نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 بربط (G4) هياكل G-quadruplex مع أشد تقارب الإبلاغ عنها من بروتين ملزمة G4 ويمثل غالبية النشاط الفك G4 الحمض النووي في خلايا هيلا. نحن تصف بروتوكول رواية تسخر تقارب والنشاط الفك ATP التي تعتمد على G4-Resolvase1 لتنقية تحديدا G4R1 المؤتلف نشاطا تحفيزيا.
Abstract
العليا الهياكل الحمض النووي تسمى G-quadruplexes (G4S، والهياكل G4) يمكن أن تشكل في المناطق جوانين الغنية على حد سواء DNA و RNA وهي غاية مستقرة حراريا. هناك> 375،000 المفترضة تسلسل تشكيل G4 في الجينوم البشري، ويتم إثراء هم في مناطق المروج والمناطق غير مترجمة (UTRs)، وخلال تكرار telomeric. نظرا لإمكانية هذه الهياكل تؤثر على العمليات الخلوية، مثل التكرار والنسخ، وتطورت الخلية الانزيمات لإدارتها. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase 1 (G4R1)، الذي كان كيميائيا شارك في تتميز مختبرنا ونغامين وآخرون. وجدت لربط بإحكام على حد سواء G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي (K د في المنخفض مساء المدى) للغاية. G4R1 هو مصدر معظم النشاط حل G4 في الخلية لست] هيلا ومنذ ذلك الحين تورط للعب دور في عملية التمثيل الغذائي التيلومير والتنمية الليمفاوية، النسخ الجيني، تكون الدم، والمراقبة المناعية. القدرة على EFficiently التعبير وتنقية نشاطا تحفيزيا G4R1 هو من أهمية للمختبرات المهتمة في الحصول على مزيد من التبصر في التفاعل الحركي هياكل G4 والإنزيمات حل G4. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لتنقية G4R1 المؤتلف (rG4R1). الإجراء الموضح يشتمل على تنقية التقليدية القائمة على تقارب من إنزيم الحامض الاميني الموسومة C-محطة أعربت في البكتيريا الأمثل كودون الإنسان مع الاستفادة من قدرة rG4R1 لربط وفك G4 الحمض النووي لتنقية انزيم نشط للغاية في ATP- خطوة شطف التابعة. ويشمل البروتوكول أيضا خطوة لمراقبة الجودة حيث يتم قياس النشاط الأنزيمي من rG4R1 عن طريق فحص قدرة الانزيم النقي للاسترخاء G4 الحمض النووي. ووصف الأسلوب أيضا أن يسمح لتقدير حجم rG4R1 تنقيته. وتناقش التعديلات بديلة من هذا البروتوكول.
Introduction
هياكل G4 هي هياكل الثانوية الحمض النووي مستقرة للغاية التي تشكل داخل الأقاليم جوانين الغنية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. واستقرت الهياكل G4 عبر التفاعلات Hoogsteen-الترابط والتنسيق الترابط داخل تجويف مركزي مع الكاتيونات الأحادي التكافؤ (أي. K + و + نا) التي تساهم إلى حد كبير في الاستقرار الحراري ملحوظا هياكل G4 1 و 2. وتشير دراسات المعلوماتية الحيوية في وقت مبكر أن الجينوم البشري يحتوي على> 375000 "الزخارف المكونة G4 المحتملة" 3، 4. وتشير تقديرات عن دراسة حديثة أن عدد من الزخارف G4 أعلى بعامل 02-05 مايو، في حين تتوقع دراسة أخرى 716310 تسلسل تشكيل G4 المحتملة متميزة في الجينوم البشري 6. G4 تشكيل متواليات يتم حفظها تطويريا وليس فرقت عشوائيا فيالجينوم. يتم إثراء الزخارف G4 في المناطق ترميز الجينات، وأكثر من 40٪ من جميع المروجين الجين يحتوي G4 الزخارف 7. ومن المثير للاهتمام، وقد تجلى درجة تخصيب الزخارف G4 في جين تشير إلى وظيفة الجين. على سبيل المثال، بروتو الجينات المسرطنة والجينات المسؤولة عن تطوير لها تخصيب أكبر بكثير من الهياكل G4 من الجينات الكابتة للورم 8 و 9.
مع بثبات الحرارية العالية، وجود في كل مكان تقريبا في جميع أنحاء الجينوم، ويمكن أن يؤثر بشكل كبير العمليات الخلوية الرئيسية، فمن غير المستغرب أن نجد أن الخلية قد تطور من الأنزيمات لإدارة هذه الهياكل. واحدة من هذه الانزيم G4 Resolvase1 (G4R1، ويسمى أيضا RHAU وDHX36)، وهو ما وصفها بأنها مصدر لغالبية tetramolecular G4 الحمض النووي النشاط حل في خلايا (هيلا) الإنسان 10. ومنذ ذلك الحين، فقد تبين ثار G4R1 بإحكام الربط وحفزي بالمرافعة tetramolecular وunimolecular G4 الحمض النووي وG4 الحمض النووي الريبي مع أشد KDS ذكرت لبروتين ملزمة G4 11 و 12 و 13. بالإضافة إلى ذلك، فقد نسب النشاط، حل G4 من G4R1 في مجموعة واسعة من العمليات الكيميائية الحيوية والخلوية، بما في ذلك التيلومير / التيلوميراز علم الأحياء 11، 14، 15، 16، النسخ والربط 17، 18، 19، 20، والتنمية 21، تكون الدم 21، والمناعة اللائحة 22، 23. مع كثرة متواليات G4 تقع تحديدا في جميع أنحاء الجينوم وص الخلوية المتنوعةrocesses أن G4R1 تم مؤخرا تورط في المشاركة مع والقدرة على التعبير وتنقية نشطة للغاية وrG4R1 تكون ذات أهمية قصوى لتوضيح الآليات والسلوكيات الحيوية من هذا البروتين بكفاءة.
هنا، علينا أن نظهر التعبير الرواية ونظام تنقية (الشكل 1) أن يستفيد من لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد على والنشاط، حل G4 من rG4R1 لعزل بكفاءة الإنزيم النشط. ويمكن تكييف هذا المخطط لتنقية ATP التي تعتمد على أنزيمات الحمض النووي الأخرى التي نتاج رد فعل الأنزيمي لم يعد الركيزة ملزمة، كما هو الحال بالنسبة لG4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويمثل هذا البروتوكول على كفاءة عالية التعبير، وتنقية، ونظام القياس الكمي لعزل الجين المنتج DHX36، G4-Resolvase1 (G4R1، وتسمى أيضا RHAU وDHX36) (الشكل 1). هذا البروتوكول يستخدم خطوتين تنقية: صاحب العلامة تقارب تنقية على حبات تقارب الكوبالت وتنقية الأنزيمية على حبات G4 الحمض ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر مصادر تمويلنا، بما في ذلك هدية سخية من مؤسسة وير (لJPV)، والمعاهد الوطنية للHealthGrant T32-CA079448 (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين)، وصناديق بدء التشغيل جامعة الكرة الدولة (لنقابة الصحفيين الفلسطينيين). كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
References
- Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
- Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
- Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
- Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
- Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
- Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
- Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
- Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
- Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
- Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
- Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
- Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
- Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
- Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
- Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
- Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
- Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
- Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
- Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
- Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
- Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
- Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
- Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).
