Summary

גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

G4 Resolvase1 נקשר G-quadruplex (G4) מבנים עם זיקה המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב ומייצג את מרבית הפעילות ההתרה G4-DNA בתאים הלה. אנו מתארים פרוטוקול רומן שמנצל את הזיקה ופעילות התרה תלויה ATP של G4-Resolvase1 לטהר במיוחד קטליטית G4R1 רקומביננטי הפעיל.

Abstract

מהסוג-הגבוה-יותר מבני חומצות גרעין בשם G-quadruplexes (G4S, מבני G4) עלול להצטבר באזורים עתיר גואנין הוא DNA ו- RNA והם מאוד יציבות תרמית. ישנם> 375,000 רצפים G4 יוצרי המשוערת בגנום האנושי, והם מועשרים באזורי אמרגן, אזורים מתורגמים (UTRs), ובתוך חוזרי telomeric. בשל פוטנציאל מבנים אלה כדי להשפיע על תהליכים תאיים, כגון שכפול שעתוק, התא התפתח אנזימים כדי לנהל אותם. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase 1 (G4R1), אשר היה שותף מאופיין ביוכימית ידי מעבדה שלנו Nagamine et al. , ונמצא שהיא נקשרת בצורה חזקה ביותר לשני K בטווח הנמוך-PM) G4-דנ"א G4-RNA. G4R1 הוא המקור של רוב הפעילות-בפתרון G4 lysates התא הלה ומאז היה מעורב לשחק תפקיד במטבוליזם הטלומרים, פיתוח הלימפה, שעתוק גנים, hematopoiesis, ומעקב חיסוני. יכולת EFficiently להביע ולטהר קטליטית פעילה G4R1 היא בעלת חשיבות למעבדות מעוניינות להשיג תובנה נוספת לתוך האינטראקציה הקינטית של מבני G4 ואנזימים-בפתרון G4. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לטיהור רקומביננטי G4R1 (rG4R1). ההליך המתואר משלב את טיהור הזיקה המבוססת המסורתית של אנזים היסטידין מתויג בטרמינל C-הביעה בחיידקי קודון אופטימיזציה אדם עם הניצול של היכולת של rG4R1 להיקשר ולהירגע-DNA G4 לטהר אנזים פעיל מאוד בתוך ATP- צעד elution תלוי. הפרוטוקול כולל גם צעד בקרת איכות שבו הפעילות האנזימטית של rG4R1 נמדדת על ידי בחינת היכולת של האנזים מטוהר להירגע G4-DNA. שיטה גם מתוארת כי מאפשרת כימות של rG4R1 המטוהר. עיבודים אלטרנטיביים של פרוטוקול זה הם דנו.

Introduction

מבני G4 הם מבנים משניים מאוד יציבים חומצות גרעין היוצרים בתוך האזורים עשירים-גואנין של DNA ו- RNA. מבני G4 מיוצבים באמצעות אינטראקציות מליטות Hoogsteen ולתאם מליטה בתוך החלל המרכזי עם קטיונים חד ערכיים (כלומר. K + ו + Na) שתורמים משמעותי ליציבות התרמית המדהימה של מבני G4 1, 2. מחקרים ביואינפורמטיקה מוקדם הציע כי הגנום האנושי מכיל> 375,000 "מוטיבים G4 יוצרי פוטנציאל" 3, 4. עוד הערכות מחקר שנערך לאחרונה עולה כי מספר מוטיבים G4 גבוה בפקטור של 2-5 5, ואילו במחקר אחר צופה 716,310 רצפי G4 יוצרי פוטנציאל מובהק בגנום האנושי 6. G4 יוצרי רצפים שמורים באבולוציה ולא התפזרו באופן אקראיהגנום. מוטיבי G4 מועשרים באזורי קידוד גן, ולמעלה מ -40% מכלל יזמי הגן מכילים G4 מוטיבים 7. מעניין לציין, כי מידת העשרת מוטיבים G4 בגן הודגמה להציע את הפונקציה של הגן. לדוגמא, פרוטו-אונקוגנים וגנים מעורבים בפיתוח באופן משמעותי העשרה גדול של מבני G4 מאשר גני מדכאי סרטן 8, 9.

עם יציבות תרמית גבוהה, נוכחות בכל מקום כמעט לאורך הגנום, ואת הפוטנציאל להשפיע על תהליכים סלולריים גדולים משמעותי, אין זה מפתיע לגלות כי התא התפתח אנזימים לנהל את המבנים האלה. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase1 (G4R1; המכונה גם RHAU ו DHX36), אשר אפיינו כמקור של רוב פעילות בפתרון tetramolecular G4-דנ"א אנושי (הלה) תאים 10. מאז, הוכח that G4R1 ומסוגר המחבר ואת קטליטית unwinds ו tetramolecular unimolecular G4-דנ"א G4-RNA עם KDS המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב 11, 12, 13. בנוסף, הפעילות-בפתרון G4 של G4R1 הייתה מעורבת במגוון רחב של תהליכים ביוכימיים הסלולר, כוללים ביולוגיה הטלומרים / טלומרז 11, 14, 15, 16, שעתוק שחבור 17, 18, 19, 20, פיתוח 21, hematopoiesis תקנה 21, והמערכת החיסונית 22, 23. עם רצפים עליונים של G4 ממוקם במיוחד לאורך הגנום ואת p הסלולר המגווןrocesses כי G4R1 היה מעורב לאחרונה להיות מעורבים עם, היכולת להביע ולטהר ביעילות מאוד פעיל rG4R1 יהיה בעל חשיבות עליונה עבור הבהרת המנגנונים הביוכימיים והתנהגויות של חלבון זה.

הנה, אנחנו מדגימים ביטוי ברומן ואת ערכת טיהור (איור 1) שמנצל של ATP התלוי, הפעילות-בפתרון G4 של rG4R1 לבודד אנזים פעיל ביעילות. תכנית זו יכולה להיות מותאמת לטהר אנזימי חומצות גרעין תלוי ATP אחרים עבורו המוצר של התגובה האנזימטית הוא כבר לא מצע לכריכה, כפי שנהוג עבור G4R1.

Protocol

1. הכנת מבנים G4-DNA כדי לשמש עבור טיהור rG4R1 (כינונה של Biotinylated G4-DNA G-Quadruplex) הזמן את oligomer DNA הבא, שנקרא Z33-ביו, ביחס של 1 μmole מידה: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT ביוטין 3'. ודא כי מחצית ביוטין היא על 3 'סוף oligomer. <li style=";text-align:right;…

Representative Results

פרוטוקול זה (איור 1) מניב שגרתי כמעט טהור, rG4R1 פעיל קטליטית. כצעד של הפעילות האנזימטית, הוא ציין בדרך כלל כי 50% של 0.2 pmol של G4-DNA tetramolecular שכותרתו טמרה מומר מונומרים בתוך 0.2 – מגוון μL 0.013 של rG4R1, כפי assayed ידי assay פעילות G4 שתוארו לעיל (איור 2). Coomassie המכתים של מטוה?…

Discussion

פרוטוקול זה מייצג ערכת ביטוי, טיהור יעילה ביותר, וכימות עבור הבידוד של מוצר גן DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, המכונה גם RHAU ו DHX36) (איור 1). פרוטוקול זה מנצל שני צעדי טיהור: טיהור זיקת התג שלו על חרוזי זיקת קובלט וטיהור האנזימטית על חרוזי G4-DNA מצומדות. השלב האחרון הוא ייחודי בכך ש…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות מקורות המימון שלנו, כולל מתנה נדיבה מקרן ור (כדי JPV), המכונים הלאומיים HealthGrant T32-CA079448 (כדי PJS), וקרנות ההפעלה אוניברסיטת בול סטייט (כדי PJS). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl pH=8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or From standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH=8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate  Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or From standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

References

  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
  24. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  25. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).

Play Video

Cite This Article
Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

View Video