जी -4 Resolvase1 एक जी -4 बाध्यकारी प्रोटीन के लिए यानी कथित आत्मीयता के साथ जी-quadruplex (जी -4) संरचनाओं को बांधता है और हेला कोशिकाओं में जी -4 डीएनए तनाव गतिविधि के बहुमत का प्रतिनिधित्व करता है। हम एक उपन्यास प्रोटोकॉल है कि समानता और जी -4-Resolvase1 की एटीपी निर्भर तनाव गतिविधि harnesses विशेष catalytically सक्रिय पुनः संयोजक G4R1 को शुद्ध करने का वर्णन है।
उच्च आदेश न्यूक्लिक एसिड संरचनाओं बुलाया जी quadruplexes (जी 4 एस, जी -4 संरचनाओं) दोनों डीएनए और आरएनए के गुआनिन समृद्ध क्षेत्रों में फार्म कर सकते हैं और अत्यधिक thermally स्थिर रहे हैं। वहाँ मानव जीनोम में> 375,000 ख्यात जी -4 के गठन दृश्यों रहे हैं, और वे प्रमोटर क्षेत्रों, ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTRs) में समृद्ध कर रहे हैं, और telomeric दोहराने के भीतर। इन संरचनाओं ऐसे प्रतिकृति और प्रतिलेखन के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए क्षमता के कारण, सेल उन्हें प्रबंधित करने के एंजाइमों विकसित किया गया है। ऐसा ही एक एंजाइम जी -4 Resolvase 1 (G4R1), जो biochemically हमारी प्रयोगशाला और Nagamine एट अल द्वारा सह-विशेषता थी है। और अत्यंत दोनों जी -4 डीएनए और (कम प्रधानमंत्री रेंज में कश्मीर घ) जी -4 शाही सेना को कसकर बाँध पाया। G4R1 हेला सेल lysates में जी -4 के समाधान गतिविधि के बहुमत का स्रोत है और तब से टेलोमेर चयापचय, लसीका विकास, जीन प्रतिलेखन, hematopoiesis, और प्रतिरक्षा निगरानी में एक भूमिका निभाने के लिए फंसाया गया है। एफई की क्षमताficiently व्यक्त करने और शुद्ध catalytically सक्रिय G4R1 जी -4 संरचनाओं और जी -4 के समाधान एंजाइमों की गतिज बातचीत में और अधिक जानकारी पाने में रुचि प्रयोगशालाओं के लिए महत्व का है। यहाँ, हम पुनः संयोजक G4R1 (rG4R1) की शुद्धि के लिए एक विस्तृत विधि का वर्णन है। वर्णित प्रक्रिया को शामिल किया गया एक सी टर्मिनल हिस्टिडीन टैग एंजाइम की पारंपरिक समानता आधारित शुद्धि rG4R1 की क्षमता के उपयोग के साथ मानव कोडोन अनुकूलित बैक्टीरिया में व्यक्त बाँध और खोलना जी -4 डीएनए एक ATP- में अत्यधिक सक्रिय एंजाइम को शुद्ध करने के लिए निर्भर क्षालन कदम है। प्रोटोकॉल भी एक गुणवत्ता नियंत्रण कदम जहां rG4R1 के enzymatic गतिविधि जी -4 डीएनए तनाव कम करने के लिए शुद्ध एंजाइम की क्षमता की जांच से मापा जाता है शामिल हैं। एक तरीका यह भी वर्णित है कि शुद्ध rG4R1 की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल के वैकल्पिक रूपांतरों चर्चा कर रहे हैं।
जी -4 संरचनाओं अत्यधिक स्थिर न्यूक्लिक एसिड माध्यमिक संरचनाओं कि डीएनए और आरएनए के गुआनिन समृद्ध क्षेत्रों के भीतर फार्म हैं। जी -4 संरचनाओं Hoogsteen संबंध बातचीत के माध्यम से स्थिर है और मोनोवैलेन्ट फैटायनों (यानी। कश्मीर + और ना +) उल्लेखनीय है कि जी -4 संरचनाओं 1, 2 की उल्लेखनीय थर्मल स्थिरता के लिए योगदान के साथ केंद्रीय गुहा के भीतर संबंध में समन्वय कर रहे हैं। प्रारंभिक जैव सूचना विज्ञान के अध्ययन का सुझाव है कि मानव जीनोम> 375000 "संभावित जी -4 के गठन रूपांकनों" 3, 4 में शामिल है। अधिक हाल के एक अध्ययन अनुमान के मुताबिक जी -4 रूपांकनों की संख्या 2-5 5 का एक पहलू से अधिक है, जबकि एक अन्य अध्ययन की भविष्यवाणी मानव जीनोम 6 में 716,310 अलग संभावित जी -4 के गठन दृश्यों। जी -4 के गठन दृश्यों evolutionarily संरक्षित कर रहे हैं और बेतरतीब ढंग में बिखरे नहींजीनोम। जी -4 रूपांकनों जीन कूट क्षेत्रों में समृद्ध कर रहे हैं, और सभी जीन प्रमोटरों के 40% से अधिक की जी -4 रूपांकनों 7 होते हैं। दिलचस्प है, एक जीन में जी -4 रूपांकनों के संवर्धन की डिग्री जीन के समारोह के लिए सुझाव है कि प्रदर्शन किया गया है। उदाहरण के लिए, प्रोटो-ओंकोजीन और जीन के विकास में शामिल ट्यूमर शमन जीन 8, 9 की तुलना में जी -4 संरचनाओं की काफी अधिक संवर्धन की है।
उच्च तापीय stabilities के साथ, जीनोम भर में लगभग एक सर्वव्यापी उपस्थिति, और संभावित काफी प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए, यह unsurprising लगाने के लिए कि सेल एंजाइमों विकसित किया गया है इन संरचनाओं का प्रबंधन है। है, जो हम मानव (हेला) कोशिकाओं 10 में tetramolecular जी -4 डीएनए को हल करने गतिविधि के बहुमत के स्रोत के रूप में होती है, ऐसे ही एक एंजाइम जी -4 Resolvase1 (भी RHAU और DHX36 बुलाया G4R1) है। तब से, यह दिखाया गया है Thaटी G4R1 कसकर बांध और catalytically tetramolecular और unimolecular जी -4 डीएनए और एक जी -4 बाध्यकारी प्रोटीन 11, 12, 13 के लिए यानी कथित KDS के साथ जी -4-आरएनए unwinds। इसके अतिरिक्त, G4R1 के जी -4 के समाधान गतिविधि टेलोमेर / टेलोमिरेज जीव विज्ञान 11, 14, 15, 16, प्रतिलेखन और splicing 17, 18, 19, 20, विकास 21, hematopoiesis सहित जैव रासायनिक और सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत रेंज में फंसाया गया है 21, और प्रतिरक्षा विनियमन 22, 23। जी -4 दृश्यों के एक प्रमुखता विशेष जीनोम और विविध सेलुलर पी भर में स्थित के साथrocesses कि G4R1 हाल ही साथ, एक्सप्रेस और कुशलता से जैव रासायनिक तंत्र और इस प्रोटीन के व्यवहार elucidating के लिए अत्यधिक सक्रिय rG4R1 अत्यंत महत्व का हो जाएगा शुद्ध करने की क्षमता शामिल होना फंसाया गया है।
यहाँ, हम एक उपन्यास अभिव्यक्ति और शुद्धि योजना (चित्रा 1) कि rG4R1 की एटीपी निर्भर, जी -4 के समाधान गतिविधि का लाभ लेता है कुशलता से सक्रिय एंजाइम को अलग-थलग करने के लिए प्रदर्शित करता है। यह योजना, अन्य एटीपी निर्भर न्यूक्लिक एसिड एंजाइमों जिसके लिए enzymatic प्रतिक्रिया के उत्पाद अब बाइंडिंग के लिए एक सब्सट्रेट है शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता G4R1 के लिए मामला है।
इस प्रोटोकॉल एक अत्यंत कुशल अभिव्यक्ति, शुद्धि, और मात्रा का ठहराव DHX36 जीन उत्पाद, जी -4-Resolvase1 (G4R1 भी RHAU और DHX36 कहा जाता है) (चित्रा 1) के अलगाव के लिए योजना का प्रतिनिधित्व करता है। कोबाल्ट आत्मीयता के मनको?…
The authors have nothing to disclose.
, HealthGrant T32-CA079448 (PJS करने के लिए), और गेंद राज्य विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (PJS करने के लिए) के राष्ट्रीय संस्थानों हम अपने धन स्रोतों का शुक्रिया अदा करने के लिए, वेयर फाउंडेशन (JPV करने के लिए) से एक उदार उपहार सहित चाहते हैं। funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।
TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
70% Ethanol | From standard source | ||
Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
Thermometer | From standard source | ||
PCR strip tubes | From standard source | ||
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
Gel-loading tips | From standard source | ||
Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
Thermal cycler | From standard source | ||
Liquid Nitrogen | From standard source | ||
Dry ice | From standard source | ||
Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
Razor blades | From standard source | ||
Filter paper and funnel | From standard source | ||
Glass casserole dish | From standard source | ||
Orbital shaker | From standard source | ||
Kimwipes | From standard source | ||
Clear sheet protectors | From standard source | ||
Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
Microsoft Excel | Or equivalent |