنية للHealthGrant T32-CA079448 (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين)، وصناديق بدء التشغيل جامعة الكرة الدولة (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

Materials

TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl pH=8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or From standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH=8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate  Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or From standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

References

  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
  24. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  25. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).

Play Video

Cite This Article
Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

View Video