Summary

Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

Published: March 18, 2017
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Summary

G4 Resolvase1 lega a strutture G-quadruplex (G4) con ristretti affinità segnalato per una proteina G4 vincolanti e rappresenta la maggioranza dell'attività svolgimento G4-DNA in cellule HeLa. Descriviamo un nuovo protocollo che sfrutta l'affinità e l'attività svolgimento ATP-dipendente di G4-Resolvase1 per purificare specificamente G4R1 ricombinante cataliticamente attivo.

Abstract

strutture di acidi nucleici di ordine superiore chiamato G-quadruplex (G4S, strutture G4) si possono formare in regioni ricche di guanina sia di DNA e RNA e sono altamente stabili termicamente. Ci sono> 375.000 putativi sequenze G4 di formazione nel genoma umano, e si sono arricchiti in regioni promotrici, le regioni non tradotte (UTR), e all'interno della ripetizione telomerica. A causa del potenziale di queste strutture di influenzare processi cellulari, come la replicazione e la trascrizione, la cellula si è evoluta gli enzimi per la loro gestione. Un tale enzima è G4 Resolvase 1 (G4R1), che è stato co-biochimicamente caratterizzata dal nostro laboratorio e Nagamine et al. ed è risultata estremamente legano strettamente sia G4-DNA e G4-RNA (K d nella gamma bassa-PM). G4R1 è la fonte della maggior parte delle attività G4-risolvendo in lisati cellulari HeLa e da allora è stato implicato per svolgere un ruolo nel metabolismo dei telomeri, lo sviluppo della linfa, la trascrizione del gene, emopoiesi, e la sorveglianza immunitaria. La capacità di efficientemente esprimere e purificare cataliticamente attivo G4R1 è di importanza per i laboratori interessati ad approfondire la comprensione dell'interazione cinetica delle strutture G4 ed enzimi G4-risolvere. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per la purificazione di ricombinante G4R1 (rG4R1). La procedura descritta incorpora tradizionale purificazione per affinità basata su un enzima istidina-tag C-terminale espressa in batteri codone ottimizzato umani con l'utilizzo della capacità di rG4R1 di legare e distendersi G4-DNA per purificare enzima altamente attivo in una ATP- passo eluizione dipendente. Il protocollo comprende inoltre una fase di controllo di qualità in cui l'attività enzimatica di rG4R1 è misurata esaminando la capacità dell'enzima purificato per rilassarsi G4-DNA. Un metodo è anche descritto che consente la quantificazione purificato rG4R1. adattamenti alternativi di questo protocollo sono discussi.

Introduction

strutture G4 sono strutture secondarie altamente stabili di acido nucleico che si formano nelle regioni ricche di guanina del DNA e RNA. Strutture G4 sono stabilizzati tramite interazioni Hoogsteen-bonding e coordinare l'incollaggio all'interno della cavità centrale con monovalenti cationi (es. K + e Na +) che contribuiscono in modo significativo alla notevole stabilità termica delle strutture G4 1, 2. I primi bioinformatica studi hanno suggerito che il genoma umano contiene> 375.000 "potenziali G4 che formano motivi" 3, 4. Altre stime studio recenti suggeriscono che il numero di G4 motivi è superiore di un fattore del 2,5 5, mentre un altro studio prevede 716,310 potenziali sequenze distinte G4 formano nel genoma umano 6. G4-forming sequenze sono evolutivamente conservata e non disperse in modo casuale ingenoma. Motivi G4 sono arricchiti in gene regioni codificanti, e verso l'alto del 40% di tutti i promotori dei geni contengono G4 motivi 7. È interessante notare che il grado di arricchimento di motivi G4 in un gene è stata dimostrata per suggerire la funzione del gene. Ad esempio, proto-oncogeni e geni coinvolti nello sviluppo hanno significativamente maggiore arricchimento delle strutture G4 di geni oncosoppressori 8, 9.

Con le alte stabilità termica, una presenza quasi onnipresente in tutto il genoma, e il potenziale per influenzare in modo significativo i principali processi cellulari, non è sorprendente scoprire che la cellula si è evoluta enzimi per gestire queste strutture. Uno di questi enzimi è G4 Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36), che abbiamo caratterizzato come la fonte della maggior parte dei tetramolecular G4-DNA attività risolvere in (HeLa), le cellule umane 10. Da allora, è stato dimostrato that G4R1 ermeticamente lega e cataliticamente snoda tetramolecular e unimolecolare G4-DNA e G4-RNA con i più stretti KD riportato per una proteina G4 vincolante 11, 12, 13. Inoltre, l'attività G4-risolutivo G4R1 è stata implicata in un'ampia gamma di processi biochimici e cellulari, tra telomero / telomerasi biologia 11, 14, 15, 16, trascrizione e splicing 17, 18, 19, 20, di sviluppo 21, ematopoiesi 21, e immune regolazione 22, 23. Con una preponderanza di sequenze G4 situato specificamente nel genoma e diversificata p cellularerocesses che G4R1 è stato recentemente implicato di essere coinvolti con, la capacità di esprimere in modo efficiente e purificare altamente attiva rG4R1 sarà della massima importanza per chiarire i meccanismi biochimici e comportamenti di questa proteina.

Qui, dimostriamo un romanzo espressione e di schema di purificazione (Figura 1) che sfrutta l'ATP-dipendente, l'attività G4-risolutivo rG4R1 per isolare in modo efficace enzima attivo. Questo schema potrebbe essere adattato per purificare altri enzimi acido nucleico ATP-dipendente in cui il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato per il legame, come è il caso per G4R1.

Protocol

1. Preparazione delle strutture G4-DNA da utilizzare per la purificazione di rG4R1 (Formazione di biotinilato G4-DNA di G-quadruplex) Ordinare i seguenti oligomeri di DNA, denominato Z33-Bio, a 1 micromol scala: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'. Assicurarsi che la frazione biotina è alla 'fine della oligomero 3. Preparare 10x tampone G4: 450 mm Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, e 2.500 mM NaCl. Risospendere il oligomero Z33 in 250 ml di acqua (in modo che la …

Representative Results

Questo protocollo (Figura 1) produce ordinariamente quasi puro, rG4R1 cataliticamente attivo. Come misura dell'attività enzimatica, si osserva tipicamente che il 50% di 0,2 pmol di TAMRA marcato G4-DNA tetramolecular viene convertito in monomeri all'interno del 0.2 – gamma ml 0,013 di rG4R1 come dosati con il saggio di attività G4 sopra descritto (Figura 2). Coomassie colorazione dei purificato rG4R1 indica una singola banda al 120 dimensioni kDa previsto, con una banda di con…

Discussion

Questo protocollo rappresenta un'espressione, purificazione e quantificazione schema altamente efficiente per l'isolamento del prodotto genico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36) (Figura 1). Questo protocollo utilizza due fasi di purificazione: His-tag affinità purificazione su perline affinità cobalto e purificazione enzimatica su perline G4-DNA-coniugato. Quest'ultimo passo è unico in quanto sfrutta l'affinità stretta, alta specificità e l'attività catali…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare i nostri fonti di finanziamento, tra cui un dono generoso della Fondazione Ware (a JPV), Il National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (a PJS), e fondi di avvio Università Ball State (a PJS). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Materials

TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl pH=8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or From standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH=8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate  Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or From standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

References

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Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

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