के लिए एक आईएल -8 ट्रांस-ट्रांससीनाइज्ड माउस मॉडल Published: July 7, 2017 doi: 10.3791/55499

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Gabriella Bergamini*¹, Fabio Stellari*², Angela Sandri*³, Maria M. Lleo³, Gaetano Donofrio⁴, Francesca Ruscitti^5,2, Federico Boschi⁶, Andrea Sbarbati⁷, Gino Villetti², Paola Melotti⁸, Claudio Sorio¹

¹Department of Medicine, General Pathology Division, Cystic Fibrosis Translational Research Laboratory "D. Lissandrini", University of Verona, ²Corporate Preclinical R&D, Chiesi Farmaceutici S.p.A., ³Department of Diagnostic and Public Health, Microbiology Division, University of Verona, ⁴Dipartimento di Scienze Medico-Veterinarie, University of Parma, ⁵Department of Biomedical Biotechnological and Translational Sciences, University of Parma, ⁶Department of Computer Science, University of Verona, ⁷Department of Neurological, Biomedical and Movement Sciences, University of Verona, ⁸Cystic Fibrosis Regional Center (CFC), AOUI Verona

* These authors contributed equally

Summary

यहाँ वर्णित विधि गैर-इनवेसिव बिलीमिनेसेंस इमेजिंग (बीएलआई) के माध्यम से चूहों के फेफड़ों में आईएल -8 प्रमोटर-निर्भर सूजन सक्रियण के दृश्य के लिए अनुमति देता है। लुईफेरेज़ रिपोर्टर के निर्माण के समय से दो माह तक एक ही जानवर को BLI के अधीन किया जा सकता है।

Abstract

एयरवे सूजन अक्सर बैक्टीरिया के संक्रमण से जुड़ा होता है और फेफड़ों की बीमारी के एक प्रमुख निर्धारक का प्रतिनिधित्व करता है। विभिन्न कारकों की प्रो-भड़काऊ क्षमताओं के विवो निर्धारण में चुनौतीपूर्ण है और ब्रोन्कोलोविल्वर लव्ज जैसे टर्मिनल प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है और स्वस्थानी विश्लेषण के लिए फेफड़ों को हटाने, एक ही माउस में अनुदैर्ध्य दृश्यता को रोकना। यहां, फेफड़े की सूजन, स्यूडोमोनस एरुगिनोसा संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (एसएन) के अंतःस्थापूर्ण उत्तेजना के माध्यम से प्रेरित होती है, जो हेलरॉफेस आईएल -8 बोवाइन प्रमोटर के नियंत्रण में ल्यूइफेरेज़ रिपोर्टर जीन को अभिव्यक्त करती है। फेफड़ों में ल्यूसफेरेज अभिव्यक्ति की निगरानी इन्फिलेशन के बाद 2.5 से 48-एच समय-सीमा पर विवो बायोलिमिनेसेंट इमेज (बीएलआई) विश्लेषण में की जाती है। इस प्रक्रिया को 2 से 3 महीने के भीतर कई बार दोहराया जा सकता है, इस प्रकार एक ही चूहों में भड़काऊ प्रतिक्रिया के मूल्यांकन की अनुमति दी जा सकती हैताकि जानवरों को खत्म करने की आवश्यकता हो। यह दृष्टिकोण वास्तविक समय में फेफड़ों में अभिनय के समर्थक और विरोधी भड़काऊ कारकों की निगरानी की अनुमति देता है और कार्यात्मक और औषधीय अध्ययन के लिए उपयुक्त दिखाई देता है।

Introduction

गंभीर फेफड़ों के रोग, जैसे कि अस्थमा, क्रोनिक ऑब्स्ट्रक्टिव पल्मोनरी डिजीज (सीओपीडी), सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ), और ब्रोनिइक्टेसिसिस, एयरवे सूजन द्वारा विशेषता हैं। वायुमार्ग की सूजन एडिमा, सेलुलर घुसपैठ, टी लिम्फोसाइट और मस्तूल सेल सक्रियण, वायुमार्ग के स्राव में वृद्धि, और अत्यधिक कोलेजन बयान से होती है। सीएफ़ एक मल्टीसिस्टिम डिसऑर्डर है, और इसकी मृत्यु दर और रोग का मुख्य कारण फुफ्फुसीय उत्तेजना बढ़ने से बैक्टीरियल संक्रमण फैलता है। फेफड़ों के कार्य में गिरावट का अनुमान ^{1 , 2 , 3 , 4 के} मुकाबले काफी खराब परिणाम है।

श्वसन तंत्र की सूजन स्थिति आम तौर पर निचली और ऊपरी वायुमार्ग से उत्पन्न सामग्री में भड़काऊ प्रक्रिया के दौरान भर्ती प्रतिरक्षाविज्ञानी मार्करों के मूल्यांकन के माध्यम से देखी जाती है, जैसे थूक, जो चर रेज प्रदान करता हैults। ब्रोंकोस्कोपियां भी ⁵ प्रदर्शन कर रहे हैं मुरिन मॉडल, बीमारियों की सूजन की बीमारियों के रोगजनन और विकास की जांच के लिए मूल्यवान उपकरण हैं और जिनके लिए प्रभावी उपचार या इलाज अभी तक नहीं पहचाना गया है। फेफड़ों के संक्रमण और सूजन के पशु मॉडल का उपयोग अस्थमा और मेजबान-रोगजनन क्रियाकलापों का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसमें मानवीय स्थितियों ( जैसे, सिगरेट के धुएं का एक्सपोज़र, एलपीएस, इलास्टेज़, ओवलबिमिन, पाली I: सी, आदि) का अनुकरण करने वाली रसायनों की भूमिका शामिल है अच्छी तरह से ऊपर के संयोजन) ⁶ सूजन-संबंधी मापदंडों की माप के लिए जानवरों के बलिदान की आवश्यकता होती है, क्योंकि इनवेसिव दृष्टिकोणों की आवश्यकता होती है जैसे बैक्टीरियल लोड, फेफड़ों में साइटोकिन्स, और ब्रोन्कोलावियोलर लेवेज (बीएएल) तरल पदार्थ एकत्र किया जाता है। इसके अलावा, हिस्टोलॉजिकल परीक्षाएं अक्सर आवश्यक होती हैं भड़काऊ प्रतिक्रिया कैनेटीक्स पर जानकारी प्राप्त करने की संभावना के लिए num का उपयोग करना आवश्यक हैएरस चूहों इसलिए, एक ऐसी तकनीक जो जानवरों का त्याग करने की आवश्यकता के बिना ऐसी जानकारी प्राप्त करने की अनुमति देगी, तकनीकी, नैतिक, आर्थिक, और परिचालन आधार पर मूल्यवान है।

आईएल -8 सूजन प्रक्रिया में एक आवश्यक खिलाड़ी है, सूजन के ऊतकों को ल्यूकोसाइट्स की भर्ती करना। यह भड़काऊ मार्ग सक्रियण के अध्ययन के लिए एक आणविक रीड-आउट का प्रतिनिधित्व करता है। एमआईपी -2 और के.सी. चूहों में मानव आईएल -8 के कार्यात्मक होमोलॉग हैं। चूहे केवल एक संभावित आईएल -8 रिसेप्टर, मानव सीएक्ससीआर ^{2 7 , 8} का एक homolog व्यक्त करते हैं, लेकिन वे एक रिपोर्टर जीन को चलाए जाने वाले एक हेरट्रोगोज़ आईएल -8 जीन प्रमोटर को संशोधित करने में सक्षम हैं। अवलोकन के बाद हाल ही में एक फेफड़े की सूजन मूरीन मॉडल विकसित किया गया है कि एक गोजातीय आईएल -8 प्रमोटर / लुइसफेरेस रिपोर्टर का निर्माण चूहों में किया जा सकता है। यह सुविधा बीआईएलआईमेन्सेंस इमेजिंग (बीएलआई) के उपयोग के लिए अनुमति देता है जिससे कि जीवाणु में जीर्णोद्धार प्रतिक्रिया की निगरानी की जा सकेNimals ⁹

यह मॉडल जीवाणु exoproducts ( जैसे, एलपीएस या जीवाणु उपभेदों द्वारा जारी उत्पादों) या TNFalpha ^{10 , 11} द्वारा शुरू की सूजन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है। दवा की खोज की प्रक्रिया पुराने और नए विरोधी भड़काऊ अणुओं के विकास और अनुकूलन पर केंद्रित है जो सीएफ़, अस्थमा और सीओपीडी जैसी फेफड़ों के रोगों का इलाज कर सकती है। स्मार्ट नैदानिक ​​परीक्षणों के डिजाइन को सुविधाजनक बनाने के लिए इन नए रासायनिक इकाइयों को पशु मॉडल में शीघ्रता और आसानी से परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि विशिष्ट नैदानिक ​​फ़िनोटाइप से जोड़ा जा सके।

Protocol

वर्णित सभी जानवरों के प्रयोगों को वेरोना विश्वविद्यालय में इंटरपिपैण्टैनल सेंटर ऑफ़ एक्सपेरिमेंटल रिसर्च सर्विस द्वारा पशु प्रयोग के लिए प्रारंभिक पशु-कल्याण समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और यूरोपीय निर्देशक 2010/63 यूई, इतालवी डी.एल.जी. 26/2014 और संशोधित नेशनल एकेडमी प्रेस, 1996 "वाशिंगटन, डीसी:" देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड। यह प्रोटोकॉल और प्रयोग राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एन 273/15) द्वारा अनुमोदित किया गया था। जानवरों को मानक कृंतक चाउ और नरम नल का पानी तक मुफ़्त पहुंच प्रदान की गई थी और स्थानीय विवियरियम की स्थिति (कमरे के तापमान: 20-24 डिग्री सेल्सियस, सापेक्षिक आर्द्रता: 40-70%; हल्के-अंधेरे चक्र: 12 घंटे ) किसी भी उपचार से पहले

1. विवो जीन डिलिवरी में

1. विवो डिलीवरी अभिकर्मक / न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्स तैयार करने के लिए एक लामिनार प्रवाह हुड का उपयोग करें।
2. प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को परिभाषित करेंVivo निर्देशों के निर्माता के निम्नलिखित एन डी पैरामीटर।
   1. प्रति माउस 200 μL परिसरों की कुल इंजेक्शन मात्रा का उपयोग करें।
   2. अंतोटॉक्सिन मुक्त पानी में निलंबित 40 डीएनए डीएनए से शुरू; ऑप्टिमाइज़ेशन रेंज 60 μg तक पहुंच सकता है
      नोट: निर्माता के निर्देशों के अनुसार, इंजेक्शन मात्रा में न्यूक्लिक एसिड का अंतिम एकाग्रता 0.5 μg / μL से अधिक नहीं होना चाहिए।
   3. 6-8 के एक एन / पी अनुपात का उपयोग करें (न्यूक्लिक एसिड के माइक्रोग्राम प्रति डिलीवरी अभिकर्मक के 0.12 - 0.16 μL)। डिलीवरी अभिकर्मक के संबंधित मात्रा की गणना करें।
      नोट: परिसरों प्रभावी सेल प्रविष्टि के लिए cationic होना चाहिए। एन / पी अनुपात को न्यूवोलिक एसिड फॉस्फेट (पी) में विवो डिलीवरी अभिकर्मक पर नाइट्रोजन अवशेषों (एन) की संख्या के रूप में परिभाषित किया गया है और परिसरों के भीतर ईओण संतुलन के माप को दर्शाता है।
3. 5% ग्लूकोज में न्यूक्लिक एसिड की गणना की मात्रा को पतला (चरण 1.2.1 देखें) (अंतिम कॉन्टैक्टराशन) 10% ग्लूकोज स्टॉक समाधान (प्रदान) और बाँझ पानी का उपयोग कर। सुनिश्चित करें कि कमजोर पड़ने वाला वॉल्यूम आधा अंतिम इंजेक्शन मात्रा है। भंवर धीरे या ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
4. डिलीवरी अभिकर्मक की गणना राशि (देखें चरण 1.2.3) 5% ग्लूकोज (अंतिम एकाग्रता) के आधा इंजेक्शन मात्रा में 10% ग्लूकोज स्टॉक समाधान (प्रदान) और बाँझ पानी का उपयोग करें। भंवर धीरे से और 15 एस के लिए 13,000 xg पर स्पिन
5. पतला न्यूक्लिक एसिड के लिए उपरोक्त पतला डिलीवरी अभिकर्मकों को एक साथ में जोड़ें। कोमल भंवर द्वारा उन्हें मिलाएं और 15 एस के लिए 13,000 xg पर स्पिन करें
6. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 1.5 मिनट से मिश्रण को सेते हैं।
   नोट: इस बिंदु पर, परिसरों 4 घंटे के तापमान पर 4 घंटे के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने तक 7 दिनों तक स्थिर होते हैं।
7. कमरे के तापमान पर समतल किए गए परिसरों का उपयोग करते हुए पूंछ-नस इंजेक्शन करें माउस पूंछ को गर्म पानी में रखें (50 - 53 डिग्री सेल्सियस) 30 डिग्री के लिए नस फैलाव के लिए अनुमति दें।
   1. माउस को नियंत्रित करने के उपकरण के अंदर रखें। पूंछ नस में 27 से 30 गेज सुई को 20 - 30 डिग्री कोण में डालें और 200 μL धीरे धीरे इंजेक्षन करें। पूरा होने पर, सुई को हटा दें और इंजेक्शन साइट पर दबाव डालें।
      नोट: इंजेक्शन के दौरान पूंछ में एक मामूली उभार से गलत स्थिति का संकेत मिलता है। यदि ऐसा होता है, तो सुई निकाल दें और पिछली साइट पर प्रॉक्सिमल प्रक्रिया को दोहराएं।
8. नसों के इंजेक्शन के बाद 24 और 48 घंटे में विवो बीएलआई (चरण 2 देखें) में प्रदर्शन करके जीन की अभिव्यक्ति को विज़ुअलाइज़ करें।

2. विवो बीएलआई में

नोट: पहले से, डीपीबीएस में 15 मिलीग्राम / एमएल डी-ल्यूएफ़ेरिन का एक ताजा स्टॉक समाधान तैयार करें, 0.22-माइक्रोन फिल्टरिंग यूनिट का उपयोग करके इसे फ़िल्टर करें, और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

1. एक स्पष्ट plexiglass संज्ञाहरण कक्ष में चूहों प्लेस। सुनिश्चित करें कि isoflurane कक्ष पूर्ण है। जानवरों को संवेदनाहट करने के लिए तैयार होने पर, सुनिश्चित करें कि पंप (एलईएफटी) और कक्ष (दाएं) स्विच चालू हैं इन्सोफ़्लुराइन डायल को 2.5% इन्वेस्टमेंट के लिए और रखरखाव के लिए 2% मुड़ें। आईवीआईएस चैम्बर के अंदर के जानवरों को छवि अधिग्रहण के दौरान 2.5% आइसोफ़्लोरेन संज्ञाहरण के तहत रखा जाता है।
2. चूहों को पूरी तरह से संवेदनाहट करने के बाद इमेजिंग से पहले इंट्राटेरेटोनियल मार्ग से 15 मिनट डी-ल्यूइफिरिन समाधान के 10 एमएल / किग्रा शरीर के वजन को इंजेक्षन करें।
   नोट: डी-ल्यूइफ़ेरिन के प्रशासन के बाद संकेत शिखर के समय को निर्धारित करने के लिए डी-ल्यूफीरिन पर एक काइनेटिक अध्ययन किया जाना चाहिए।
3. इन विवो इमेजिंग सिस्टम को खोलें और इसे ब्लैक कार्डस्टॉक के एक टुकड़े (पूरा होने पर छोड़ दें) के साथ इमेजिंग चैंबर तैयार करें। सही संज्ञाहरण (माउस प्रति एक शंकु का उपयोग करें) के लिए आवश्यक नाक शंकुएं रखें।
   नोट: ट्यूब जो उपकरण को संज्ञाहरण की आपूर्ति करती है, वह विभाजित हो जाता है ताकि एनेस्थेसिया का एक ही एकाग्रता इमेजिंग सिस्टम के अंदर स्थित एनेस्थेसिया मैनिफॉल्ड्स से जुड़ा हो।
4. बी से चूहों (अप करने के लिए 5) स्थानांतरणइमेजिंग सिस्टम में मैनिफ़ोल्ड से जुड़े नाक शंकुओं के लिए बैल और दरवाजा बंद करें। छवि अधिग्रहण 5 मिनट तक रहता है
5. निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके BLI प्राप्त करें, इस प्रकार निम्नानुसार है।
   1. सॉफ्टवेयर शुरू करें विवो इमेजिंग सिस्टम अधिग्रहण नियंत्रण कक्ष में, Luminescent के पास एक चेक मार्क डाल दिया पुष्टि करें कि उत्तेजना फ़िल्टर सेटिंग ब्लॉक है और एमिशन फ़िल्टर सेटिंग ओपन है I
   2. तीरों पर क्लिक करें: Luminescent इमेजिंग मोड के लिए, 5 मिनट का एक्सपोज़र समय चुनें, 8 बिनिंग, और एफ / स्टॉप 1; तस्वीर इमेजिंग मोड के लिए, बिनिंग 4 और एफ / स्टॉप 8 का चयन करें
   3. फ़ील्ड ऑफ़ व्यू ड्रॉपडाउन सूची से, डी का चयन करें, 1 9 सेमी, और 1.5 सेमी की विषय ऊंचाई। छवि प्राप्त करने के लिए तैयार होने पर प्राप्त करें पर क्लिक करें
6. जब छवि अधिग्रहण पूर्ण हो जाता है, तो उनके पिंजरों में चूहों को वापस रखें।
7. निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विशिष्ट क्षेत्रों से उत्सर्जित फोटॉन को बढ़ाएं।
   1. क्लिक करें आरओआई टूल में टाइप ड्रॉपडाउन सूची से मापन ROI चुनें।
   2. स्क्वायर आइकन पर क्लिक करें और एक जानवर के छाती को कवर करने के लिए उचित आयाम के साथ एक स्क्वायर ROI बनाएं। एक ही आयाम के साथ ROI को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक जानवर के लिए ROI कॉपी और पेस्ट करें। आरओआई टूल पैनल में, आरआईआई में कुल तीव्रता के माप को प्राप्त करने के लिए आरओआई मापने पर क्लिक करें।
   3. सत्र के दौरान छवियों या अनुक्रमों में बनाए गए सभी आरओआई के लिए आरओआई माप डेटा देखें (प्रति पंक्ति एक ROI) निर्यात करें क्लिक करें और उस फ़ोल्डर का चयन करें जहां फ़ाइल को सहेजा जाएगा।

3. प्रो-इन्फ्लैमेटरी उत्तेजना के साथ माउस चैलेंज

नोट: प्रो-सूजन उत्तेजनाओं के साथ माउस चुनौती से पहले, i n vivo BLI (चरण 2 देखें) द्वारा आधारभूत सक्रियण की जांच करें। विवो जीन डिलीवरी और माउस के बीच कम से कम 7 दिनों के पास होना चाहिएई चुनौती हल्की और क्षणिक सूजन को गायब करने की अनुमति देते हैं।

1. इंट्रेट्राइकल इन्शिलेशन के लिए उपकरण तैयार करें ( चित्रा 1 और चित्रा 2 देखें )।
   1. वसंत (सी, ई), एक 100 μL सिरिंज (बी), और एक डिस्पोजेबल गेज (डी) 3-रास्ता स्टॉपकॉक (ए) के साथ 5 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सीरिंज से कनेक्ट करें। सिस्टम को समर्थन (एच) पर रखें। सिस्टम को समर्थन (एच) पर रखें।
   2. PE190 सूक्ष्म चिकित्सा टयूबिंग (एफ) से डिस्पोजेबल गेज (डी) और कलम सदी (जी) से कनेक्ट करें।
   3. 5-एमएल सिरिंज को 800 μL हवा के साथ भरें और 3-रास्ता स्टॉपकॉक बंद करें।
      नोट: 100 μl सिरिंज में 50 μl aspirating द्वारा स्यूडोमोनस aeruginosa संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के साथ ट्यूब भरें।

चित्रा 1: योजनाबद्ध RepreseIntratracheal डिवाइस के एक घटक के ntation
(ए) 3-रास्ता स्टॉपकॉक, (बी) 100-μL हैमिल्टन सिरिंज, (सी) डिस्पोजेबल 5 एमएल सिरिंज, (डी) डिस्पोजेबल गेज, (ई) वसंत के साथ डिस्पोजेबल 5 एमएल सिरिंज, (एफ) PE190 माइक्रो मेडिकल टयूबिंग , (जी) पेन सदी, और (एच) समर्थन। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 2: इकट्ठे हुए इंट्र्रेट्राइकल डिवाइस का प्रतिनिधित्व
पहचान 1 चित्रा 1 के समान है। फिर से लॉगिन करने के लिएयहां इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए

2. ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 2.5% isoflurane पर isoflurane vaporizer चैंबर सेट का उपयोग करके चूहों को anesthetize।
3. 3-5 मिनट के बाद संवेदनाहारी के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए पशु की निगरानी करें
   नोट: यह पुष्टि करने के लिए कि माउस पूरी तरह से संवेदनाहृत है, निम्नलिखित लक्षणों की सावधानी बरतें: धीमा श्वास दर धीमा होनी चाहिए, गर्दन द्वारा उठाए गए हाथों की खींच के अभाव और प्रतिक्रिया की कमी जब हिंद अंग प्रेरित हो जाते हैं। कुछ अतिरिक्त मिनटों की प्रतीक्षा करें और अगर ये मानदंड पूरा न हों तो अगले चरण पर जाने से पहले फिर से जांच करें।
4. पि्लेक्सीग्लस इंटुबेशन प्लेटफॉर्म पर संवेदनाहारी माउस को रखें, उसके आसिगारों द्वारा लटकाए, जो तार पर रखे जाते हैं।
5. बाएं हाथ (दाएं हाथ के शोधकर्ताओं के लिए) के साथ लैरींगोस्कोप चालू करें और मुंह बंद संदंश की एक जोड़ी पकड़ो धीरे-धीरे मुंह खोलने के लिए लारींगोस्कोप और संदंश की नोक का उपयोग करें।
6. जीभ बाहर खींचो और एचसंदंश का उपयोग करते हुए इसे पक्ष में जुड़ा हुआ है मुंह के पीछे की ओर लेरींजोस्कोप ब्लेड की मार्गदर्शिका लेटेन्जस्कोप को धीरे-धीरे 90 डिग्री कोण पर दबाएं जब तक ट्रेकिआ के खुलने तक दिखाई नहीं दे रहा हो। जगह में लैरींगोस्कोप को पकड़ो
7. दूसरी ओर, पीई टयूबिंग के अंत से जुड़ी डिलीवरी ट्यूब को ले लो और ट्रेकिआ में डालें। इनोकुल्म को वितरित करने के लिए तीन-तरफ़ वाल्व को घुमाएं जितनी जल्दी हो सके ट्रेकिआ से बाहर ट्यूब खींचो। कुछ सेकंड के लिए माउस को ईक्लॉइड को फेफड़ों में डालने की अनुमति दें।
   नोट: यदि चूहों बहुत लंबे समय तक अवरुद्ध हो जाएं तो चूहों को दम घुट और मर जाना होगा।
8. मंच से माउस निकालें पुनर्प्राप्ति का समय उपभेदों के आधार पर भिन्न हो सकता है; मेहनत से माउस की निगरानी करें, यह सुनिश्चित करें कि इस प्रक्रिया के बाद जानवर 30 मिनट के अंदर पूरी तरह से जाग रहे हों।
9. इन्ट्रेटेपिटीनेली 150 मिलीग्राम / किग्रा डी-ल्यूएफ़ेरिन इंजेक्षन करें और इन्फ्रास्ट्रैक्ल के बाद 4, 24 और 48 घंटे में एक विवो इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर फेफड़े को छवि दें।उत्तेजनाओं की प्रेरणा निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विशिष्ट क्षेत्रों से उत्सर्जित फोटॉन को बढ़ाएं।

Representative Results

बीआईएल -8-ल्यूक क्षणिक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल को स्रावित विषमता वाले कारकों वाले केंद्रित जीवाणु सतह पर तैरने वाले (30x) के साथ चुनौती देने वाले चूहों में फेफड़े की सूजन की निगरानी में इस्तेमाल किया गया था। बीएलआई सिग्नल में वृद्धि के रूप में विवो इमेजिंग द्वारा प्रेरित भड़काऊ प्रतिक्रिया का पता लगाया गया था। प्रो-भड़काऊ गतिविधि स्पष्ट रूप से 2.5 एच पोस्ट-इन्स्टिलेशन थी, हालांकि बीएलआई सिग्नल 5 और 24 घंटे के बीच उच्चतम चोटी पर पहुंच गया था और अभी भी 48 घंटे ( चित्रा 3 ) पर पता लगाया गया था।

चित्रा 3: आईएल -8 ट्रांसरीनीक चूहे में पी। एरुगिनोसा एसएन द्वारा प्रेरित फेफड़े के सूजन के विवो इमेजिंग में प्रतिनिधि।
ऊपरी पैनल: चूहों की प्रतिनिधि छवियां (n = 2 प्रति समूह) इंट्रेट्राचली इन इन्सबीआईएल -8-ल्यूक के साथ क्षणिक transgenization के बाद एक स्यूडोमोनस एरुगिनोसा तनाव (पाई) से जीवाणु सेल मुक्त 30x एस.एन. चूहे 2.5, 5, 4, 24 और 48 घंटे के बाद उत्तेजना में बीएलआई द्वारा निगरानी रखी गई थी, छाती पर ब्याज के एक क्षेत्र के साथ। निचले पैनल: फोटॉनों / एस / सेमी ^{2 के} रूप में व्यक्त संयुक्त डेटा प्रत्येक मान मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4: अभिकर्मक के बाद क्षणिक फेफड़े सूजन।
बीआईएल -8-ल्यूक के चतुर्थ रोग के निषेचन के बाद पहले आकलन (दिन 3) से छाती बीएलआई की कमी। डेटा फोटोन / एस / सेमी ² ± एसईएम (एन = 6) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

Discussion

पिछले काम में ¹¹ , बीआईएल -8-ल्यूक-आश्रित बीएलआई और बीएएल मार्करों के बीच एक अंतर दिखाया गया था। यह माउस उपभेदों के भीतर संवेदनशीलता की विभेदक डिग्री पर निर्भर था ¹² इस कारण से, बीआईएल -8-ल्यूक मॉडल का एक अलग माउस स्ट्रेन के लिए पहला आवेदन बीएलआई और अधिक मानकीकृत सूजन मार्करों के संदर्भ में, भड़काऊ प्रतिक्रिया का प्रारंभिक अध्ययन की आवश्यकता है।

चूहे के अभिकर्मक हल्के फेफड़े की सूजन और बीआईएल -8-ल्यूक की सक्रियता का कारण बनता है, जो डीएलए इंजेक्शन ( चित्रा 4 ) के 3 से 4 दिनों तक बीएलआई द्वारा पहचाना जाता है। यह तब 1 सप्ताह ^{1 के} बाद पूरी तरह गायब हो जाता है। विवो बीएलआई में जीन डिलीवरी के बाद बीआईएल -8-ल्यूक की अभिव्यक्ति को हमेशा सत्यापित करना चाहिए, क्योंकि यह निम्न प्रयोगात्मक चरणों की सफलता के लिए एक आवश्यक शर्त है। 7 दिनों के बाद और माउस चुनौती से पहले, बेसलाइन सक्रियण को भ्रमित करने के लिए रिकॉर्ड किया जाना चाहिएअभिकर्मक-प्रेरित सूजन के लापता होने पर ईआरएम।

इस दृष्टिकोण की सूजन के तीव्र चरण पर परीक्षण किया गया है, लेकिन पुराने चरण के लिए इसका आवेदन परीक्षण नहीं किया गया है। यह ज्ञात नहीं है कि लाइव सूक्ष्मजीववाद की चुनौती इस सेटिंग में प्रयुक्त प्रमोटर की गतिविधि को कैसे प्रभावित कर सकती है। तीव्र और जीर्ण सूजन के रोगजनन की एक वृद्धि की समझ और फेफड़ों के फलस्वरूप फलस्वरूप फेफड़ों की बीमारियां ^{3 , 9 के} लिए प्रभावी उपचार के विकास के लिए आवश्यक है। इस प्रयोजन के लिए पशु मॉडल आवश्यक रहना पड़ता है, यद्यपि मानव रोग रोगजनकता को सटीक रूप से प्रदर्शित करने वाली सीमाएं मौजूद हैं।

अन्य प्रजातियों से व्युत्पन्न luciferase रिपोर्टर जीन का उपयोग कर छोटे कृन्तकों में भड़काऊ मापदंडों की निगरानी में बहुत अच्छा मूल्य है। यह दृष्टिकोण रोगविषाणु के अध्ययन की अनुमति देता हैभड़काऊ प्रतिक्रियाओं का लॉग, साथ ही उनके मॉडुलन के उद्देश्य से हस्तक्षेप का परीक्षण करने की क्षमता। यह पहले से अच्छी तरह से विकसित बोवाइन आईएल -8 प्रमोटर / ल्यूइफेरेज़ ट्रान्सिनाइज्ड ट्रांसमिनेटेड (बॉवइनाइज्ड) माउस मॉडल ¹ का उपयोग करके सफलतापूर्वक परीक्षण किया गया था। इसके अलावा, हाल ही के एक अध्ययन ^{10 में} दिखाया गया है कि वर्णित मॉडल बैक्टीरिया के एक्सोप्रोडक्ट्स द्वारा प्रेरित फेफड़े के सूजन की प्रतिक्रिया की निगरानी के लिए उपयुक्त है और ब्याज के परिसर (क्रियाओं) की कार्रवाई की व्यवस्था की जांच करने के लिए है। बीएलआई एक गैर-इनवेसिव दृष्टिकोण है जो पी। एरिनगिनोसा संस्कृति सतह पर तैरने वाले ^{9 , 10 , 11} सहित प्रासंगिक उत्तेजनाओं के साथ इंट्रेट्राइकल इन्शिलेशन के बाद फेफड़े की सूजन प्रक्रिया के अनुदैर्ध्य अवलोकन के लिए अनुमति देता है। यह शास्त्रीय विधियों की तुलना में तीव्र फेफड़ों की सूजन का अध्ययन करने का एक स्पष्ट लाभ है, जिसके लिए जानवरों के बलिदान की आवश्यकता होती है।बालों के द्रव और फेफड़ों का अनुवाद पुरानी संक्रमण / सूजन के अध्ययन के लिए इसके मूल्य को संबोधित नहीं किया गया है।

वर्तमान मॉडल का उपयोग फेफड़े की सूजन संबंधी बीमारियों के रोगजनन पर उपलब्ध ज्ञान को गहरा करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें प्रो-सूजन गतिविधि के साथ जीवाणु / गैर-जीवाणु कारक के लक्षण वर्णन शामिल हैं। इसके अलावा, यह ज्ञात / प्रत्यारोपण विरोधी भड़काऊ कार्यों के साथ अणुओं के संभावित उपचारात्मक प्रभावों के मूल्यांकन की सुविधा प्रदान कर सकता है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
IVIS Lumina serie II Pre-clinical In Vivo; Imaging System	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
MMPsense 750 FAST	Perkin Elmer Inc.	NEV10001EX	Protect from light, store the probe at 4 °C
Female inbred BalbC	Harlan Laboratories Italy		Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
bIL-8-Luc plasmid	Department of Medical Veterinary Science, University of Parma, Italy		Store the plasmid at -20 °C
pGL3basic vector	Promega	E1751	Store the vector at -20 °C
JetPEI DNA transfection reagent	Polyplus transfection	201B-001G	The DNA and JetPEI mix was formulated with a final N/P ratio of 7
D-luciferin potassium salt 1 g	Perkin Elmer Inc.	122796	Protect from light, store at -20 °C
Living Image software	Caliper Life Sciences,	Experimental Builder
Isoflurane	ESTEVE spa	571329.8	Do not inhale
Bio-Plex Cytokine Assay Kit	Bio-Rad Laboratories	M60-009RDPD	Store the unopened kit at 4 °C
Automated cell counter	Dasit XT 1800J	Experimental Builder
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator	Penn-century	DPM-EXT
Gas anesthesia system XGI-8	Perkin Elmer Inc.	Experimental Builder
PE190 micro medical tubing	2biological instruments snc	BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL	Terumo	SS*05SE1	Cut the boards of the piston by a scissors
Hamilton 0,10 mL (model 1710)	Gastight	81022
Discofix 3-way Stopcock	Braun	4095111
Syringe with needle 1 mL	Pic solution	3,071,260,300,320	Use without needle
Plastic feeding tubes 18ga x 50 mm	2biological instruments snc	FTP-18-50	Cut obliquely the tip