Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الزرد Published: April 18, 2017 doi: 10.3791/55507
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

Summary

توضح هذه المخطوطة طرق التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية في العمود الفقري من الأجنة الزرد واليرقات. إعداد يحافظ على الخلايا العصبية في الموقع وغالبا ما ينطوي على الحد الأدنى تشريح. تسمح هذه الطرق لدراسة الكهربية من مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية في العمود الفقري، من الأولي للاكتساب استثارة الكهربائية من خلال مراحل اليرقات في وقت مبكر.

Abstract

اكتسبت الزرد، لأول مرة كنموذج تنموي، شعبية في العديد من المجالات الأخرى. سهولة تربية أعداد كبيرة من الكائنات الحية التي تشهد نموا سريعا، جنبا إلى جنب مع وضوح بصري الجنينية، بمثابة سمات مقنعة الأولى من هذا النموذج. على مدى العقدين الماضيين، فإن نجاح هذا النموذج قد دفعت مزيدا من بقدراتها على شاشات الطفرات على نطاق واسع وسهولة transgenesis. وفي الآونة الأخيرة، والنهج الجينات التحرير قمنا بمد قوة النموذج.

الدراسات النمائية العصبية، الجنين الزرد واليرقات نموذجا التي أساليب متعددة يمكن تطبيقها. هنا، ونحن نركز على الطرق التي تسمح للدراسة خاصية أساسية من الخلايا العصبية، استثارة الكهربائية. لدينا استعدادا للدراسة الكهربية للخلايا العصبية في العمود الفقري الزرد ينطوي على استخدام الغراء البيطري خياطة لضمان إعداد لغرفة تسجيل. طرق بديلة للتسجيلمن الأجنة الزرد واليرقات إشراك مرفق إعداد للغرفة باستخدام التنغستن دبوس غرامة 1، 2، 3، 4، 5. غالبا ما يتم استخدام دبوس التنغستن لتركيب إعداد في اتجاه جانبي، على الرغم من أنها قد استخدمت لجبل اليرقات الجانب الظهري 4. وقد استخدمت الغراء خياطة لتركيب الأجنة واليرقات في كل الاتجاهات. باستخدام الغراء، وتشريح الحد الأدنى لا يمكن أن يؤديها، مما يتيح الوصول إلى الخلايا العصبية في العمود الفقري من دون استخدام علاج الأنزيمية، وبالتالي تجنب أي ضرر الناتجة. ومع ذلك، ليرقات، فمن الضروري تطبيق العلاج انزيم قصيرة لإزالة الأنسجة العضلية المحيطة الحبل الشوكي. وقد استخدمت الأساليب المذكورة هنا لدراسة الخصائص الكهربائية الجوهرية من الخلايا العصبية الحركية، interneurons، والخلايا العصبية الحسية في العديد من developmentaل مراحل 6 و 7 و 8 و 9.

Introduction

جيورج سترايزينغر رائدة في استخدام دانيو rerio، المعروف باسم الزرد، كنظام نموذج لتحليل الجيني للتنمية الفقاريات 10. ويقدم النموذج العديد من المزايا بما في ذلك: (1) بسيطة نسبيا وغير مكلفة تربية الحيوان؛ (2) الإخصاب الخارجي، مما يتيح سهولة الوصول إلى الأجنة من المراحل التنموية. و (3) الجنين شفافة، والسماح الملاحظات المباشرة والمتكررة من الخلايا والأنسجة والأعضاء لأنها تشكل.

على مدى العقود التي تلت ذلك، العديد من التطورات زادت زيادة قوة نموذج الزرد. على وجه الخصوص، شاشات الوراثية إلى الأمام وجهود تسلسل كامل الجينوم لعبت دورا رئيسيا في تحديد الطفرات والجينات الهامة لكثير من العمليات التنموية 11، 12، 13، 14،"> 15 طرق الاستنساخ 16. بوابة سمحت التطبيق الروتيني للالمعدلة وراثيا النهج 17 و 18. التطورات الحديثة في تحرير الجينوم، ومن أمثلته النسخ المنشط مثل (TALENs) وتجميع يكرر interspaced بانتظام قصيرة المتناوب (كريسبر) -Cas9 nucleases، النهج سماح لإدخال المستهدفة من الطفرات، فضلا عن خروج المغلوب واضعا في 19 و 20 و 21 و 22. المشتركة، وهذه الأساليب تجعل الزرد نموذجا قويا لدراسة الآليات الوراثية الكامنة وراء السلوكيات محددة والعديد من الأمراض التي تصيب الإنسان 23، 24، 25، 26، 27.

يركز هذا العمل على تطويرالتنظيم العقلي ودور النشاط الكهربائي في تطوير الخلايا العصبية. وينصب التركيز على الحبل الشوكي، والذي نموذج الزرد يوفر العديد من المزايا. أولا، فمن السهل نسبيا للوصول الزرد في المراحل الجنينية واليرقات. وبالتالي، يمكن للمرء أن دراسة وظيفة الحبل الشوكي أثناء مراحل النمو التي لديها عدد أقل من الخلايا العصبية وأبسط الدوائر +28، 29 عاما. وعلاوة على ذلك، والحبل الشوكي الزرد لديه مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية، على غرار الفقاريات الأخرى، كما يتضح من أنماط مميزة والمميزة لعوامل النسخ 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35.

غالبية الدراسات في الزرد التي تهدف إلى الكشف عن الآليات التي تكمن وراء وظيفة الدوائر الحبل الشوكي، وخاصةتلك التي تدعم الحركة، وتركز مفهوم على مراحل اليرقات 36، 37، 38، 39، 40، 41، 42، 43. ومع ذلك، فإن العديد من الخلايا العصبية التي تشكل شبكات قاطرة العمود الفقري بدء المفاضلة الخاصة بهم في المراحل الجنينية المبكرة، ~ 9-10 ساعة بعد الإخصاب (HPF) 44، 45، 46، 47، 48، 49، 50، 51. في ضوء ذلك، فهم كيف تنشأ الخصائص المورفولوجية والكهربائية للخلايا العصبية في العمود الفقري والتغيير بين المراحل الجنينية واليرقات مهمة لoveraفهم ليرة لبنانية من تشكيل الدائرة الحركي وظيفة.

طرق تشريح الموصوفة هنا تسمح التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في العمود الفقري كما تم تطبيقها بنجاح في المراحل الجنينية (~ 17-48 HPF) ومراحل اليرقات (~ 3-7 أيام بعد الإخصاب [DPF]). هذا النهج يحد من كمية تشريح المطلوبة لتوفير الوصول إلى الخلايا العصبية في المصالح. يختلف البروتوكول من غالبية الطرق الأخرى المنشورة لتسجيل من الخلايا العصبية في العمود الفقري الزرد في هذا الغراء البيطري خياطة يستخدم بدلا من دبوس التنغستن على ما يرام، لنعلق الجنين أو يرقة إلى غرفة تسجيل. توافر نهجين مختلفين (أي خاط الغراء مقابل دبوس التنجستن) لتركيب الأجنة الزرد أو اليرقات لتحليل الكهربية يوفر للباحثين خيارات بديلة لتحقيق الأهداف التجريبية الخاصة.

أولا، إجراءات الوصول والتسجيل من البوب ulation من الخلايا العصبية الحسية الأولية، والخلايا روهون اللحية، موصوفة. تكمن الهيئات خلية من هذه الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الظهري. وتوجد الخلايا روهون اللحية في العديد من أنواع الفقاريات، تفرق في التنمية في وقت مبكر، وتكمن وراء استجابة اللمس الجنينية 6، 44، 47، 48.

ثانيا، إجراءات للوصول إلى وتسجيل من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري مفصلة. تنشأ الزرد الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري خلال موجتين من الخلايا العصبية. تنشأ الخلايا العصبية الحركية الأولية في وقت سابق المولد في نهاية المعيدة (~ 9-16 HPF)، مع الخلايا العصبية الحركية الأساسي فقط 3-4 الحالية في hemisegment 45 و 46 و 49. في المقابل، فإن السكان المولودين في وقت لاحق من الخلايا العصبية الحركية الثانوية هو أكثر عددا وتنشأ خلال فترة طويلة، ابتداء من الساعة 14 HPF ~EF "> 45، 50. نشأة الخلايا العصبية الحركية الثانوية في قطاعات منتصف جذع اكتمال معظمها بنسبة 51 HPF 50. وتعتبر الخلايا العصبية الحركية الثانوية لتكون النظير من الخلايا العصبية الحركية في amniotes 46. ومن المثير للاهتمام، الخلايا العصبية فوق الشوك، عن طريق الدوبامين، وتنظيم الحركة في اليرقة والحركية الثانوي الخلايا العصبية نشأة في الجنين ويرقة الشباب 50 و 51. الخلايا العصبية الحركية الأولية والثانوية تضم كل منها عدة أنواع فرعية مختلفة. كل محرك الأساسي مشاريع الخلايا العصبية النوع الفرعي محور عصبي محيطي أن يعصب مجموعة العضلات مميزة، مما أدى إلى النمطية، تحديد مسار المحاور. عموما، الخلايا العصبية الحركية الثانوية تتبع مسارات محور عصبي أنشئت من قبل الخلايا العصبية الحركية الأساسية. وهكذا، وفيما يتعلق مسارات محور عصبي، الخلايا العصبية الحركية الأساسية والثانوية متشابهة، باستثناء أن سمك المحاور وsomata حجم لإعادة أكبر للالخلايا العصبية الحركية الأولية 45.

ثالثا، وتناقش طرق للتسجيل من أنواع قليلة من interneurons. ومع ذلك، في هذه الحالات، لا بد من كمية محدودة من إزالة خلايا النخاع الشوكي أخرى، وبالتالي فإن الحبل الشوكي هو أقل سليمة من التسجيلات من خلايا روهون اللحية أو الخلايا العصبية الحركية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC، ومكتب الثروة الحيوانية مختبر في جامعة كولورادو آنشوتز الحرم الجامعي الطبية).

1. الزرد تربية

  1. رفع والحفاظ الكبار الزرد (دانيو rerio) في 28.5 درجة مئوية على / 14 دورة ح ضوء 10 ساعة الظلام ومع مناسبة لمعالجة الماء والصرف 52.
  2. رفع الأجنة الزرد / اليرقات في 28.5 درجة مئوية في المتوسط الجنين حتى وصولها إلى المرحلة المطلوبة (على سبيل المثال، 2 DPF).

2. إعداد المواد تشريح

  1. موزع الغراء لتشريح الزرد
    ملاحظة: يتضمن هذا البروتوكول استخدام الغراء البيطري خياطة إرفاق تمهيدا لغرفة تسجيل. الاستخدام الناجح للالغراء خياطة يتطلب تطبيق كميات صغيرة من الغراء في الطريقة التي تسيطر عليها. يبدأ الغراء لتتصلب بمجرد أنواجه بيئة مائية. لذلك، رسم الغراء في micropipette ونقل كميات صغيرة باستخدام "موزع الغراء" محلية الصنع التي تسمح للتطبيق الضغط السلبي أو الإيجابي عن طريق الفم. الجزء المركزي من موزع الغراء تتحمل الزجاج، وقطعة التي يتم تضمينها ضمن حزمة تحتوي على البورسليكات رقيقة الجدار الزجاجي الشعيرات الدموية (الشكل 1A). في نهاية واحدة، يتم توصيل تتحمل عن طريق قطعة من أنابيب مرنة لسان حال، في حين أن الطرف الآخر يحمل micropipette الزجاج (الشكل 1).
    1. إزالة لمبة السوداء من حمل كوب واحد واستبدالها مع محول المطاط الأبيض من تحمل الزجاج أخرى (الشكل 1B و1C)
      ملاحظة: هذا المزدوج توج محول الجوف الزجاج يسمح الصدد إلى micropipette الزجاج على نهاية واحدة، وعلى الطرف الآخر، إلى قطعة من أنابيب مرنة من خلال صغير، وتركيب البولي بروبلين على التوالي (1B الشكل، الشكل).
      2. <لى> قطع قطعة من أنابيب مرنة لطول ~ 38 سم. نعلق لسان حال (على سبيل المثال، أصفر 200 ميكرولتر micropipette غيض) إلى نهاية أنابيب مرنة غير متصلة تتحمل الزجاج.
      ملاحظة: قطعة من أنبوب وينبغي أن تكون طويلة بما فيه الكفاية للسماح للتلاعب من micropipette الزجاج تحت نطاق تشريح بينما الطرف الأصفر micropipette في الفم (الشكل 1D).

شكل 1
الشكل 1: الغراء موزع. (AC) كوب تحمل يتصل أنابيب مرنة في نهاية واحدة وmicropipette الزجاج في الطرف الآخر. محولات المطاط تسمح المرفق عن طريق البولي بروبلين تركيب صغير (B، أقحم) إلى أنابيب و، في نهاية المطاف، إلى micropipette الزجاج في الطرف الآخر. (D) وموزع الغراء النهائي له لسان حال (على سبيل المثال، مصنوعة من بلاسغيض عرة ماصة) في واحدة من نهاية الأنابيب وتتحمل الزجاج مع micropipette المرفقة في آخر (رأس السهم).

  1. تشريح / غرفة تسجيل
    ملاحظة: يقدم غرفة تشريح أيضا باسم غرفة تسجيل الكهربية. يتم تشكيل غرفة على شريحة زجاجية باستخدام قبل قطع قطعة من المطاط الصناعي السيليكون مملح (الشكل 2A)
    1. لإعداد المطاط الصناعي السيليكون، إضافة قاعدة وكيل علاج لأنبوب مخروطي البلاستيك في نسبة 4: 1 على التوالي.
    2. مزيج قاعدة المطاط الصناعي وكيل المعالجة بدقة وتصب الخليط الى قسمين 100 ملم أطباق بتري. صب المطاط الصناعي لسمك <1 مم طبق بيتري واحد و~ 2.5 مم في الآخر.
    3. السماح للسيليكون المطاط الصناعي لعلاج من التعرض للهواء ل~ 4-5 أيام. إذا كانت هناك حاجة المطاط الصناعي الشفاء عاجلا، واحتضان ذلك في 60 ° C.
    4. قطع قطعة من المطاط الصناعي سيليكون الشفاء إلى الأحجام التالية:
      1. من ~ 1 ملم-thick علاجه المطاط الصناعي، وقطع مستطيل ~ 3.8 × 6.3 سم؛ هذه القطعة بمثابة الجزء السفلي من الغرفة (الشكل 2A). من السيليكون علاجه ~ 2.5 مم سميكة، وقطع مستطيل ~ 3.8 × 6.3 سم. من المستطيل الأخير، قطع مستطيل الداخلي ~ 2.5 × 5 سم؛ يخدم إطار الناتج كما في أعلى الغرفة (الشكل 2A).
    5. لجعل تشريح / غرفة تسجيل، ضع المستطيل سيليكون رقيقة مباشرة على الجزء العلوي من شريحة زجاجية (5 × 7.6 سم)، مع التأكد من إزالة أي فقاعات الهواء بين السيليكون والزجاج (الشكل 2A). وضع إطار سيليكون المستطيل، وقطع من المطاط الصناعي سمكا، وعلى رأس الطبقة السفلى رقيقة من السيليكون.
    6. تحقق من أن طبقات سيليكون نعلق بشكل جيد لبعضها البعض، وأنه لا توجد فقاعات الهواء بين طبقتين (الشكل 2A).
    7. بعد الاستخدام، وتفكيك الغرفة عن طريق إزالة سميكة إطار مستطيل سيليكون من العلمانيين سيليكون القاعإيه التي تعلق على شريحة زجاجية. شطف السطوح السيليكون مع ده 2 O قبل الاستخدام وبعد كل دورة تسجيل والجافة مع مناديل من الوبر منخفضة.
    8. تخزين غرفة جافة لمنع نمو الفطريات بين قطعتين من السيليكون.
      ملاحظة: إذا تم استخدام السموم أو وكلاء الدوائية التي قد لا يشطف بسهولة من السيليكون، وتكريس غرف محددة لتلك الأغراض.

الشكل 2
الشكل 2: غرفة الكهربية وأدوات تشريح. (A) وغرفة تستخدم للتشريح والتسجيلات الكهربية وتتألف من شريحة زجاجية على أساسها يتم وضع قطعتين من المطاط الصناعي السيليكون علاجه، والطبقات فوق بعضها البعض لتوفير إطار وأسفل لحفر بئر. حجم البئر، ~ 2.5 × 5 سم، ويسمح باستخدام كميات صغيرة (2-2.5 مل) من تسجيل خارج الخليةحل. طبقة السيليكون أسفل تسمح لتحديد المواقع آمن للجنين باستخدام لاصق الأنسجة الزرد التي لا تلتزم الزجاج. (B) A micropipette الزجاج (أعلى) يستخدم لتسليم الغراء أثناء تشريح. يتم سحبها من زجاج رقيقة الجدار لخلق طويلة، نهاية مدبب أن يتم قطع في وقت لاحق، وخلق طرف مع قطر ~ 75 ميكرون. يتم إرفاق micropipette الزجاج مدبب إلى نهاية خالية من موزع الغراء (1D الشكل، رأس السهم) والجبهة مليئة الغراء من خلال تطبيق الشفط. وmicropipette الآخر (أسفل)، وسحبت بالنسبة لتلك المستخدمة لتسجيل التصحيح، المشبك، ويستخدم لtransection من الدماغ المؤخر ولإزالة الجلد. (C) تحت المجهر تستقيم، يتم استخدام micromanipulator للمناورة micropipette للخطوات تشريح النهائية. A micropipette الزجاج، كما في B، أسفل، تعلق على حامل الكهربائي (السهم). ويتحقق إزالة العضلات من قبلpplying الشفط من خلال الأنبوب متصلا منفذ الهواء (رأس السهم). في الطرف الآخر لها، وأنابيب يربط إلى محبس (رأس السهم الأسود) التي، على الجانب الآخر لها (النجمة)، لديها أنابيب تعلق على لسان حال.

3. تشريح الأجنة واليرقات لتسجيلات التصحيح، المشبك من العمود الفقري الخلايا العصبية

الشكل (3)
الشكل 3: تشريح الظهرية من الحبل الشوكي الزرد. (AA ') بعد transection الدماغ المؤخر (أ) من جنين 2-DPF، هو قطع الجلد على الجانبين الأيمن والأيسر من الجنين (ب). وقطع الثاني، عمودي على الأول، ثم يتم إجراء (ج). بعد ذلك، يتم رفع الجلد باستخدام micropipette، مما يسمح ملاقط للاستيلاء على وسحب بعيدا الجلد. (B) إزالة الجلد تكشف الحبل الشوكي الظهري. منقاري إلى خط أسود، والتزلج على الجليدتمت إزالة ن وسطح من الحبل الشوكي (النجمة)، الواردة في السحايا، وعرضة للخطر. يبقى الجلد سليما الذيلية إلى خط أسود (السهم). الضغط (CC ') غيض من micropipette الزجاج على السحايا، ويتم تنفيذ سريعة والجانبية والحركات القصيرة لاختراق السحايا. (DD 'وEE') مرة واحدة اخترقت السحايا (DD)، وmicropipette هو متقدمة و(EE ') انتقل rostrally المسيل للدموع السحايا إلى جزأين. وsomata من الخلايا العصبية روهون اللحية تظهر عادة على إزالة السحايا (السهم). (FG ') في يرقة 7 DPF، طبقات من العضلات تغطي الجانب الظهري للحبل الشوكي، مما يعوق الوصول إلى الخلايا العصبية روهون اللحية. بعد إزالة الجلد، ويتم التعامل مع اليرقة مع 0.05٪ كولاجيناز. (F) والحضانة 5 دقائق مع 0.05٪ كولاجيناز هو صارم جدا، مما أدىفي تلف العضلات المفرطة، كما يتضح من العضلات المتوترة (السهم وأقحم). قد (F ') الإفراط في العلاج كولاجيناز أيضا إلى تلف الخلايا العصبية روهون اللحية (السهم)، وكشف هنا عن طريق التعبير عنها من GFP في تيراغرام (islet2b: GFP) خط. في تيراغرام (islet2b: GFP) خط، الجذرية الظهرية الخلايا العصبية العقدية أيضا التعبير عن GFP (رأس السهم). وإيجازا 1 دقيقة الحضانة مع 0.05٪ كولاجيناز يحل بما فيه الكفاية العضلات (G) مع الحفاظ على التشكل بضعة عضلية (السهم وأقحم). (G ') الخلايا الصبغية موجودة على الجزء العلوي من طبقة العضلات الأكثر الظهرية (السهم). (H و I) في تيراغرام (islet2b: GFP) خط، الخلايا العصبية روهون اللحية (الأسهم) والعقدة الجذرية الظهرية (رأس السهم) الاستمرار في التعبير عن GFP في 7 DPF. الظهرية آراء تيراغرام (islet2b: GFP) الأجنة الزرد في 2 DPF (H) لد 7 DPF (I). في الحانات لوحة ومقياس = 500 ميكرون. BE (كما هو موضح في لوحة B) مقياس الحانات = 80 ميكرون. F 'و G' (كما هو موضح في لوحة F) مقياس الحانات = 200 ميكرون. H وأنا (كما هو موضح في لوحة H) مقياس الحانات = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تشريح الأجنة للحصول على تسجيلات من خلايا روهون اللحية
    1. وضع الجنين في غرفة التشريح التي تحتوي على ~ 2-3 مل من محلول رينغر (الشكل 2A). لشل حركة الجنين عن طريق إضافة ~ 100 ميكرولتر من 0.4٪ محلول تريكين إلى الغرفة.
    2. سحب بال micropipettes زجاج رقيقة الجدار على micropipette مجتذب باستخدام خيوط مربع للحصول على فترة طويلة، غيض رقيقة، على غرار لmicropipette حقن (الشكل 2B، أعلى) 53.
    3. إرفاق micropipette الزجاج سحبت على الزجاج تتحمل سو موزع الغراء. تحت المجهر تشريح، واستخدام الملقط لكسر غيض من micropipette الزجاج بحيث الطرف هو ~ 75 ميكرون (الشكل 2B، أعلى).
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم غيض كبير بما فيه الكفاية للسماح للتحميل كفاءة من الغراء في تلميح من خلال تطبيق ضغط سلبي (شفط الفم) إلى الجبهة ملء micropipette، ولكن صغيرة بما يكفي للسماح للتطبيق الدقيق للالغراء عبر ضغط إيجابي .
    4. تحميل micropipette الزجاج مع ~ 3-5 ميكرولتر من الغراء من خلال تطبيق الشفط من خلال المعبرة. تقديم معلومات سرية مليئة الغراء إلى غرفة التشريح.
      ملاحظة: ملء micropipette مع الغراء تتطلب شفط قوي. إذا كان micropipette يملأ بسرعة مع ضعف الشفط، وغيض كبير جدا.
    5. وضع الجنين داخل غرفة تسجيل (الشكل 3A و3A ')؛ للحصول على تسجيلات من أجنة ويرقات الشباب (≤72 HPF)، ليست هناك حاجة لإزالة الأنسجة العضلية.
    6. احضرغيض من micropipette محملة الغراء القريبة من رأس الجنين / يرقة مع الحفاظ على ضغط إيجابي طفيف على micropipette عبر أنبوب الفم (لمنع دخول محلول مائي). مرة واحدة غيض بالقرب من رأس الجنين، وتطبيق ضغط إيجابي يكفي لطرد قطرة صغيرة من الغراء على الجزء السفلي من الغرفة.
      ملاحظة: الغراء يصلب مرة واحدة في اتصال مع محلول مائي، ولذلك فمن المهم تطبيق والحفاظ على ضغط إيجابي معتدل كما يتم وضعها في حل تشريح.
    7. استخدام أداة تشريح دبوس للتحرك الجنين / يرقة نحو قطرة من الغراء حتى أن رئيس يجعل الاتصال مع الغراء. توجيه الجنين ظهري جنب حتى واضغط على رأسه لضمان اتصال جيد مع الغراء.
    8. كما يصلب الغراء ببطء، استخدم دبوس تشريح لإعادة وضع الجنين / يرقة بحيث انها تقع على جانب أسفل بطني، الجانب الظهري. تراجع أداة تشريح دبوس في قطرة من الغراء ورسم خيوط الغراء مرارا وعبر رئيسمن الجنين إلى زيادة تأمين موقفها.
      ملاحظة: تريكين تسرع المعدل الذي يصلب الغراء. لإتاحة المزيد من الوقت للعمل مع الغراء، واستخدام الحد الأدنى من تريكين اللازمة لشل حركة الجنين / يرقة. بالإضافة إلى ذلك، فإن معدل تصلب قد تختلف مع الكثير مختلفة من الغراء. وفقا لذلك، عند استخدام دفعة جديدة من الغراء، والتأكد من معدل تصلب قبل استخدامه للتشريح.
    9. مرة واحدة يتم إرفاق الرأس بإحكام سيليكون وعزز الغراء، والتضحية جنين / يرقة من transection على مستوى الدماغ المؤخر مع micropipette الزجاج أخرى (الشكل 3A- وو4A- أ).
      ملاحظة: transection المؤخر هو الأسلوب الذي يستخدم هنا للتضحية حيوان إنسانية. ومع ذلك، تبعا لأهداف تجريبية (على سبيل المثال، دراسة السباحة الوهمية)، قد تكون هناك حاجة إلى طريقة أخرى.
    10. قبل ربط ذيل إلى غرفة، وإزالة الجلد من الجذع.
      1. استعمالكوب micropipette جديدة (الشكل 2B، أسفل) لقطع سطحي الجلد عدة مرات في الذيلية يمكنها من الدماغ المؤخر (الشكل 3A- ب و4A- ب). بيرس الجلد بشكل سطحي عن طريق تحريك ماصة عمودي على المحور rostro، الذيلية على كل جانب من الجذع لظهريا شنت (الشكل 3A- ب) النماذج أو على الجانب الظاهر من جذع لعينات شنت أفقيا (الشكل 4A- ب).
    11. لخلق رفرف من الجلد لملاقط لانتزاع، كشط الجلد عدة مرات مع micropipette على مستوى وعموديا على خفض الأولي في خطوة 3.1.10.1 (الشكل 3A- ج و4A- ج).
    12. باستخدام الملقط، ورفع تدريجيا رفرف الجلد وسحب الجلد caudally.
      ملاحظة: هذا غالبا ما يؤدي إلى إزالة مجمل الجلد من الجذع. ومع ذلك، فمن sometiزارة التربية والعلم اللازمة لإزالة الجلد في عدة أقسام عن طريق أداء وكرر إلغاء وسحب الجلد. بالنسبة لبعض التطبيقات، وإزالة جزئية من الجلد تسمح بوجود كافية لشرائح الحبل الشوكي من الفائدة (أرقام 3B و 4B).
    13. تسليم قطرة صغيرة من الغراء بالقرب من ذيل الجنين / يرقة. استخدام هذا الغراء إرفاق الذيل إلى أسفل غرفة التشريح. خلال هذه الخطوة، كما يصلب الغراء، وضبط الموقف من الجذع مع أداة تشريح دبوس للتأكد من أن جذع يبقى المنحى ظهريا وأنها ترتبط بقوة مع الغرفة.
    14. وبعد هذا التشريح الأولي، وشطف إعداد نطاق واسع مع الحل رينغر لإزالة تريكين والحطام. السماح للإعداد للراحة لمدة 5 دقائق ~.
    15. استبدال حل تشريح مع الحل تسجيل خارج الخلية. إذا لزم الأمر، إضافة كيل مستوقف إلى إعداد (على سبيل المثال، ألفا-بنغاروتوكسين [بغية دراسته واقراره النهائيntration من 1 ميكرومتر]).
      ملاحظة: 1 ميكرومتر α-بنغاروتوكسين يشل 1-2 DPF الأجنة داخل ~ 30 دقيقة. ليرقات القديمة، قد تكون هناك حاجة إلى تركيز أعلى من ألفا-بنغاروتوكسين. ويحتفظ ألفا-بنغاروتوكسين في حل حمام خلال التسجيلات، التي عادة ما تتم في حدود مدة 1 ساعة. تسجيل الحلول التي تحتوي على الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مثل الكوبالت، لا تتطلب إضافة عامل مستوقف. للتجارب التي تتطلب فترات طويلة تسجيل (أكثر من 1 ساعة)، وperfused لإعداد مع حل حمام بمعدل 0.5-1 مل / دقيقة.
    16. نقل غرفة تشريح مع الجنين شنت على مرحلة مجهر مركب تستقيم مجهزة الهدف يعملون لمسافات طويلة 40X الغمر بالماء.
      ملاحظة: هذا المجهر هو جزء من تلاعب حيث سيتم إجراء التسجيلات. وينبغي أيضا أن تكون مجهزة تلاعب مع headstage، مكبر للصوت التصحيح، المشبك، وmicromanipulator، ونظام الحصول على البيانات / الكمبيوتر (الشكل 2C).
    17. شن البورسليكات فارغة سميكة الجدار الزجاجي micropipette على حامل الكهربائي من headstage (الأرقام 2B، أسفل و2C، السهم). إرفاق أنابيب (القطر الداخلي: 0.16 سم، وقطره الخارجي: 0.32 سم، وطول: ~ 90 سم) في نهاية واحدة لمنفذ الهواء لصاحب القطب (رأس السهم) وعلى الطرف الآخر لثلاثي محبس (الشكل 2C ، رأس السهم الأسود).
      1. ضع بوقا في واحدة من نهاية آخر قطعة من الأنابيب (~ 60-70 سم في الطول) وإرفاقه ثلاثي محبس في الطرف الآخر (الشكل 2C، النجمة السوداء).
        ملاحظة: هذا النظام أنابيب يسمح لتطبيق الضغط الايجابي والسلبي إلى داخل ماصة تسجيل خلال تشكيل الختم.
    18. جلب رأس micropipette إلى الجزء الأكثر الظهري للحبل الشوكي وبيرس بلطف السحايا. اتبع مع سريعة، قصيرة، جانبية الحركات الحمامصن السحايا (الشكل 3C و3C ').
    19. بعد غيض micropipette وقد اجتاز السحايا، ودفع ورفع micropipette لسحب السحايا بعيدا عن الحبل الشوكي (الشكل 3D و 3D ').
    20. نقل micropipette rostrally، ودفع أكثر من 1-2 hemisegments لفضح خلايا روهون اللحية (الشكل 3E و3E ').
      ملاحظة: تشريح الحد الأدنى من السحايا المطلوبة لفضح سوى عدد قليل من خلايا روهون اللحية. بعد كل تسجيل، يتم تنفيذ تشريح إضافي للكشف عن المزيد من الخلايا روهون اللحية. في كل من الأجنة واليرقات، قد الخلايا العصبية روهون اللحية أحيانا انفجر على اتصال مع micropipette التصحيح. الخلايا العصبية الحبل الشوكي الأخرى لا تتصرف بهذه الطريقة، مشيرا إلى أن هذا قد يعكس خصائص فريدة من الخلايا روهون اللحية، مثل mechanosensitivity الخاصة بهم. ودعما لهذا، والعديد من المؤلفات حل (على سبيل المثال، والمكونات الأيونيةوالأسمولية) تم اختبارها، وأيا منها لم تمنع هذا السلوك من خلايا روهون اللحية.
  2. تشريح اليرقات للتسجيلات من خلايا روهون اللحية
    ملاحظة: في 7 يرقات DPF، يجب إزالة العضلات المحيطة بالحبل الشوكي الظهري. اتبع الخطوات 3.1.1 إلى 3.1.15 (مع يرقة استبداله باللاعب الجنين) قبل العلاج مع الانزيم.
    1. لإزالة العضلات، واحتضان اليرقة مع 0.05٪ كولاجيناز لمدة 1 دقيقة.
    2. إزالة كولاجيناز قبل الشطف إعداد ~ 5 مرات مع حل رينغر. اتبع مع ~ 5 يشطف من حل خارج الخلية تماما لإزالة كولاجيناز.
    3. تنفيذ ما تبقى من تشريح بعد تصاعد غرفة تسجيل على مرحلة من مراحل المجهر للتلاعب تسجيل. إرفاق البورسليكات سميكة الجدران التصحيح micropipette (الشكل 2B، أسفل) لصاحب الكهربائي وكسر غيض من micropipette بالفرشاة برفق على الجزء السفلي منغرفة السيليكون.
    4. استخدام micropipette كسر قليلا لإثارة العضلات بعيدا وفضح الحبل الشوكي الظهري. لإزالة الألياف العضلية من إعداد وتطبيق شفط عن طريق أنابيب موصولة إلى منفذ حامل الكهربائي. استخدام micromanipulator لتحريك micropipette على طول الالياف العضلية أثناء تطبيق الشفط.
      ملاحظة: الهدف من ذلك هو أولا استخدام micropipette لتخفيف ميكانيكيا العضلات ومن ثم تمتص بعيدا وإزالة ألياف العضلات الفردية. في بعض الأحيان، أثناء إزالة العضلات، وmicropipette انسداد مع النسيج شفط.
      1. لتنشيط micropipette، فرشاة micropipette ضد السفلي من الغرفة، وكسر قليلا من الحافة، في حين تهب الهواء من خلال أنابيب لطرد محتويات.
        ملاحظة: إذا كان حجم رأس micropipette يصبح كبير جدا، قد تكون هناك حاجة لmicropipette الجديد. حجم رأس micropipette أكثر خطورة عند إزالة طبقات العضلات البنودosest إلى الأغشية المحيطة بالحبل الشوكي أو السحايا (نصائح micropipette صغيرة تسمح للعمل أكثر رقابة).
    5. إزالة السحايا كما هو موضح في الخطوات 3.1.18-3.1.20 باستخدام micropipette الجديد (الشكل 2B، أسفل).

الشكل (4)
الشكل 4: تشريح الجانبي للحبل الشوكي الزرد. تصاعد الأجنة الزرد في اتجاه جانبي يسهل الوصول إلى الخلايا العصبية الحركية. يتم تنفيذ إزالة العضلات وتشريح السحايا لكشف الخلايا العصبية الحركية تحت المجهر تستقيم تكييفها مع هدف 40X الغمر بالماء (انظر الشكل 2). وتقع (A) أجسام الخلايا العصبية الحركية البطني وأفقيا داخل الحبل الشوكي. وترد الأجنة إلى غرفة بحيث يواجه الجانب الظهري من صاحب القطب.لاحظ أن الغراء خياطة يبدو البيضاء بمجرد أن يصلب (النجمية). بمجرد مقطوع الدماغ المؤخر (أ)، وقطع الجلد بشكل سطحي عدة مرات في موقع (ب) الذيلية إلى الدماغ المؤخر باستخدام micropipette الزجاج. تخفيضات إضافية سطحية (ج)، عمودي على المجموعة الأولى (ب)، تشكل علامة تبويب الجلد التي ملاقط يمكن انتزاع لإزالة الجلد. (BG) إن micropipette الزجاج فارغة، وانسحبت لفترة قصيرة، ورأس مدبب (الشكل 2B، أسفل)، وتعلق على حامل الكهربائي. وناور micropipette باستخدام micromanipulator لتشريح غرامة لاحق وإزالة الأنسجة العضلية. (B) يتم تقسيم غيض من micropipette الزجاج أولا قليلا بالفرشاة برفق على الجزء السفلي من الغرفة، وخلق نهاية خشنة وقطر الحافة أكبر. تم نقل micropipette على طول ألياف العضلات في حين يتم تطبيق الشفط. تتم إزالة الألياف العضلية طبقة واحدةفي الوقت المناسب لمنع تعطل السحايا الأساسية. في الأجنة، يتم إزالة طبقات العضلات الظهرية الأكثر أولا، لأن هذه تميل إلى أن تكون أرق. لم تتم إزالة الجلد من أكثر hemisegments الذيلية (السهم). تمت إزالة (C) في النصف الظهري للعضلات في hemisegment واحدة (السهم). (D) خطوط سوداء ترسيم hemisegment خالية من الألياف العضلية، مع السحايا سليمة تغطي النخاع الشوكي (النجمة). (EE ') باستخدام micropipette، يتم تطبيق الضغط على السحايا في موقف الظهرية قليلا إلى somata الخلايا العصبية الحركية. سريعة، قصيرة، والحركات الجانبية من micropipette تؤدي إلى ثقب السحايا. (FF ') متقدمة وmicropipette البطني، نحو الجانب البطني من hemisegment، ورفع لفصل السحايا من الأنسجة العصبية. ومقطوع (GG ') السحايا عن طريق تحريك micropipette rostrally على طولhemisegment. الخلايا العصبية تظهر على الفور من الحبل الشوكي المكشوفة ويمكن الوصول إلى أقطاب التصحيح (السهم) الآن. الحانات النطاق = 500 ميكرون في (A)؛ الحانات النطاق = 100 ميكرون في BG (كما هو موضح في لوحة B).

  1. تشريح الأجنة للالخلايا العصبية الحركية والتسجيلات عصبون
    1. وضع الجنين في غرفة التشريح تحتوي على حل قارع الأجراس ولشل حركة الجنين مع تريكين، كما في الخطوة 3.1.1.
    2. جبل الجنين أفقيا، مع يواجه الجانب الظهري الجانب من الغرفة التي هو الأمثل للمستخدم (يعتمد عادة على الطغيان). اتبع الخطوات 3.1.2-3.1.17 والتأكد من أن الجنين لا يزال شقة ضد السيليكون (الشكل 4A و 4A).
    3. استخدام micropipette البورسليكات سميكة الجدران مع طرف الذي تم تقسيمه إلى ~ 25 ميكرون لكشط وشفط العضلات بعيدا وفضح السحايا، كما هو موضح في الخطوات 3.2.4-3.2.4.1 (الشكل 4B - <قوي> 4D).
    4. حالما تتم إزالة طبقات العضلات من hemisegment (ق) من الفائدة (الشكل 4D)، استبدال micropipette الزجاج مع واحد جديد يحتوي على معلومات سرية سليمة (الشكل 2B، أسفل). ثقب السحايا في الموقف الذي هو الظهرية إلى الخلايا العصبية المستهدفة. باستخدام micromanipulator، ودفع micropipette إلى أسفل على السحايا ومن ثم نقله على وجه السرعة جانبية المسيل للدموع واجتياز السحايا (الشكل 4E و4E).
    5. على تمزيق السحايا، ودفع ورفع micropipette لرفع السحايا بعيدا عن الحبل الشوكي (الشكل 4F و4F). نقل micropipette rostrally لتمزيق غشاء على طول من hemisegment (الشكل 4G و 4G).
      ملاحظة: للحصول على تسجيلات من خلايا روهون اللحية والخلايا العصبية الحركية الأساسية، يقتصر تشريح لإزالة السحايا بعيدا عن فورياالمنطقة المستهدفة ه. في المقابل، للحصول على تسجيلات من interneurons والخلايا العصبية الحركية الثانوية، فمن الضروري إزالة الخلايا العصبية في النخاع الشوكي التي تعيق الوصول إلى الخلية من الفائدة. وفي الحالة الأخيرة، بسبب تعطل واسعة من الدوائر الحبل الشوكي، ودراسات تقتصر على تحليل الجوهرية خصائص الغشاء الكهربائية.

4. تسجيلات الكهربية من العمود الفقري الخلايا العصبية

  1. للحصول على تسجيلات من خلايا روهون اللحية والخلايا العصبية الحركية، استخدم البورسليكات سميكة الجدران الشعرية الزجاج سحبت لمقاومة ~ 3 MΩ عندما تمتلئ حل ماصة (الشكل 2B، أسفل).
    1. الضغط الإيجابي التي تهب بلطف عبر الأنابيب التي تعلق على حامل الكهربائي قبل غمر micropipette في الحمام.
      ملاحظة: الضغط الإيجابي يمنع الحطام من انسداد طرف micropipette والحفاظ من خلال تحويل ثلاثي محبس إلى خارج صosition. مرة واحدة بالقرب من الخلايا العصبية المستهدفة، وضغط إيجابي يؤدي إلى المسافة البادئة المميزة لغشاء الخلية، وهو مؤشر مفيدة أن micropipette قريب بما فيه الكفاية لبدء تشكيل الختم.
    2. الافراج عن الضغط الايجابي من خلال تحويل صمام محبس إلى الوضع المفتوح أثناء تطبيق شفط ضوء إضافي من خلال لسان حال.
    3. بعد تشكيل GΩ ختم بين غشاء الخلية وغيض micropipette، وتطبيق نبضات قصيرة من الشفط لتمزق الغشاء وتحقيق تكوين خلية كاملة.
    4. بعد إنشاء تكوين خلية كاملة مستقرة، مع مقاومة إدخال 500 MΩ والمقاومة وصول 10 MΩ، الحصول على التسجيلات في أي وضع voltage- أو المشبك الحالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد سجلت بنجاح من الخلايا العصبية روهون اللحية في 17 HPF الأجنة خلال 7 يرقات DPF (الشكل 5A و5B). عندما سجلت خلايا روهون اللحية، وقد شنت إعداد الجانب الظهري. يسمح هذا التركيب لتحديد واضح للخلايا روهون اللحية بناء على مواقفهم ظهري سطحية والأحجام سوما كبيرة. تأكيد الهوية بالاضافة الى تصديق والنمطية hyperpolarized إمكانات غشاء يستريح من هذه الخلايا العصبية (الشكل 5، الجدول الشكل) 6، 54. وعلاوة على ذلك، والخلايا العصبية الحسية الأولية، الخلايا العصبية روهون اللحية تفتقر مدخلات متشابك. لذلك، في ظل غياب التحفيز الكهربائي، يجب أن تحدث أي تغييرات في غشاء المحتملة أثناء تسجيل في وضع المشبك الحالي (الشكل 5B). منذ التسجيلات الأولية من خلايا روهون اللحية في الزرد أجريت <سوب الطبقة = "XREF"> 6، ومختلف خطوط المعدلة وراثيا (على سبيل المثال، تيراغرام (islet2b: GFP)، تيراغرام (NGN: GFP)، وتيراغرام (isletss: GFP)) وقد ولدت التي تعبر عن صحفيين الفلورسنت في هذه الخلايا العصبية، زيادة تيسير التعرف عليهم 55 و 56 و 57.

الرقم 5
الشكل 5: voltage- الجامع الخلية والمشبك الحالي تسجيلات من الخلايا العصبية روهون اللحية في 1 و 2 DPF الأجنة و 7 يرقات DPF. (A) تسجيلات الجهد المشبك من الخارج والداخل التيارات التي تم الحصول عليها من الخلايا العصبية روهون اللحية في 1- (خط أسود رفيع)، 2- (خط أسود سميك)، و 7 DPF (خط رمادي) الأجنة / اليرقات. وكانت إمكانية عقد -80 وقد أثارت بالسيارات والتيارات التي كتبها خطوة depolarizing إلى +20 بالسيارات. وأثار (B) إمكانات العمل واحدة من قبل وجيزة (1 مللي ثانية) الحاليحقن (~ 0.35 غ) إلى الخلايا العصبية روهون اللحية من 1- (خط أسود رفيع)، 2- (خط أسود سميك)، و 7 DPF (خط رمادي) الأجنة / اليرقات. (B ') في غياب التحفيز الكهربائي، أي تغييرات في غشاء المحتملة، مثل اللاإستقطابات depolarizations بعد المشبكي عفوية، تحدث في الخلايا العصبية روهون اللحية. يلخص الجدول أقحم قيم يستريح إمكانات غشاء الخلايا العصبية المسجلة من روهون اللحية من 1- (ن = 21) و2- (ن = 9) DPF الأجنة و7- (ن = 7) يرقات DPF. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

خطوط المعدلة وراثيا التي تسمح بتحديد لا لبس فيه من أخرى فرعية الخلايا العصبية في العمود الفقري وتتوفر أيضا. ومن بين هؤلاء، خط mnx1 المعدلة وراثيا تيراغرام (mnx1: GFP) يعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري بعد فترة وجيزة مواصفاتها (~ 14-16 HPF) <سوب الطبقة = "XREF"> 58 و 59. نظرا لتحديد المواقع النمطية من الخلايا العصبية الحركية الأساسية في كل hemisegment (الشكل 6A)، جنبا إلى جنب مع التعبير عن GFP في راثيا mnx1، فمن الممكن لتحديد مختلف أنواع فرعية الخلايا العصبية الحركية الأساسية (الشكل 6B و6C). بما في ذلك صبغة الفلورسنت في حل القطب تسجيل يسمح لتصور مسارات محور عصبي، وتوفير تأكيدا إضافيا للهوية الخلايا العصبية الحركية، وكذلك التعبير عن بعض interneurons GFP في تيراغرام (mnx1: GFP) خط. بدلا من ذلك، خط المعدلة وراثيا أخرى تتيح تحديد الخلايا العصبية الحركية هو خط ET2 60.

الشكل (6)
الشكل (6): الجهد الجامع الخلية والمشبك الحالي تسجيلات من الخلايا العصبية الحركية من 1 DPF امبري الزردالسراج. (A) رسم كاريكاتيري يصور معالم شكلية محددة من الأنواع الفرعية الخلايا العصبية الحركية الأساسية الموجودة في الحبل الشوكي الزرد. ويتم تحديد الخلايا العصبية الحركية الأولية من موقف سوما في غضون شريحة (أي منقاري [روب]، [وسطي MIP]، أو الذيلية [كاب]) 45. وبالإضافة إلى ذلك، كل سلالة يمتد محور عصبي إلى المحيط عبر مسار واضح. الجمع بين استخدام تيراغرام (mnx1: GFP) خط وصبغ العلامات يكشف جذع محور عصبي النمطية وهوية النوع الفرعي الخلايا العصبية الحركية خلال التسجيل. باستخدام الأساليب المعروضة هنا، فمن الممكن أن بالتسلسل سجل من ثلاثة مختلفة الأنواع الفرعية الخلايا العصبية الحركية الأساسية ضمن نفس hemisegment. وترد (B) تسجيلات الجهد المشبك التي تم الحصول عليها من شرطة عمان السلطانية، برنامج التأمين الصحي، وكأب، وكلها في hemisegment احد. واستخدمت خطوة الجهد ل+20 بالسيارات للحصول التيارات من المحتمل عقد -80 بالسيارات. (C) خلال المشبك الحالي صecordings من شرطة عمان السلطانية، برنامج التأمين الصحي، وكأب، وقصيرة (1 مللي ثانية، ~ 0.4 غ) طبقت الحقن الحالية لإطلاق إمكانات العمل. عقدت غشاء المحتملة في ~ -65 بالسيارات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

والفرق الرئيسي بين الخلايا العصبية الحركية الابتدائية والثانوية هو somata أكبر من الخلايا العصبية في وقت سابق من المولد. ومع ذلك، ثانوية فرعية الخلايا العصبية الحركية ليست تحديدها حسب حجم سوما أو الموقف. للحصول على تسجيلات من الخلايا العصبية الحركية الثانوية محددة، واثنين من خطوط المعدلة وراثيا، تيراغرام (gata2: GFP) وتيراغرام (islet1: GFP)، وقد استخدمت لتحديد الخلايا العصبية الحركية الثانوية مع إسقاط البطني وظهريا محاور، على التوالي 55، 61. ومع ذلك، فإن الخلايا العصبية الحركية الثانوي النوع الفرعي الثالث موجود في الحبل الشوكي الزرد، مع الذخائر المتروكةنانوثانية أن ظهريا المشروع والبطني 62. وفقا لذلك، صبغ يمكن استخدامها لملء الخلايا العصبية الحركية الثانوية خلال التسجيلات لتحديد أنواع فرعية على أساس التشكل (الشكل 7A) 8، 9. في كثير من الأحيان، خلال الجهد المشبك (الشكل 7B، العلامات النجمية) أو تسجيلات المشبك الحالي (الشكل 7C و7C، السهام) من الخلايا العصبية الحركية الثانوية، يتم تسجيل الأحداث عفوية أو متشابك.

الرقم 7
الرقم 7: الجهد الجامع الخلية والمشبك الحالي تسجيلات من الخلايا العصبية الحركية الثانوية من 2 DPF الأجنة. (A) في تيراغرام (gata2: GFP) خط، واثنين من مختلف الأنواع الفرعية الخلايا العصبية الحركية الثانوي تعبر عن GFP 62. في hemisegment اليسار، الخلايا العصبية الحركية الثانوية بطني(النجمة والسهم تشير سوما والمحور، على التوالي). في hemisegment المجاورة، على اليمين (الذيلية)، هناك بطني / الظهرية الخلايا العصبية الحركية الثانوي (النجمة تشير سوما، السهام تشير إلى محاور اثنين، واحد إسقاط البطني [السهم السفلي] وظهريا الآخر [كبار السهم]). وصفت هذه الخلايا العصبية مع صبغ أحمر فلوري خلال التسجيلات. للتعرف على بطني / الظهرية الخلايا العصبية الحركية الثانوية، فمن الأهمية بمكان لضمان أن تشريح لا يزيل العضلات في hemisegment الذيلية المتاخمة، وبالتالي إتلاف أو إزالة محور عصبي ظهري. بعد التسجيل، ما زال سوما الخلايا العصبية التي تعلق على micropipette كما يتم سحبها بعيدا عن إعداد (أعلى النجمة اليمنى). عند استخدام الأصباغ لملء الخلايا العصبية خلال التسجيلات، الصبغة غالبا ما تسرب في حين أن القطب هو في الحمام، مما أدى إلى الخلفية الحمراء الفلورسنت مرئية في الحبل الشوكي والحبل الظهري (النجمة أسفل في منقاري [يسار] hemisegment < / م>). وقد تم الحصول على (B) تسجيلات الجهد المشبك من بطني وبطني / الظهرية الخلايا العصبية الحركية الثانوية. خطوات الجهد (ل-30، -10، +10، +30، +50، +70، +90، و+110 فولت) أثارت الخارجي والتيارات الداخل. إمكانات العمل غير مثبت / قد يكون اللاإستقطابات depolarizations موجودة في التسجيلات (النجمة). طبقت (C) خلال تسجيلات المشبك الحالي من الخلايا العصبية الحركية الثانوية، وجيزة (1 مللي ثانية) الحقن الحالية لزيادة السعة إلى الخلايا العصبية لتحريك إمكانات العمل (النجمة). (C ') أمثلة من إمكانات العمل واحدة تسببت في الخلايا العصبية الحركية الثانوية عن طريق الحقن الحالية ~ 0.4 غ ترد. في هذه المرحلة، ويلاحظ أيضا إمكانات العمل العفوي (C و C، السهام). (D) لفترات طويلة (100 مللي ثانية) الحقن الحالية (~ 0.35 غ) تؤدي الى اطلاق النار المتكرر من إمكانات العمل. عقدت غشاء المحتملة في ~ -65 بالسيارات.تحميل / 55507 / 55507fig7large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة هنا تسمح لتوصيف الكهربائية والمورفولوجية من الخلايا العصبية الحسية والحركية من الأجنة الزرد بعد تشريح الحد الأدنى من الحبل الشوكي. تبقى الخلايا العصبية السليمة لا يقل عن 1 ساعة، والمهلة الزمنية المفروضة على هذه التسجيلات. وقد سجلت الخلايا العصبية باستخدام تكوين خلية كاملة القياسية، وكذلك من بقع الأنوية. والأسلوب الأخير يقلل قضايا الفضاء المشبك الذي يمكن أن يحول دون دراسة مفصلة الفيزيائية الحيوية التيارات أيون 9.

تحديا هاما هو تحقيق التعلق الراسخ للجنين أو يرقة إلى غرفة من أجل إزالة الجلد ولإجراء تشريح محدود المطلوبة لتوفير الوصول إلى الخلايا العصبية في المصالح. يحتاج إعداد أيضا أن يكون المضمون بشكل صحيح إلى غرفة تسجيل لكامل الخلية أساليب التصحيح، المشبك. وهناك طريقة التي تلبي هذا التحدي من خلال استخدام الغراء البيطري خياطة إرفاق الجنين أو يرقة لوصفت غرفة التشريح / تسجيل هنا، وهو نهج قد استخدمت لتشريح الكائنات النموذج الأخرى (على سبيل المثال، ذبابة الفاكهة) 63. من تجربتنا تدريب الآخرين، نجد أن الخطوة الأكثر أهمية لإتقان هو التسليم المراقب والدقيق لكميات صغيرة من الغراء. هنا، وتناقش جهاز موزع الغراء التي تسمح للمستخدم لتطبيق الضغط السلبي والإيجابي لتحميل الغراء في أو لطرده من غيض من micropipette. باستخدام الغراء خياطة والأجنة واليرقات يمكن ترتبط بقوة مع الغرفة والموجهة إما الجانب الظهري صعودا أو أفقيا. وبهذه الطريقة، تتوفر خيارات مختلفة للوصول لمجموعة متنوعة من الخلايا العصبية. أيضا، وطبقة من المطاط الصناعي السيليكون في أسفل الغرفة يمكن أن يكون حتى أرق من 1 ملم المحددة هنا، وتوفير مزايا البصرية المحتملة. طريقة أخرى، أكثر شيوعا إرفاق إعداد لغرفة تسجيل، ينطوي استخدام دبابيس التنغستن غرامة 1 <سوب>، 2، 3، 4، 5. في حين أن أساليب تختلف، سواء سماح بالوصول الكهربية للخلايا العصبية في العمود الفقري الزرد، وتكفل للباحثين الخيارات التي يمكن اختيارها على أساس الأهداف والتحديات التي تواجه التجربة.

إعداد الزرد وصفها هنا يسمح لدراسة الكهربائية والمورفولوجية من الخلايا العصبية في العمود الفقري في الموقع خلال مراحلها الأولى من التمايز. من خلال تسجيل من الخلايا العصبية في العمود الفقري باستخدام هذه الأساليب، لقد اكتسبت نظرة ثاقبة على الآثار الخلوية العديد من الطفرات، حتى قبل تحديد الجين lesioned 6 و 64 و 65.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (F32 NS059120 إلى RLM وR01NS25217 وP30NS048154 إلى ABR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore Corning 431096
Syringe filter 0.2 mm Whatman 6780-2502
Tricaine Sigma A-5040 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt 
α-bugarotoxin Tocris 11032-79-4
Tetrodotoxin Tocris 4368-28-9
Alexa-549 hydrazine salt Molecular Probes A-10438 fluorescent dye
Spin-X centrifuge tube filter Corning 8161
Glass microscope slide Fisher 12-550C
Sylgard silicone elastomer kit Dow Corning 184 silicone elastomer
Petri dishes Falcon 351029
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0038 inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)
Borosilicate glass capillaries Drummond Scientific 1-000-1000-100 inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)
Miniature barbed polypropylene fitting  Cole-Palmer 6365-90
Vetbond tissue adhesive  3M 1469SB
Collagenase XI Sigma C7657
Microelectrode puller Sutter Instruments  Model P-97 
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Head stage Molecular Devices CV203BU
Motorized micromanipulator   Sutter Instruments MP-285
Tygon tubing Fisher 14-169-1B ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)
Electrode holder Molecular Devices 1-HC-U
Pharmaseal Three-Way Stopcocks  Baxter K75
Digitizer Axon Instruments Digidata 1440A
Inverted microscope  Zeiss Axioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan objective Zeiss
Data acquisition and analysis software  Axon Instruments PClamp 10 - Clampex and Clampfit 
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-97
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Recording Solutions (in mM)
All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. 
Dissection/Ringer’s solution 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)
Pipette (intracellular) recording solution 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).
Alexa-594 hydrazine salt stock solution.  Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution  with a centrifuge tube filter.
Name Company Catalog Number Comments
Immobilizing agents
0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C.
For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media
250 mM α-bungarotoxin Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C.
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.
1 mM Tetrodotoxin Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C.
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
  2. Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
  3. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
  4. Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
  5. Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
  6. Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
  7. Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
  8. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
  9. Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
  10. Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
  13. Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
  14. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
  15. Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
  16. Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
  17. Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
  18. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  19. Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
  20. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  21. Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
  22. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
  23. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  24. Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
  25. Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
  26. Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
  27. Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
  28. Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
  29. Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
  30. Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
  31. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
  32. Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
  33. Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
  34. Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
  35. Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
  36. McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
  37. McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
  38. McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
  39. Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
  40. Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
  41. Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
  42. Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
  43. Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
  44. Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
  45. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
  46. Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
  47. Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
  48. Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
  49. Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
  50. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
  51. Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
  52. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
  53. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
  54. Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
  55. Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
  56. Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
  57. Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
  58. Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
  59. Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
  60. Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
  61. Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
  62. Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
  63. Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
  64. McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
  65. Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).

Tags

علم الأعصاب، العدد 122، الزرد، الخلايا العصبية في العمود الفقري، الخلايا العصبية الحركية، الخلايا العصبية الحسية، خلية روهون اللحية، كاب، الكهربية، خلية كاملة، والتصحيح المشبك
الزرد<em&gt; في الموقع</em&gt; الحبل الشوكي التحضير للتسجيلات الكهربية من العمود الفقري الحسية والحركية العصبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moreno, R. L., Josey, M., Ribera, A. … More

Moreno, R. L., Josey, M., Ribera, A. B. Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons. J. Vis. Exp. (122), e55507, doi:10.3791/55507 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter