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Biochemistry

对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法

doi: 10.3791/55496 Published: March 18, 2017
* These authors contributed equally

Summary

G4 Resolvase1结合G-四(G4)的结构与一个G4结合蛋白的紧密报道的亲和力,并表示在HeLa细胞中的大多数G4-DNA解旋活动。我们描述了线束的亲和力和G4-Resolvase1的ATP依赖的平仓活动,特别是净化催化活性的重组G4R1一个新的协议。

Abstract

高阶核酸结构称为G-四链(台G4,G4结构)可以在DNA和RNA的富含鸟嘌呤区形成并且是高度热稳定的。有在人类基因组> 375000推定G4形成的序列,它们在启动子区域,非翻译区(UTR)富集和端粒重复内。由于对这些结构以影响细胞过程,如复制和转录的潜力,所述细胞已演变的酶来管理它们。一种这样的酶是G4解离1(G4R1),将其生化共同特征在于我们的实验室和长峰等。并发现极紧到两个G4-DNA和G4-RNA(K d。在低PM范围)结合。 G4R1是多数在HeLa细胞裂解物的G4分辨活性的来源,并一直牵连发挥端粒代谢,淋巴开发,基因转录,造血和免疫监视作用。 EF英孚的能力ficiently表达和纯化催化活性G4R1是重要的,针对有意获得进一步的深入了解G4结构和G4-解决酶的动力学相互作用实验室。在这里,我们描述了重组G4R1(rG4R1)的提纯的详细方法。所描述的过程结合的C-末端组氨酸标记的酶的传统的基于亲和纯化在具有rG4R1的能力利用人密码子优化的细菌中表达结合和放松G4-DNA的纯化高活性酶在ATP的依赖洗脱步骤。该协议还包括其中rG4R1的酶活性是通过检查纯化的酶的放松G4-DNA的能力测得的质量控制步骤。的方法还描述了允许纯化rG4R1的量化。该协议的另类改编进行了讨论。

Introduction

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G4结构是DNA和RNA的富鸟嘌呤区域内形成高度稳定的核酸的二级结构。 G4结构通过Hoogsteen碱基接合相互作用来稳定,并与一价阳离子( K +和Na +),该显著有助于G4结构1,2的显着热稳定性的中心空腔内坐标粘接。早期的生物信息学研究表明,人类基因组包含> 375000“潜在G4形成的图案”3,4。最近的研究估计表明,G4基序的数目是由2-5 5倍以上,而另一项研究预测在人类基因组6 716310不同电位G4形成的序列。 G4形成序列进化上保守的,而不是随机地分散在基因组中。 G4图案富集基因编码区,以及所有基因启动子的40%以上含有G4图案7。有趣的是,在一个基因的G4基序的富集的程度已被证明表明该基因的功能。例如,参与发展原癌基因和基因比抑癌基因8,9 G4结构显著更大的富集。

具有高的热稳定性,在整个基因组中的几乎无处不在,并且显著影响主要的细胞过程的潜力,这是令人吃惊地发现,细胞已经发展酶来管理这些结构。一种这样的酶是G4 Resolvase1(G4R1;也称作RHAU和DHX36),我们表征为在人类(HeLa细胞)细胞10多数tetramolecular G4-DNA解析活性的来源。自那时以来,它已被证明塔吨G4R1紧密结合并催化开卷tetramolecular和单分子G4-DNA和G4-RNA与用于G4结合蛋白11,12,13中的紧密的报告的KDS。此外,G4R1的G4分辨活性已经牵涉在广泛的生物化学和细胞过程,包括端粒/端粒酶生物学11,14,15,16,转录和剪接17,18,19,20,发展21,造血21,及免疫调节22,23。用G4序列占优势的特别位于整个基因组和不同的对细胞processes该G4R1最近已经牵连用,表达和有效地净化活性高rG4R1将是极为重要的为阐明该蛋白的生化机制和行为的能力有关。

在这里,我们证明了一种新的表达而这需要rG4R1的ATP依赖性,G4-解决活动的优势,以有效地分离活性酶的纯化方案( 图1)。该方案可以适用于纯化其它ATP依赖性核酸酶的量,酶反应的产物是不再结合的基板,如为G4R1的情况。

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Protocol

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1. G4-DNA结构的制备用于rG4R1(生物素G4-DNA G-四的形成)的净化

  1. 订购以下的DNA寡聚体,称为Z33-生物,在1微摩尔规模:5'AAA GTG GTG ATG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT生物素3'。确保该生物素部分是在该低聚物的3'末端。
  2. 准备10X G4缓冲液:450毫米的Tris-HCl pH值为8,25毫摩尔EDTA,2500毫米氯化钠。
  3. 悬浮在水250微升的Z33寡聚物(以使低聚物浓度为〜2.5毫摩尔)。加入10X G4缓冲的25μL混匀。孵育所述低聚物在50℃下为〜48小时。
  4. 简要降速管收集冷凝(1000〜XG,10秒)。添加一个大质量的〜50微升,亲水性多糖(30%聚蔗糖在H 2 O)和混合。倒入10%的丙烯酰胺/ 1×TBE / 10%甘油凝胶(凝胶的尺寸:16×16cm的×1毫米)。一旦凝胶聚合,洗井1X TBE和负载所形成的Z33-生物寡聚物均匀地分布在大部分的凝胶(样品泳道加载可以与纹影线来可视化)。
    1. 在凝胶的末一条车道,装入已在98℃(这将作为一个非结构化对照)被加热10分钟的低聚物的一小部分,以及在另一个少量凝胶上样染料车道并监控多远凝胶已运行。
  5. 使用1×TBE为凝胶电泳缓冲液,并在120伏运行凝胶直到染料前沿已走过的凝胶中的至少1/3。
  6. 将带有在片保护其粗糙的侧面了薄层色谱板(或用保鲜膜覆盖)。取出玻璃板之一和凝胶转移到片材保护的表面上。关闭顶灯和紫外线的阴影凝胶(长波长:365nm)。使用新鲜刀片和切出的G-四-Z33-生物带,这将被看作是向上更高的凝胶运行(具有较慢迁移率)相对于熔融ED控制。
  7. 放置装有在50mL管中形成的G4-DNA的凝胶切片,并添加刚好足够的浸泡缓冲器以覆盖凝胶切片(浸泡缓冲液由1/3体积的10倍的TBE,1/3体积的饱和乙酸钠,和1/3的体积H 2 O)。发生在37℃培养箱(nonhumidified)管和孵育O / N。
  8. 将溶液转移到15毫升管中并(在10mM的Tris-HCl pH为8,2.5毫摩尔EDTA pH为8,和0.05%叠氮化钠的糖原股票以20毫克/毫升)添加1/10体积的糖原和〜1.2倍体积的异丙醇。
    注:叠氮化钠是剧毒,所以请谨慎使用!
    1. 混合,并放置该管在-20℃下为至少2小时。旋管2,700 XG在台式离心机中冷却至4℃持续12分钟。轻轻倒出从沉淀G4-DNA的溶液中。用70%的洗涤沉淀3次的EtOH + 50mM NaCl中(在洗涤所述盐为G4的稳定性临界)。吸走多余的液体用不起毛的纸巾。
  9. 地点在冰箱中洗涤沉淀至少2小时,以水合颗粒和允许更容易悬浮。重悬在TNE缓冲液50微升沉淀(10毫米的Tris-HCl pH为8,50毫摩尔NaCl和0.05毫摩尔EDTA pH8)中。
  10. 放置此形成的DNA G-四5μL的成H 2 0 495微升并通过使用分光光度计,允许消光系数以通过与进入低聚物的核苷酸组成(Z33 DNA寡聚体的消光系数来确定量化A = 8的碱基组成,C = 3,G = 15和T = 7是341946升/摩尔/厘米)。进入稀释因子为25(不是100)中,作为形成G-四由4股DNA。
  11. 分装量相当于每管并储存3的OD(OD 260单位)于-20℃;例如,如果加入到氧化氢的495微升5微升给出的OD 260读数的心情,然后准备5微升等分试样。

2. G4-DNA结构的制备在rG4R1的酶活性测定中使用(形成TAMRA标记G4-DNA)的

  1. 订购以下的DNA寡聚体,称为Z33-TAM,以1微摩尔规模:5'TAMRA-AAA GTG GTG ATG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3“。确保TAMRA部分是在低聚物的5'端。
  2. 按照相同的步骤,如第1用于形成G-四的,所不同的是紫外(UV)遮蔽概述是没有必要的,因为四甲(TAMRA)标记的G-四链将是用肉眼容易地看到。再次,确保包括凝胶上熔化的控制。
  3. 服用TAMRA标记的DNA G-四的分光光度计读数,如在步骤1之后,淡化形成G-四至0.2皮摩尔/微升用TNE缓冲液。最后,在-20℃添加甘油至10%的终浓度,并存储。

3.变换(DE3)pLysS中使用PTR感受态细胞iEx4-DHX36(质粒编码人类G4R1)和生长/诱导大量细菌培养

  1. 获取TriEx4-DHX36质粒。
  2. 分装的细菌进20微升等分试样,并将其存储在-80℃。分装的SOC培养基(2%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,10mM的氯化钠,2.5mM的氯化钾,10mM的MgCl 2的,10毫硫酸镁 ,和20mM葡萄糖)到80微升等分试样并储存在-80℃。
  3. 制备羧苄青霉素(CARB)/氯霉素(CAM)的LB-琼脂平板上。 CARB和CAM的库存浓度为50毫克/毫升的H 2 O和35毫克/毫升70%的乙醇,分别与这些是1000倍浓缩因此,最终的浓度在LB琼脂选择平板是50微克/毫升和35微克/毫升,分别。
  4. 置于冰上1等分试样的细菌,并放置1等分试样的SOC培养基在RT。添加pTriEx4-DHX36质粒1微克到细菌和枪头混合轻轻摇动。冰上孵育另外5分钟,然后热休克在42#176℃持续30秒。在冰上放置2分钟,并添加SOC培养基。
  5. 板在预热选择平板的转化的细菌(通常,板的小体积,如5 - 10μL,以确保低菌落密度,使得单个菌落可以容易地接种到大培养物)并在37℃CO / N孵育。
  6. 根据制造商的说明24制备了不起肉汤。让每大瓶500毫升(确保添加甘油)和高压在一个短周期的液体。
  7. CARB / CAM(50微克/毫升/ 35微克/毫升)添加到培养液,然后通过取琼脂块(使用P1000吸管)含有单个菌落和移液到肉汤接种培养物。摇动文化大力通气他们,然后在37°CO / N培养无晃动。
  8. 第二天,将培养物在37℃摇床并在〜225rpm下摇动。成长的文化,直到OD 600约为0.4 -0.6,其通常需要大约4 - 6小时,依赖于初始细胞密度。
    注意:这将需要通过分光光度读数周期性密度监测,这是至关重要的,以不能生长的培养物,以大大高于0.5的OD。作为一个空白分光光度读数,降速1毫升的细菌,并使用澄清肉汤的消隐方案。
  9. 一旦获得适当的OD 600,立即置于冰上文化并迅速将它们冷却到10℃。监视用擦拭干净,用70%的乙醇温度计的温度。通过快速旋转的同时在冰上烧瓶加速冷却,因为这将限制前重组蛋白诱导进一步的细菌生长。
  10. 添加IPTG到1mM的终浓度(〜120毫克/ 500毫升培养物),然后在80rpm摇动在14℃下〜17 - 18小时。对于蛋白质诱导提供了理想的温度已被发现是14℃;以最好地实现这一点,使用冷却水水浴摇床禄在一条常规冷室和手动检查用温度计水浴的温度。
    注意:可替换地,可以使用空气冷却的摇床/培养箱,尽管它需要测试通过孵育的水的烧瓶在它温度计和以80rpm摇动什么数字定形温度设定将得到所需的液体温度(测试这几个小时,达到)调整数字温度相应设置,直到14℃。
  11. 置于冰上文化和快速冷却,如第3.9步。取细菌的小等分试样并采取的OD 600读数;理想情况下,文化将有诱导期间翻了一番,达到约0.8 - 1.2 OD 600。
  12. 将细菌转移到500毫升离心管中,并用细菌培养到连管之间的重量手动平衡它们。一旦平衡,离心他们在3,840×g离心在4℃下20分钟。倒出汤汁澄清并冻结细菌像素在-80℃下让直到蛋白质纯化的时间。

4.人类rG4R1纯化

  1. 解冻及裂解细菌沉淀。
    1. 在解冻3毫升TN缓冲液的细菌沉淀在室温(TN缓冲由100毫米的Tris pH值7.5和50毫米氯化钠的)。拿在手,漩涡解冻瓶/重悬细菌沉淀。一旦解冻和相对均匀地悬浮,使体积达到5毫升缓冲TN(进一步悬挂可以通过上下吹打用5毫升吸管来完成)。
      注意:这是典型的解冻/准备2个或4瓶上制备的当天,根据与纯化过程的舒适用户的级别。
    2. 溶解20mg的溶菌酶在H 2 O 250微升(每个培养),并添加到再悬浮细菌。允许溶菌酶消化细菌〜5 - 10分钟,而在手纷飞的瓶子。
      注意:SU的颜色养老金将开始作为消化所得略微减轻,并且将悬浮液将是相对非粘性的。如果培养过于杂草丛生( 大于1.2的OD 600大得多),则染色体细菌DNA可以在此阶段导致不希望的粘度。
    3. 添加蛋白酶抑制剂(PIC)和亮肽素之一10μL等分的250微升。调匀。
    4. 置于冰上,加入10毫升冷TN缓冲和BME的22微升。转移到一个50毫升管中。
    5. 超声处理在冰上细菌用设置为30%的幅度的数字超声波仪。脉冲在2秒ON和2秒关1分钟。重复超声处理3次,使样品在冰上冷却超声处理步骤之间的至少2分钟。
      注:使用多种文化,超声处理每一个依次重复超声迭代之前。在超声,小心保持超声提示在细菌裂解液充分淹没了,但不触及日管电子侧,因为这会产生过多的热量。
    6. 加冷4X SSC PIC + 1等分亮肽素+ 20 + BME 50μL微升等体积(15毫升),并混合。
    7. 在台式离心机预冷却至4℃,离心裂解物2300×g离心20分钟。将上清转移至新鲜的,预冷的50 mL管(每大文化1管被坦然)。
  2. 制备G4磁珠。
    1. 取1毫升的链霉顺磁珠的(SPB)的悬浮液(每1升培养物),并将其转移到1.5mL微量离心管。沉淀SPB用磁体和在200微升洗2×用2X SSC + 5mM EDTA的pH为8重悬洗涤SPB用于洗涤珠粒的相同溶液。
    2. 添加G4-DNA(在第1制备Z33-生物G4)至SPB悬浮之一3 OD等分试样并通过上下抽吸几次快速混合。放置在旋转器上的管,并在室温旋转至少30分钟(和最多60分钟)。
    3. 前前后后呃这个时期的旋转,加入1毫升0.4%乳清蛋白阻断G4结合SPB,并保持在冰上直到需要。稀从4%乳清蛋白的库存使用1×Tris-甘氨酸0.4%的乳清蛋白。
      注:股票4%乳清蛋白(重量/体积)最初是由溶解制备的2M甘氨酸pH值7.5,与进一步添加1×PIC和0.05%的叠氮化钠。
  3. 绑定组氨酸标签rG4R1钴珠(CB)(来自步骤4.1待续)。
    1. 添加1毫升的CB浆液(相当于0.5毫升珠体积)的含有澄清的细菌裂解液各50毫升管中。在室温下孵育旋转器上20分钟。
      注:0.5毫升珠体积每1升澄清的裂解物的使用; 例如,如果准备了两个500毫升细菌培养物,只是从第二培养添加的CB含有从此时培养物中的一个澄清的裂解物的50毫升管中,作为裂解物将用相同0.5毫升的CB在ST被串行绑定EP 4.3.3)。
    2. 降速的CB在110×g离心5分钟以4℃台式离心机。小心吸出液体,并留下的液体几毫升,以便不干扰沉淀的CB。 15毫升冷4X SSC + BME的(BME /毫升4X SSC的0.5微升) - 10清洗。
      注:对于清洗,直接倒入10-15毫升到沉淀钴珠粒代替移液,如移液将导致珠粒卡住的吸管和蛋白质的内部将丢失。
    3. 通过离心再次沉淀CB,然后淋下澄清裂解液(30毫升,相当于第二大引起的细菌培养)到沉淀CB。在室温下孵育上旋转器另外20分钟,然后用10至15毫升4X SSC + BME的洗两次。粒料在110 xg离心在4℃下5分钟。
    4. 第二次洗涤后,吸出液体,并在管的底部留下约2mL珠/液体。通过转移蛋白质结合CB到预先冷却的2 mL管使用1毫升“大孔”枪头。
      注:使用新鲜刀片切断之前的前端传送结束时,如使用这种“宽孔”枪头将减少的蛋白质结合钴珠的损失。
    5. 以高速(〜18000 XG)在微量短暂离心在2毫升管中的珠在4℃下(〜5 - - 10 s是一切必要为快速制粒)。轻轻地取出并吹打弃去上清液,小心不要失去蛋白结合CB。
  4. 从CB洗脱rG4R1。
    1. 关于在冷室中进行5分钟的旋转孵育于0.5mL组氨酸的洗脱缓冲液(HEB)的CB。再次,添加HEB时,只吸取0.5毫升到珠(以消除CB损失),并通过反转所述管重悬珠子。 HEB是0.7M的L-组氨酸的pH 6(的pH用乙酸调整)。
    2. 离心机在4℃微量离心1分钟18000 xg离心。转移上清到预先冷却的15毫升管中。轻轻取出,并通过认真吸取转移含蛋白质的上清液,留下的少量液体对CB的顶部。
    3. 共计3 HEB洗脱重复步骤4.4.1和4.4.2。
    4. 用0.2M EDTA pH 6.0的洗脱一次;由于EDTA螯合的钴CB的颜色会由粉红变为白色。
    5. 在此之后第四个和最后的洗脱已转移到15毫升管中,通过使用在1毫升吸移管尖的端部的凝胶加载尖吸取来自CB残余洗脱缓冲液;由切入前端到管的底部,剩余含蛋白质的洗脱缓冲液可收集。
  5. 结合rG4R1至G4结合SPB和在一个ATP依赖的方式洗脱重组酶。
    1. 制备5×RES缓冲液:250mM的Tris-乙酸盐pH 7.8,250mM的氯化钠,2.5mM的MgCl 2的,和50%甘油。准备3倍RES缓冲液:0.915毫升的H 2 0,5倍的2毫升RES缓冲液,0.33毫升0.4%的乳清蛋白(D从用1×Tris-甘氨酸),0.010毫升BME的,0.015毫升的1M MgCl 2的,0.050毫升的PIC,以及0.010毫升亮肽素的4%乳清蛋白iluted。置于冰上。
      注:股票4%乳清蛋白(重量/体积)最初是由溶解制备的2M甘氨酸pH值7.5,与进一步添加1×PIC和0.05%的叠氮化钠。
    2. 粒料G4-SPB与磁铁在管的侧面并弃去上清液(G4-SPB,如在步骤4.2中制备)。加入1毫升的3倍RES缓冲到G4-SPB和吸管混合。
    3. 该吸取1毫升G4-SPB的悬浮在3倍RES缓冲区中含有〜2毫升HEB / EDTA含蛋白质的(洗脱步骤4.4)的15毫升管。在偶尔搅拌37℃水浴中孵育15分钟,所以珠不安定。
    4. 在冰上沉淀蛋白质结合G4-SPB到管的用磁体的一侧。要洗净,加1毫升4X SSC + 0.4%乳清蛋白(+ 0.5μL/ mL的BME)和吸管的重悬珠。颗粒珠伴t他磁铁放在冰上。重复此洗涤,总共洗涤2次。
      注:耐心洗涤程序过程中需要,以确保所有的磁珠已经洗涤之间沉淀。这是特别真实定溶液的粘度增加,由于包含在RES缓冲器的甘油。
    5. 用1毫升的3倍RES缓冲液洗G4-1X SPB。
    6. 制备的洗脱缓冲液(EB):0.5毫升3×RES缓冲液,0.1毫升0.1M的ATP和0.4毫升H 2 O
    7. 预暖1毫升的EB至37℃跨越设定为37℃的热循环仪的加热块分布下在PCR管。
    8. 颗粒G4-SPB在冰上磁铁重悬珠在100μL预热EB的。立即珠粒转移到预热的PCR管并在37℃下孵育30秒。
    9. 及时添加5M的NaCl 12μL和移液器上下大力20 - 30倍。包含在EB高盐和ATP的结合用于从G4珠洗脱rG4R1。
      注意:这是非常重要的,以减少在移液过程中形成的气泡的数量,气泡可使蛋白质变性。
    10. 立即用磁铁沉淀G4-SPB和含蛋白质的洗脱物转移到在冰上新鲜PCR管(标有日期)。
    11. 重复洗脱步骤4.5.8-4.5.10描述的转移;这个过程的最终产品是这样〜200微升的EB含有纯化rG4R1。预留二期7μL等分(在标有适当的日期PCR管)在质量控制酶活性测定,将测试是否高活性rG4R1确实已经纯化使用。
    12. 存储纯化rG4R1在-80℃,直至活性测定的时间。

5.纯化rG4R1质量控制酶活性测定

  1. 对于要检测rG4R1的各项准备,准备300微升解离测定缓冲液(RAB),其中每个30微升含0.2皮摩尔TAMRA标记Z33 G4-DNA的的(在步骤2中制备的);该RAB的构成是如下:0.1毫升3×RES缓冲液,0.01毫升0.2皮摩尔的/ h的微升G4-Z33-TAM,0.03毫升的0.1M ATP和0.16毫升2 O.在6的PCR的条带管,吸移管40微升的RAB到第一管和RAB的30微升到剩余管(保持管在冰上在这一点)。
  2. 检索7微升rG4R1等份(来自步骤4.5.11)中的一个,并将其放置在冰上。用P20移液管设置为5微升,轻轻吸取上下几次在等分试样并转移5μL的混合rG4R1至6的PCR管(包含40微升的RAB的一个)的条带的第一管。接着,移液管设置为10微升和10微升串行转移到含有RAB在剩余的PCR管中。
  3. 在37℃下立即孵育PCR管的这条为在热循环仪30分钟,随后4℃保持。打开管它们在4℃下保持,同时加入2微升的0.5M EDTA的pH为8到每个管(以停止酶反应)。
  4. 倒入10%的丙烯酰胺/ 1×TBE / 10%甘油凝胶。取出后梳,洗井1X TBE。加一个大质量的5微升,亲水性多糖(30%聚蔗糖的H 2 O)与每个管和负载从每个管15微升(可再次使用纹影线观察孔的装载)。
    1. 对于G4-DNA流动性的控制,加4μL较高的质量,亲水性多糖以20微升RAB和负载15μL;作为用于退绕单体Z33的控制,热20μL的RAB的在98℃下进行10分钟,加入一个高的质量,亲水性多糖,并且负载15微升4微升。
  5. 运行在120伏的凝胶用1X TBE为运行缓冲液2小时。图像上使用TAMRA特定的过滤器,用荧光成像能力的多式联运成像凝胶(激发与532纳米绿光激光器,并使用580纳米带通滤波器30(580 BP 30))。
    注:rG4R1的高活性制备将产生在被装载到凝胶上,作为如图2所示的第3泳道TAMRA标记Z33的完整分辨率。

6.高活性rG4R1的Preps,分装和存储池

:此步骤需要2人。数和纯化rG4R1将被用于在将决定有多少制剂之前等分需要下游测定的酶的要求。一个典型的大型制备由8个高活性制剂(因此共使用16诱导的500毫升细菌培养物)的池,但是这是一个任意数,是实验室特异性。

  1. 计算高度活性的,纯化rG4R1的总体积要被等分。通常情况下,7微升等分试样在下游测定中使用。填充热CYCL块器设置为4℃的条PCR管(这些将被分装到,作为该块的固体性质将加速的PCR条带的快速关闭)。
  2. -80检索含有高活性rG4R1 PCR管°C和快速解冻手管;当冰的量小在管留,将管在冰上。结合所有的快速解冻准备进入预冷,15毫升管拌匀,确保尽量减少泡沫。
  3. 使用自动重复移液管,分配所需等份体积成在热循环仪中预冷的PCR条管。一样很快1 - 2条完成后,有第二人关闭盖子,并将其传输到浮在液氮96孔晶片(闪存冻结要保持酶活性)。
    注意:不要把超过200 rG4R1的微升进入自动吸管尖在同一时间,以减少时间,这种酶是不是在4C。
  4. 一旦在热循环仪中预冷的PCR条管已经填充有等分并正确冻结,迅速从冰传输更多的预冷的PCR条管,以热循环仪并继续等分。以这种方式继续,直到所述酶的其余部分已经被等分,闪光在液氮中冷冻,并转移到干冰。最后,将等分试样转移至-80℃长期储存。

7.纯化rG4R1浓度定量

  1. 倾标准的5%堆积/ 12%解析丙烯酰胺/ SDS凝胶用于蛋白质的分离。
  2. 解冻约50分到rG4R1的微升,合并成一个管,拌匀。测量用吸管的确切体积,并添加2×Laemmli样品缓冲液等量(65.8毫摩尔Tris盐酸pH为6.8,26.3%(重量/体积)甘油,2.1%SDS和0.02%溴酚蓝)+ BME(50μL / 950微升2倍Laemmli缓冲液中)。变性在98℃的蛋白10分钟。
  3. 注:包含在宽范围分子量标记物每个蛋白质标准存在于0.1微克/微升,除了为50 kDa的蛋白,这是目前在0.3微克/微升。这些标记不需要被热变性。
  4. 除去从凝胶梳并用标准1X SDS /甘氨酸电泳缓冲液洗各孔。加载的25相当于和rG4R1(这是50和变性蛋白质的25微升)12.5微升,虽然酶加载的最佳量应该由用户来确定,作为酶制剂的浓度会有所不同( 例如,35微升装入图3)在凝胶上。装载在步骤7.3中制备的蛋白的标准。确保移液器正确校准,并确保作为possib那样精确乐与移液技术,保证精确的定量。
  5. 运行在120伏的凝胶直至染料前沿已穿过凝胶的大约2/3(以确保构成宽范围分子量标记蛋白质的适当的分离)。
  6. 取出凝胶,这将不通过切割其远用刀片含有蛋白质凝胶的部分的处理。放置在玻璃砂锅或等同容器中凝胶。染色用考马斯染料将凝胶(50毫克考马斯的R-250,每100毫升50:10:40体积/体积甲醇:乙酸:H 2 O已经通过一个滤纸漏斗过滤)O / N在室温在定轨摇床集,以确保凝胶充分搅拌。
  7. 以30:10:60 V / V甲醇德染色凝胶:乙酸:H 2 O使用揉成团行动,不起毛的纸巾加快脱色。根据需要更改脱色液。继续脱色直到背景足够低形象化rG4R1和蛋白质标准;在这个典型的凝胶阶段示于图3。
  8. 放置脱色凝胶在纸张保护件之间,并在≥300dpi的分辨率扫描凝胶。打开的图像分析软件程序的扫描图像(如富士Multiguage或等价物),并从对应于75,100中的蛋白质标准制备标准曲线和150 kDa的(曲线代表克量与密度计读数)。确保减去来自每个车道的背景获得密度测量值的过程中被量化。
  9. 假设已加载在凝胶上rG4R1的体积量含有蛋白质的量是这些标准曲线的线性范围内,每rG4R1微升蛋白质的克量装入可​​推知。
  10. 转换rG4R1的外推克量成使用G4R1,这为120,000克/摩尔的分子量的摩尔量。
    注:对于每个凝胶,三外推值将是生成(每个用于产生标准曲线三种蛋白标志的:75,100和150 kDa的)。运行两个进一步的凝胶和染色,并重复步骤7.1量化他们 - 7.10。与量化为第一凝胶的结果,用户将能够衡量rG4R1多少需要在进一步的凝胶加载,得到的量是蛋白质标准的线性范围内。总之,外推表示高活性的,纯化rG4R1的浓度九个值。平均这些值,得到最终批次特异性rG4R1浓度,通常是在20-100纳米的范围内。从这些值计算标准偏差(n = 9)。

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Representative Results

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该协议( 图1)经常产生几乎纯,催化活性rG4R1。作为酶活性的量度,它通常被观察到,0.2皮摩尔TAMRA标记tetramolecular G4-DNA的50%在0.2内转化成单体- rG4R1 0.013微升范围,由上述( 中概述的G4活性测定为测定2)。纯化rG4R1的考马斯染色在约75 kDa的,这可能代表截短rG4R1已保持其结合G4-DNA的珠和在ATP依赖洗脱能力表明在预期120 kDa的大小的单一条带,具有轻微的污染带方式( 图3)。感兴趣的频带对蛋白质标准曲线定量,该协议通常获得的20-100每1nM的精制酶升对细菌培养的200微升。

图1
图1:G4R1的两步净化的原理。一个6xHis标签rG4R1是批量纯化首先结合并从洗脱钴离子偶联珠从大肠杆菌裂解液。一个绑定步骤G4-DNA结合的磁珠如下。最后,ATP依赖性洗脱步骤是必要的,以获得相对较纯的和酶促活性rG4R1。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2:质量控制G4-DNA解旋试验。泳道1 - 6:TAMRA标记tetramolecular G4-DNA的浓度恒定在37℃的纯化rG4R1的4倍系列稀释的代表3.9微升,0.83微升,0.2微升,0.05微升,0.013微升存在下培养30分钟和0 0.003μL,分别为。泳道7:tetramolecular G4-DNA在没有rG4R1的。泳道8:tetramolecular G4-DNA煮沸,以减少在没有rG4R1的G4结构成单体。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:纯化rG4R1浓度的定量。宽范围分子量蛋白质标志物被装在以下数量:500,250,125,62.5,31.3,和15.7纳克在泳道1 - 分别为6,并用于产生蛋白质浓度的标准曲线。泳道7代表rG4R1的35微升。这个特定的凝胶进行定量,作为一式三份组凝胶的一部分,从而导致62±22纳米标准差的平均蛋白浓度(SD; N = 9)。.COM /文件/ ftp_upload / 55496 / 55496fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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该协议代表一高效表达,纯化,并定量为DHX36基因产物,G4-Resolvase1(G4R1,也称为RHAU和DHX36)( 图1)的隔离方案。这个协议利用两个纯化步骤:关于钴亲和珠His标签的亲和纯化和酶纯化上G4-DNA缀合珠。后者步骤是在,它需要在严密的亲和力,特异性高,以及催化退绕的活动,rG4R1具有G4结构优点是唯一的。对G4结构紧亲和性(在低PM范围ķ )允许高盐洗涤(邻近的NaCl的溶解度极限)之前洗脱从G4珠,大大降低非特异性蛋白的存在。 G4R1对G4结构的催化活性允许活性rG4R1的当加入ATP和MgCl 2的特定溶出。这两步净化方案一贯产生高纯度在适用于大多数生化分析数量的催化活性rG4R1 13。

几个关键步骤将确保高纯度,催化活性rG4R1良好的产量。首先是要保证在细菌表达菌株的His-rG4R1的适当诱导条件。我们已发现,当细胞生长至不超过0.4-0.6之前,为了诱导的OD 600发生重组蛋白质的最佳产率。生长细胞超过此点,可能导致蛋白质回收率的整体的损失,这可能是由于rG4R1掺入包涵体。其次,我们以“串联结合”的裂解物的钴亲和珠得到的纯化蛋白的浓度较高。例如,我们从0.5升诱导的培养,以钴亲和珠的结合的裂解物,然后进行另一裂解物的第二结合从一个附加0.5升培养物以相同的钴亲和珠。这个步骤确保通过增加结合于珠的给定体积rG4R1分子的数目,因此需要利用的钴亲和珠的全部容量蛋白的更浓缩的制剂。第三,钴亲和力洗脱结合到G4珠粒后高盐洗涤确保几乎所有的非特异性蛋白结合至珠被除去。第四,ATP / MgCl 2的洗脱步骤允许rG4R1结合至G4珠粒催化放松的tetramolecular结构成单链,从而导致rG4R1可以从珠释放。我们不能完全排除ATP洗脱rG4R1在竞争,而不是一个催化方式的可能性;然而,这是不太可能的情况下,由于我们先前已经表明,非水解的ATP类似物不足以竞争性结合13,18。 rG4R1为退绕的亲和性,单链DNA是一个数量级小于吨他开始tetramolecular G4-DNA,因此rG4R1不应重新绑定至珠。为了减少这种可能性,然而,该步骤应在37℃下进行,和洗脱体积应该从珠粒尽快分离。洗脱步骤重复两次,以确保最大的回收。如果下游应用要求是自由的DNA污染物的蛋白,我们建议的附加净化步骤,其中所述纯化制品重新结合到链霉抗珠粒,以便如果存在以除去任何生物素化的DNA。

我们已经发现,rG4R1是容易退化,如果在适当的条件不是整个协议保持。为了保持酶的完整性和活性,我们使用以下关键的保障。蛋白酶抑制剂保持整个纯化过程本。该协议是在4℃下进行,除非另有说明。该蛋白质是在1a的存在下进行纯化ctalbumin和β巯基乙醇。该协议是在及时(用于纯化在1天)进行。此外,我们已经发现,多种冻融的蛋白的活性产生不利影响,因此,我们等分蛋白为“一次性使用”7微升等份以下纯化并将其存储在-80℃。

虽然需要乳清蛋白的制剂中的存在,以保持该蛋白质的完整性和活性,如上述提到的,我们已经发现,这还可能妨碍下游应用。其他潜在的干扰分子中存在的纯化rG4R1制剂包括三磷酸腺苷,β巯基乙醇,和单挑链DNA。例如,我们已经发现这种蛋白质制剂必须与BIACORE分析不相容由于从缓冲部件的高背景信号。另外,在蛋白制剂乳清蛋白的存在排除了使用标准布拉德福德和BCA蛋白定量检测。然而,我们已经开发了一种替代基于凝胶的定量方法来规避此限制。

此纯化过程中,它利用G4R1的酶活性作为一种手段来特别净化它,使得这种方法与其他方法不同。例如,其他小组已经在昆虫细胞26表达FLAG标记rG4R1在人类细胞15,25或GST-标记rG4R1和分别FLAG-或GST亲和层析,纯化之。这些方法有在真核表达系统中所做相比,细菌表达系统的优点。发现得到的纯化GST-G4R1为G4结构估计杀敌值是更高的数量级14的订单比我们报道杀敌12,13。我们的属性THI以数值•差异与一个笨重GST标签与一个带6xHis标签相关联的差异,在翻译后修饰的细菌与所获取的程度和类型在来自这两个纯化方案得到的纯度的差异,以及不同昆虫表达系统。我们的方法具有超过上述替代方案具有明显的优势,因为该蛋白质的纯化在其酶活性直接铰链。因此,我们主要得到已折叠和修饰以维持其酶活性的方式的酶。其它亲和标签和/或大小排阻技术不能活性酶从酶死酶分离。到其他组的净化协议的长处结合15,25,26( 人类或昆虫细胞表达这将是对未来协议的开发有用离子系统)与我们的协议( 即,催化净化基础)的力量,在这种方法进一步提高。

虽然该协议是目前特异性G4R1,它可以容易地适应任何ATP依赖性,G4分辨蛋白,包括,但不限于,博莱霉素,WRN,FANCJ核蛋白蛋白质,hPif1,和/或ChlR1 / DDX1。通过改变核酸结合到链霉抗珠粒的序列,该协议可以适于纯化其它ATP依赖性核酸酶的量,酶反应的产物不再是酶的底物,包括核酸解旋酶和核酸酶。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

我们要感谢我们的资金来源,包括来自洁具基金会(以JPV)一份厚礼,HealthGrant T32-CA079448(到PJS)和鲍尔州立大学的启动资金(以PJS)全国学院。该资助者在研究设计,数据收集和分析,决定发表或准备手稿没有作用。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/mL in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl, pH 8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or from standard source
1 M Tris-HCl, pH 7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or from standard source
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH 6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH 7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or from standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or from standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH 8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or from standard source
0.2 M EDTA, pH 6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or from standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or from standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2 s ON/2 s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15 and 50 mL centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 mL) From standard source
500 mL centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

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References

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对酶活性G4 Resolvase1净化用G-四DNA亲和方法
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Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).More

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