Summary
Эта рукопись описывает методы электрофизиологических записей из спинномозговых нейронов полосатого данио эмбрионов и личинок. Препарат содержит нейроны на месте и часто включает в себя минимальное рассечение. Эти методы позволяют электрофизиологическому исследование различных нейронов спинного мозга, от первоначального приобретения электрической возбудимости через ранние личиночные стадии.
Abstract
Рерио, впервые представлена в качестве модели развития, завоевал популярность во многих других областях. Легкость выращивания большого количества быстро развивающиеся организмы, в сочетании с эмбриональной оптической прозрачностью, служила в качестве исходных убедительных признаков этой модели. За последние два десятилетия, успех этой модели дальнейшего движения его аменабельностью крупномасштабных мутагенеза экранов и легкостью трансгеноза. Совсем недавно, генные редактирования подходы расширили мощность модели.
Для нейроразвития исследований, данио эмбриона и личинки представляют собой модель, в которой может быть применено несколько методов. Здесь мы сосредоточимся на методах, которые позволяют исследование существенного свойства нейронов, электрической возбудимость. Наша подготовка к электрофизиологическому исследованию данио нейронов спинного мозга предполагает использование ветеринара шовного клея, чтобы обеспечить подготовку к записи камере. Альтернативные способы записииз эмбрионов данио и личинок включают прикрепление препарата к камере с помощью тонкой вольфрамовой штифт 1, 2, 3, 4, 5. Вольфрамовый контактный наиболее часто используется для монтажа препарат в боковой ориентации, хотя она была использована для установки личинки спинной стороной вверх 4. Шовный клей используется для установки эмбрионов и личинок в обоих направлениях. Используя клей, минимальная диссекция может быть выполнена, обеспечивая доступ к нейронам спинного мозгу без использования ферментативной обработки, тем самого избегая любое полученное повреждение. Однако, для личинок, необходимо применять краткую ферментативную обработку для удаления мышечной ткани, окружающей спинной мозг. Методы, описанные здесь, были использованы для изучения внутренних электрических свойств моторных нейронов, интернейронов и сенсорных нейронов в несколько девелопментел ступеней 6, 7, 8, 9.
Introduction
Джордж Стрейзингер вел использование Danio rerio, широко известное как данио, в качестве модельной системы для генетического анализа развития позвоночных 10. Модель предлагает несколько преимуществ, включая: (1) относительно простое и недорогое животноводство; (2) внешнее оплодотворение, обеспечивает легкий доступ к эмбрионам из самых ранних стадий развития; и (3) прозрачный эмбриона, что позволяет прямые и повторные наблюдения клеток, тканей и органов, как они образуют.
В течение последующих десятилетий несколько достижений дальнейшего увеличения мощности данио модели. В частности, передние генетические экраны и усилия секвенирования целого генома играет ключевую роль в идентификации мутаций и генов , имеющих решающее значение для многих процессов развития 11, 12, 13, 14,«> 15, способов клонирования 16. Шлюз позволили рутинное применение трансгенных подходов 17, 18. Последние достижения в области редактирования генома, на примере активатора транскрипции типа (Таленс) и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) -Cas9 нуклеазы, позволяют целевой введение мутаций, а также выбивания и забивные подходы 19, 20, 21, 22. в совокупности эти методы делают данио мощной моделью для изучения генетических механизмов , лежащих в основе конкретных форм поведения и нескольких заболеваний человека 23, 24, 25, 26, 27.
Эта работа сосредоточена на разработкепсихическая регуляция и роль электрической активности нейронов развития. Основное внимание на спинной мозг, для которых данио модель обеспечивает ряд преимуществ. Во-первых, это относительно легко получить доступ к данио на эмбриональных и личиночных стадий; Таким образом, можно изучать функции спинного мозга во время стадий развития , которые имеют меньше нейронов и более простой схемы 28, 29. Кроме того, данио спинной мозг имеет разнообразный набор нейронов, похожими на других позвоночных, как продемонстрировано характерных и отличительных форм транскрипционных факторов 30, 31, 32, 33, 34, 35.
Большинство исследований в данио, которые направлены, чтобы раскрыть механизмы, лежащие в основе функции спинного мозга цепей, особенноте , которые поддерживают двигательную, по понятным причинам сосредоточены на личиночной стадии 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Тем не менее, многие из нейронов , которые образуют спинномозговые локомотивных сети инициировать их дифференциации на ранних эмбриональных стадиях, ~ 9-10 ч после оплодотворения (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. В связи с этим, пониманием того, как морфологические и электрические свойства нейронов спинного мозга возникают и изменения между эмбриональными и личиночными стадиями важно для OveraLL понимание формирования опорно-двигательного аппарата и схемы функции.
Методы рассечение, описанные здесь, позволяют патч зажим записи из нейронов спинного мозга и были успешно применены на эмбриональной стадии (~ 17-48 HPF) и личиночной стадии (~ 3-7 дней после оплодотворения [денье]). Такой подход ограничивает количество рассечения, необходимое для обеспечения доступа к нейронам интереса. Протокол отличается от большинства других опубликованных методов для записи с данио нейронов спинного мозга в этом ветеринаром шовного клея используется, а не тонкой вольфрамовой штифта, чтобы прикрепить эмбрион или личинку к записи камеры. Наличие двух различных подходов (например, шовный клей по сравнению с вольфрамовым штырем) для крепления данио эмбрионов или личинок для электрофизиологического анализа обеспечивает исследователь с альтернативными вариантами для достижения своих конкретных экспериментальных целей.
Во-первых, процедуры доступа и записи из поп-музыки авляет первичных сенсорных нейронов, Rohon-Beard клетки, описаны. Клеточные тела этих нейронов лежат в спинном спинном мозге. Rohon-Борода клетка существует в многочисленных видах позвоночных, дифференцируется на ранних стадии развития, и лежит в основе эмбрионального ответа сенсорного 6, 44, 47, 48.
Во-вторых, процедуры доступа и записи с спинальных мотонейронов детализированы. Рыбок данио спинальные двигательные нейроны возникают в течение двух волн нейрогенеза. В ранее рожденных первичных моторных нейронах возникают в конце гаструляции (~ 9-16 HPF), только с 3-4 первичными двигательными нейронами , присутствующими в hemisegment 45, 46, 49. В противоположность этому, позже родилась популяция вторичных двигательных нейронов является более многочисленны и возникает в течение длительного периода времени, начиная с ~ 14 HPFэф "> 45, 50. Вторичный двигательный нейрон генез в сегментах среднего ствола в основном завершен на 51 HPF 50. Вторичные моторные нейроны считаются аналогом моторных нейронов в амниотых 46. Интересно, что супраспинальные нейроны, с помощью допамина, регулируют передвижение в личинке и вторичные двигательный нейрон генезе у зародыша и молодой личинка 50, 51. первичные и вторичные моторные нейроны каждый из которых содержит несколько различных подтипов. Каждые первичных двигательные нейроны подтипов проекты периферийных аксонов , которые иннервируют характерную группа мышц, что приводят к стереотипному, идентификации аксонов траектории. Как правило, вторичные моторные нейроны следовать аксонального пути, ранее установленных первичных двигательных нейронов. Таким образом, по отношению к аксонов траекторий, первичные и вторичные моторные нейроны сходны, за исключением того, что толщина и аксонов somata размер Aснова больше для первичных двигательных нейронов 45.
В-третьих, методы записи из нескольких типов интернейронов обсуждаются. Тем не менее, в этих случаях, ограниченное количество удаления других клеток спинного мозга требуется, и, следовательно, спинной мозг менее нетронутый, чем для записей из клеток Rohon-Beard или моторных нейронов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных были утверждены уход и использование комитетом Институциональных животных путем (IACUC, Бюро лабораторных животных ресурсов, Университет Колорадо Anschutz Medical Campus).
1. рерио Husbandry
- Повысить и поддерживать взрослые данио (Danio rerio) на 28,5 ° С на / 14 ч цикла света 10 ч темного и при соответствующей обработке воды и обменом 52.
- Повышение эмбрионов данио / личинок на 28,5 ° С в среде эмбриона , пока они не достигают желаемого этапа (например, 2 DPF).
2. Подготовка материалов Препарирование
- Клей диспенсер для рассечения данио
Примечание: Этот протокол предполагает использование ветеринара шовного клея, чтобы прикрепить подготовку к записи камеры. Успешное использование шовного клея требует применения небольших количеств клея в контролируемым образом. Клей начинает твердеть, как только онвстречает водную среду. Таким образом, сделать клей в микропипетки и доставить небольшие суммы, используя самодельный «клей дозатор», который позволяет применение отрицательного или положительного давления через рот. Центральная часть клея дозатором является отверстие стекла, часть , которая входит в пакет , содержащий боросиликатного тонкостенные стеклянные капилляры (Фигура 1А). На одном конце, отверстие соединено через кусок гибкой трубки к мундштуку, в то время как другой конец имеет стеклянные микропипетки (рисунок 1).- Извлеките черный шарик из одного стеклянного отверстия и заменить его с белым резиновым адаптером из другого стекла отверстия (рис 1В и 1С).
Примечание: Это двойное переходник крышек отверстие стекла позволяет подключаться к стеклянной микропипетке на одном конце, а на другом конце, чтобы кусок гибкой трубки через небольшой, прямой полипропиленовый фитинг (рис 1B, вставка). <литий> Вырезать кусок гибкой трубки с длиной ~ 38 см. Установите мундштук (например, желтый 200 мкл микропипетки наконечник) до конца гибкой трубки не подключен к отверстию стекла.
Примечание: часть трубки должна быть достаточно длинной , чтобы позволить манипуляции стеклянной микропипетки под рассекает в то время как объем микропипетка желтого наконечник находится во рту (рис 1D). - Извлеките черный шарик из одного стеклянного отверстия и заменить его с белым резиновым адаптером из другого стекла отверстия (рис 1В и 1С).
Рисунок 1: Клей дозатор. Отверстие (АС) Стакан подключается к гибким насосно - компрессорным трубам на одном конце и стеклянной микропипетке на другом. Резиновые адаптеры позволяют крепление с помощью небольшого полипропиленового фитинга (B, вставка) в насосно - компрессорные трубы и, в конечном счете, к стеклянной микропипетке на другом конце. (D) Окончательный клей дозатор имеет мундштук (например, изготовлен из плакрестики наконечник пипетки) на одном конце трубки и отверстие стекла с присоединенной микропипеткой на другой (стрелке).
- Рассечение / записи камеры
Примечание: рассечение камера также служит в качестве записи камеры электрофизиологии. Камера образована на предметном стекле с использованием предварительно нарезанные куски отвержденного силиконового эластомера (рис 2A).- Для приготовления силиконового эластомера, добавляют основание и отвердитель к пластиковой конической трубе при соотношении 4: 1, соответственно.
- Смешайте базу эластомера и отвердитель тщательно и вылить смесь в два 100 мм чашки Петри. Налейте эластомер толщины <1 мм в одной чашке Петри и ~ 2,5 мм, с другой стороны.
- Разрешить силиконовый эластомер для отверждения под воздействием воздуха в течение ~ 4-5 дней. Если вылечены эластомер необходимо раньше, инкубировать ее при 60 ° С.
- Вырезать куски отвержденного силиконового эластомера до следующих размеров:
- Из ~ 1 мм-thick вылечены эластомер, вырезали ~ 3,8 х 6,3 см прямоугольник; эта часть служит в качестве нижней части камеры (фиг.2А). Из отвержденного силикона ~ 2,5 мм толщиной, вырезать прямоугольник ~ 3,8 х 6,3 см. Из последнего прямоугольника, вырезать внутренний прямоугольник ~ 2,5 х 5 см; полученный кадр служит в верхней части камеры (фиг.2А).
- Для того, чтобы сделать / записи камеры рассечение, поместить тонкий силиконовый прямоугольник непосредственно на верхней части предметного стекла (5 х 7,6 см), убедившись в том , чтобы удалить пузырьки воздуха между силиконом и стеклянной (фиг.2А). Поместите силиконовый прямоугольник рамку, вырезанную из толстого эластомера, на верхней части тонкого нижнего слоя силикона.
- Убедитесь , что силиконовые слои хорошо прикрепить друг к другу , и что нет пузырьков воздуха между двумя слоями (фигура 2А).
- После использования демонтировать камеру, удалив толстую рамку прямоугольника силикона от нижней силиконовой яйцекладкиэр, который прикреплен к стеклу. Промыть силиконовые поверхности с DDH 2 O до использования и после каждой сессии записи и сухие с низким линтом салфетками.
- Храните камеру в сухом, чтобы предотвратить рост грибка между двумя кусками силикона.
Примечание: Если токсины или фармакологические агенты, которые не могут легко промыть из силикона, используется, выделять конкретные камеры для этих целей.
Рисунок 2: электрофизиология камера и рассечение инструменты. (А) В камере используется для вскрытий и электрофизиологических записей состоит из предметное стекло , на котором размещены две части отвержденного силиконового эластомера, слой поверх друг друга , чтобы обеспечить раму и дно для колодца. Размер скважины, ~ 2,5 х 5 см, позволяет использовать небольшие объемы (2-2,5 мл) внеклеточной записирешение. Снизу силиконовый слой обеспечивает безопасное позиционирование данио эмбрионами с помощью клея ткани, который не прилипает к стеклу. (B) Стекло микропипетка (сверху) используются для подачи клея во время диссекции. Тонкостенного стекла вытягивается, чтобы создать длинный, конический конец, который позже вырезать, создавая наконечник с диаметром ~ 75 мкм. Конические стекла микропипетка прикреплена к свободному концу клея дозатора (рис 1D, стрелолист) и перед наполнением с клеем на основе применения всасывания. Другая микропипетка (внизу), потянула за тот , которая используется для записи патча-зажим, используются для рассечения заднего мозга и для удаления кожи. (С) Под микроскопом вертикальном, микроманипулятор используется для маневрирования микропипетки для заключительных этапов рассечения. Стакан микропипетка, как и в B, снизу, прикреплена к держателю электрода (стрелка). Удаление мышц достигается с помощьюpplying всасывания через трубопровод , подключенный к выходу воздуха (стрелка). На другом его конце, трубка соединяется с запорным краном (черная стрелкой) , что, на его другой стороне (звездочка), имеет трубку , прикрепленную к мундштуку.
3. Препарирование эмбрионы и личинки для патч-зажим записи из нейронов спинного мозга
Рисунок 3: Спинной рассечение в данио спинного мозга. (АА») После того, как задний мозг рассечение (а) 2-DPF эмбриона, кожа разрезается на левой и правой сторонах эмбриона (б). Второй отрезок, перпендикулярный к первому, затем выполняются (с). Затем кожа приподнимается с помощью микропипетки, позволяя пинцет, чтобы захватить и отодвигать кожу. (B) Снятие кожи обнажает спинной спинной мозг. Ростральные к черной линии, лыжныйп была удалена , а поверхность спинного мозга (звездочка), содержащимся в мозговых оболочках, подвергается воздействию. Кожа остается неповрежденной каудально черной линии (стрелка). (СС») Кончик стекла микропипетки нажатие на мозговых оболочках и быстрые, боковые, короткие движения выполняются для прокалывания мозговых оболочек. (ДД «и ЕЕ») После того, как мозговые оболочки протыкают (ДД «), микропипетки является передовой и (ЕЕ») перемещается рострально рвать мозговые оболочки на два сегмента. Somata из Rohon-Beard нейронов , как правило , возникает при удалении мозговых оболочек (стрелка). (ФГ») В 7-DPF личинки, слои мышц покрывают спинной части спинного мозга, препятствуя доступ к Rohon-Beard нейронов. После удаления кожи, личинка обрабатывают 0,05% коллагеназы. (F) , в 5 мин инкубации с 0,05% коллагеназы является слишком жестким, в результате чегочрезмерному повреждения мышц, о чем свидетельствует ослабленной мышцы (стрелка и вставка). (F») Чрезмерное лечение коллагеназы может также повредить Rohon-Борода нейроны (стрелка), обнаруженные здесь , по их экспрессии GFP в Tg (islet2b: GFP) линии. В Тде (islet2b: GFP) линии, заднекорешковые нейроны ганглия также выражают GFP (Arrowhead). Короче 1 мин инкубации с 0,05% коллагеназы в достаточной степени ослабляет мышцы (G) при сохранении морфологии миотом (стрелка и вставка). (G») Пигментные клетки присутствуют на верхней части самого спинного мышечного слоя (стрелка). (Н и I) , В Тд (islet2b: GFP) линии, Rohon-Beard нейроны (стрелки) и спинальный ганглий (Arrowhead) продолжают выражать GFP в 7 денье. Спинной вид Tg (islet2b: GFP) эмбрионов данио в 2 денье (з)д 7 дение (I). В панели шкале баров = 500 мкм; BE (показано на панели В) Шкала баров = 80 мкм; F 'и G' (показано на панели F) Шкала баров = 200 мкм; Н и I (показано на панели H) Шкала баров = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Препарирование эмбрионов для записей из клеток Rohon-Beard
- Поместите эмбрион в рассечение камере , содержащей ~ 2-3 мл раствора Рингера (фигура 2А). Зафиксировать эмбриона путем добавления ~ 100 мкл 0,4% раствора Tricaine в камеру.
- Извлечь тонкостенные стеклянные микропипетки на микропипетках съемника с использованием нити коробки , чтобы получить длинный тонкий наконечник, аналогичный инъекционную микропипетку (фигура 2В, верхняя часть ) 53.
- Прикрепите вытащил стекло микропипетки на стекло Диаметр отверстияе клея дозатор. Под микроскопом рассекает, используйте пинцет , чтобы сломать кончик стеклянной микропипетки так, чтобы кончик составляет ~ 75 мкм (фигура 2В, вверху).
Примечание: Размер наконечника должен быть достаточно большим, чтобы обеспечить эффективную загрузку клея в наконечник посредством применения отрицательного давления (всасывания во рту) до переднего заполнения микропипетки, но достаточно мал, чтобы позволить точное нанесение клея с помощью положительного давления , - Нагрузка стекла микропипетки с ~ 3-5 мкл путем нанесения клея всасывания через мундштук. Доведите клей заполненный кончик к рассечению камере.
Примечание: Заполнение микропипетки клея требует сильного всасывания. Если микропипетка быстро наполняется слабым всасыванием, наконечник слишком велик. - Поместите эмбрион в камере записи (фиг 3A и 3A»); для записи из эмбрионов и молодых личинок (≤72 HPF), нет необходимости удалять мышечную ткань.
- приноситькончик клея нагруженных микропипеток вблизи головки эмбриона / личинок при сохранении небольшого положительного давления к микропипеткам через рот трубку (для предотвращения проникновения водного раствора). После того, как наконечник находится вблизи головы эмбриона, нанесение достаточного положительного давления, чтобы изгнать небольшую каплю клея на дне камеры.
Примечание: Клей затвердевает, как только в контакте с водным раствором, таким образом, важно, чтобы применить и поддерживать умеренное положительное давление, как он будет помещен в растворе рассечения. - Используйте инструмент секционной контактный для перемещения эмбриона / личинки к капле клея так, чтобы головка соприкасается с клеем. Сориентируйте эмбриона спинной стороной вверх и нажмите на головку, чтобы обеспечить хороший контакт с клеем.
- По мере того как клей медленно затвердевает, используйте рассекает булавку, чтобы снова установите эмбриона / личинку так, что она лежит вентральной стороной вниз, спинной стороной вверх. Dip инструмент рассекает булавки в каплю клея и сделать резьбу клея над и по головеэмбриона для дальнейшего обеспечения своей позиции.
Примечание: Tricaine ускоряет скорость, при которой клей затвердевает. Для того, чтобы иметь больше времени для работы с клеем, используйте минимальное количество Tricaine, необходимое для иммобилизации эмбриона / личинки. Кроме того, скорость отверждения может варьироваться в зависимости от различных партий клея. Соответственно, при использовании новой партии клея, установить его скорость закалки прежде, чем использовать его для рассечения. - После того , как головка надежно прикреплена к силикону и клей затвердеет, в жертве эмбриона / личинке пути рассечения на уровне заднего мозга с другой стеклянной микропипеткой (рис 3A- а и 4A- а).
Примечание: Hindbrain рассечения является методом, который используется здесь для гуманного принесения в жертву животных. Однако, в зависимости от экспериментальных целей (например, изучение фиктивного плавания), другой метод может быть необходимо. - Перед установкой хвост в камеру, снимите кожу от ствола.
- использованиесвежее стекло микропипетка (фигура 2В, нижний) , чтобы поверхностно порезать кожу несколько раз в положении каудальна задний мозг (рис 3A- б и 4A- б). Прокалывают кожу поверхностно, перемещая пипетку перпендикулярно к ростро-каудальном оси на каждой стороне ствола для монтажа дорсально (рис 3A- б) образцы или на открытой стороне ствола для латерально установленных образцов (рис 4A- б).
- Для того, чтобы создать лоскут кожи для пинцета , чтобы захватить, скрести кожу несколько раз с микропипеткой на уровне и перпендикулярно к начальному разрезу на этапе 3.1.10.1 (рис 3A- с и 4A- с).
- С помощью пинцета, постепенно поднимите крышку кожи и подтягивает кожу каудально.
Примечание: Это часто приводит к удалению полностью кожи от ствола. Тем не менее, это sometiтез, необходимые для удаления кожи в нескольких секциях, выполняя повторил выскабливание и вытягивать кожи. Для некоторых применений, частичное удаление кожи может позволить достаточный доступ к сегментам спинного мозга интереса (фиг. и 4В). - Доставить небольшую каплю клея возле хвоста эмбриона / личинки. Используйте этот клей, чтобы прикрепить хвост к нижней части камеры рассечения. На этом этапе, как клей затвердеет, отрегулировать положение ствола с помощью инструмента секционных контактного, чтобы гарантировать, что ствол остается дорсально ориентированным, и что она прочно прикреплена к камере.
- После этого первоначального вскрытия, промыть препарат экстенсивно с раствором Рингера для удаления Tricaine и мусора. Разрешить препарат отдыхать в течение ~ 5 мин.
- Заменить рассечение раствора с внеклеточным решением для записи. При необходимости добавить иммобилизации агента к препарату (например., Α-бунгаротоксин [окончательный Concentration 1 мкМ]).
Примечание: 1 мкМ α-бунгаротоксин удерживающего от 1 до 2 дения эмбрионов в течение ~ 30 мин. Для старших личинок, может потребоваться более высокая концентрация альфа-бунгаротоксин. альфа-бунгаротоксин поддерживается в растворе ванны во время записи, которые обычно выполняются в течение 1 ч. Запись растворы, содержащие двухвалентные катионы, такие как кобальт, не требуют добавления агента иммобилизации. Для экспериментов, требующих длительных периодов записи (более 1 ч), препарат перфузии раствором ванны со скоростью 0,5-1 мл / мин. - Перемещение рассечения камеры с смонтированным эмбрион на стадию вертикального соединения микроскопа, снабженной целью долгосрочной рабочей дистанции в 40X погружения в воде.
Примечание: Этот микроскоп является частью буровой установки, где будет выполняться запись. Буровой установка также должна быть оснащена headstage, усилитель пэтча-кламп, микроманипулятором, и сбор данных / компьютерной системой (фиг.2С). - Смонтировать толстостенной стеклянной микропипетки пустой боросиликатного на держатель электрода из headstage (фигуры 2В, 2С и нижней части , стрелка). Присоединить трубку (внутренний диаметр: 0,16 см, внешний диаметр: 0,32 см, а длина: ~ 90 см) на одном конце к выходу воздуха из держателя электрода (стрелки) , а на другом конце с трехходовым запорным краном (рис 2C , черный наконечник стрелы).
- Поместите мундштук на одном конце другой части насосно - компрессорных труб (~ 60-70 см в длину) и прикрепить ее к трехходовым запорным краном на другом конце (рис 2С, черная звездочка).
Примечание: Эта система труб позволяет применение положительного и отрицательного давления к внутренней части пипетки записи во время формирования уплотнения.
- Поместите мундштук на одном конце другой части насосно - компрессорных труб (~ 60-70 см в длину) и прикрепить ее к трехходовым запорным краном на другом конце (рис 2С, черная звездочка).
- Доведите кончик микропипетки к наиболее дорсальной части спинного мозга и осторожно прокалывают мозговые оболочки. Следуйте с быстрым, коротким, вбок движением в Лоосено мозговых оболочек (рис 3C и 3C»).
- После того, как кончик микропипетки прошел мозговые оболочки, вперед и поднять микропипетки тянуть мозговые оболочки от спинного мозга (рис 3D и 3D»).
- Перемещение микропипетки рострально, продвигаясь течение от 1 до 2 hemisegments подвергать клетки Rohon бороды (рис 3E и 3E»).
Примечание: Рассеките минимальное количество необходимых для мозговых оболочек подвергать только несколько клеток Rohon-Борода. После каждой записи, дополнительное рассечение выполняется, чтобы выявить больше клеток Rohon-бородку. В обоих эмбрионов и личинок, Rohon-Beard нейроны иногда могут лопнуть при контакте с исправлениями микропипетки. Другие нейроны спинного мозга не ведут себя таким образом, предполагая, что это может отражать уникальные свойства клеток Rohon-Beard, например, их механоре-. В подтверждение этого, несколько решений композиций (например, ионные компонентыи осмолярность) была испытана, и никто не предотвратил это поведение клеток Rohon-Beard.
- Вскрытие личинок для записей из клеток Rohon-Beard
Примечание: В 7 личинках DPF, мышцы окружающих спинной спинной мозга должны быть удалены. Последующие шаги 3.1.1 на 3.1.15 (с личинкой заменяющей эмбриона) перед обработкой ферментом.- Чтобы удалить мышцу, инкубировать личинку с 0,05% коллагеназы в течение 1 мин.
- Удалить коллагеназы путем промывки подготовки ~ 5 раз с раствором Рингера. Следуйте с ~ 5 полосканий внеклеточного раствора, чтобы полностью удалить коллагеназы.
- Провести остаток рассечения после монтажа записи камеры на сцене микроскопа буровой установки записи. Приложить боросиликатную толстостенное патч микропипетки (фигура 2В, нижний) к держателю электрода и сломать кончик микропипетки, осторожно щетки на дносиликоновая камера.
- Используйте немного сломанные микропипетки дразнить мышцы прочь и подвергать спинной спинной мозг. Для того, чтобы удалить мышечные волокна из препарата, применяет всасывание через трубку, присоединенную к выходному отверстию держателя электрода. Использование микроманипулятора для перемещения микропипетки по длине мышечного волокна при применении всасывания.
Примечание: Цель состоит в том, чтобы сначала использовать микропипетки механически ослабить мышцы, а затем отсасывает и удалить отдельные мышечные волокна. Иногда, во время удаления мышцы, то микропипетка забивается всасываемой тканью.- Для того, чтобы прочистить микропипетки, кисть микропипетки против нижней части камеры, слегка нарушая наконечник, при продувании воздуха через трубку, чтобы изгнать содержимое.
Примечание: Если размер наконечника микропипетки становится чрезмерно большим, новый микропипетка может быть необходим. Размер наконечника микропипетки является более важным при удалении мышечных слоев клosest к мембранам, окружающих спинной мозг или мозговые оболочки (маленькие подсказки микропипетки позволяют более контролируемой работы).
- Для того, чтобы прочистить микропипетки, кисть микропипетки против нижней части камеры, слегка нарушая наконечник, при продувании воздуха через трубку, чтобы изгнать содержимое.
- Удалить мозговые оболочки , как описано в шагах 3.1.18-3.1.20 с использованием нового микропипетки (фигура 2В, нижний).
Рисунок 4: боковое рассечение данио спинного мозга. Монтаж данио эмбрионов в боковой ориентации облегчает доступ к мотонейронам. Удаление мышц и рассечения мозговых оболочек подвергать моторные нейроны проводят под прямым микроскопом , адаптированный с объективом 40X погружения в воде (рисунок 2). (A) двигательный нейрон клеточные тела расположены вентрально и латерально в спинном мозге. Эмбрионы прикреплены к камере так, чтобы их спинная сторона обращена к держателю электрода.Обратите внимание , что шовный клей кажется белым , когда он затвердевает (звездочки). После того, как задний мозг перережет (а), кожа разрежутся поверхностно несколько раз на участке (б) хвостовой к заднему мозгу с помощью стеклянной микропипетки. Дополнительные поверхностные порезы (с), перпендикулярными к первому набору (б), образуют вкладку кожи , которая может захватить пинцет для удаления кожи. (BG) Пустой стакан микропипетка, тянется к короткому, коническому наконечнику (рис 2B, нижний), прикреплен к держателю электрода. Микропипетка маневрирует с помощью микроманипулятора для последующего тонкого рассечения и удаления мышечной ткани. (В) Кончик стекла микропипетки сначала слегка сломаны, осторожно щеткой против нижней части камеры, создавая зубчатый конец и больший диаметр наконечника. Микропипетка перемещается вдоль длины мышечных волокон во время всасывания применяется. Мышечные волокна удаляют один слойв то время, чтобы предотвратить разрушение основных мозговых оболочек. У эмбрионов, наиболее спинные слои мышц удаляются во-первых, поскольку они имеют тенденцию быть тоньше. Кожа не удаляется из более каудальных hemisegments (стрелка). (С) Спинной половиной мышцы в одном hemisegment было удалена (стрелка). (D) Черные линия разграничить hemisegment лишенного мышечных волокон, с интактными мозговыми оболочками , покрывающих спинной мозг (звездочка). (ЕЕ») с помощью микропипетки, давление прикладывает к мозговым оболочкам в положении , слегка спинной к мотонейронам somata. Быстрые, короткие, боковые движения микропипетки приводят к прокалывания мозговых оболочек. (FF») микропипетки продвигают вентрально, к вентральной части hemisegment, и подняли , чтобы отделить от мозговых оболочек нервной ткани. (GG») мозговые оболочки перережут путем перемещения микропипетки ростральна по длинеhemisegment. Нейроны немедленно выйти из обнаженного спинного мозга и теперь доступны для патч - электродов (стрелка). Масштабные полоски = 500 мкм в (А); Масштабные полоски = 100 мкм в BG (показано на панели В).
- Вскрытие эмбрионов для двигательных нейронов и интернейронов записей
- Поместите эмбрион в рассечение камере, содержащей раствор Рингера и иммобилизации эмбриона с Tricaine, как на этапе 3.1.1.
- Установить эмбрион в боковом направлении, с его спинной стороне, обращенной в сторону камеры, которая является оптимальной для пользователя (как правило, зависит от хиральности). Последующие шаги 3.1.2-3.1.17 и гарантировать , что эмбрион остается плоским против силикона (фиг 4A и 4A»).
- Используйте боросиликатную толстостенную микропипетку с наконечником , что было нарушено до ~ 25 мкм , чтобы очистить и вакуумные мышцы прочь и подвергать мозговые оболочки, как описаны в шагах 3.2.4-3.2.4.1 (рисунок 4B - <сильный> 4D).
- После того, как мышечные слои удаляются из hemisegment (ов) , представляющие интерес (рис 4D), замените стекло микропипетки на новый , который имеет интактный наконечник (фигура 2В, нижняя). Прокол мозговых оболочек в положении, которое является спинным к целевым нейронам. Использование микроманипулятора, нажмите микропипетки вниз на мозговые оболочки , а затем переместить его в сторону , чтобы быстро рвать и пересекают мозговые оболочки (рис 4E и 4E»).
- После разрыва мозговых оболочек, вперед и поднять микропипетки поднять мозговые оболочки от спинного мозга (рис 4F и 4F»). Перемещение микропипетки рострально разорвать мембрану вдоль длины hemisegment (рис 4G и 4G»).
Примечание: Для записи из клеток Rohon-Beard и первичных двигательных нейронов, рассечение ограничивается очисткой мозговых оболочек от immediatе целевая область. В противоположность этому, для записей из интернейронов и вторичных двигательных нейронов, необходимо удалить нейроны в спинном мозге, которые препятствуют доступ к ячейке, представляющей интерес. В последнем случае, в связи с широким разрушением спинного мозга схемы, исследования ограничиваются анализом собственных электрических свойств мембран.
4. Электрофизиологические записи из нейронов спинного мозга
- Для записей из клеток Rohon-Beard и моторных нейронов, использовать боросиликатного толстостенных стеклянных капилляров потянулись к сопротивлению ~ 3 МОм при заполнении пипетки раствором (фигура 2В, нижняя).
- Применение положительного давления пути дуть мягко через трубку, прикрепленную к держателю электрода перед погружением микропипетки в ванне.
Примечание: Положительное давление предотвращает мусор от засорения наконечника микропипетки и поддерживаются поворот трехходового крана в выключенном рosition. После того, как вблизи мишени нейрона, положительное давление приведет к отличительным вдавливания клеточной мембраны, полезный показатель того, что микропипетка является достаточно близко, чтобы инициировать образование уплотнения. - Освободить положительное давление, повернув кран клапан в открытом положении, при применении дополнительного света всасывания через мундштук.
- После формирования Г-уплотнение между клеточной мембраной и наконечником микропипетки, применяют короткие импульсы всасывания к разрыву мембраны и достичь конфигурации целой клетки.
- После установления стабильной конфигурации целой клетки, с входным сопротивлением 500 МОм и сопротивления доступа 10 МОм, получить записи в любом вольт-или ток-зажим режиме.
- Применение положительного давления пути дуть мягко через трубку, прикрепленную к держателю электрода перед погружением микропипетки в ванне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно записаны с Rohon-Beard нейронов в 17 HPF эмбрионов через 7 денье личинок (рис 5А и 5В). Когда клетки Rohon-Beard были записаны, препарат был установлен спинной стороной вверх. Такое крепление обеспечивает возможность однозначной идентификации клеток Rohon-Beard, основанные на их поверхностных дорсальных позициях и больших размерах сомы. Идентификация дополнительно подтверждаются стереотипным гиперполяризованным покой мембранного потенциалом этих нейронов (рис 5, вставка таблица) 6, 54. Кроме того, в качестве первичных сенсорных нейронов, Rohon-Beard нейроны не имеют вход синаптической. Таким образом, при отсутствии электрического раздражения, никаких изменений мембранного потенциала не должно происходить во время записи в режиме текущего зажима (рис 5B»). Так как начальные записи из клеток Rohon-Beard в данио были выполнены <SUP класс = "Xref"> 6, различные трансгенные линии (например, Tg (islet2b: GFP), Тд (СПП: GFP), и Tg (isletss: GFP)) были получены , которые экспрессируют флуоресцентные репортеров в этих нейронов, дальнейшее облегчение их идентификации 55, 56, 57.
Фигура 5: цельноклеточный ток и напряжение зажим запись из Rohon-Beard нейронов в 1 и 2 дении эмбрионов и 7 дением личинок. (А) Напряжение-зажим запись внешнего и внутренние тока были получены из Rohon-Beard нейронов в 1- (тонкой черной линии), 2- (толстая черная линия), и 7-дение (серая линия) эмбрионы / личинка. Держит потенциал был -80 мВ и тока вызывали на деполяризующий шаг до +20 мВ. (B) потенциалы одиночного действия выявляются путем кратковременного (1 мс) токаинъекции (~ 0,35 нА) к Rohon-Beard нейронов 1- (тонкой черной линией), 2- (толстая черная линия), а также 7-денье (серая линия) эмбрионов / личинки. (В») При отсутствии электрического раздражения, никаких изменений мембранного потенциала, таких как спонтанные постсинаптических деполяризации, не встречаются в Rohon-Beard нейронах. Таблица вставки приведены значения покоя мембранных потенциалов, записанные с Rohon-Beard нейронов 1- (п = 21) и 2- (п = 9) дением эмбрионов и 7- (п = 7) дением личинок. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Трансгенные линии, которые позволяют однозначную идентификацию других спинальных нейронов подтипов также доступны. Среди них mnx1 трансгенной линия Tg (mnx1: GFP) выражает зеленый флуоресцентного белка (GFP) в подмножестве спинальных двигательных нейронов вскоре после их спецификации (~ 14-16 HPF) <SUP класс = "Xref"> 58, 59. Из - за стереотипное расположение первичных двигательных нейронов в пределах каждого hemisegment (фиг.6А), вместе с выражением GFP в mnx1 трансгенного, можно идентифицировать различные первичные подтипы двигательных нейронов (рис 6В и 6С). В том числе флуоресцентного красителя в записи электрод раствора позволяет для визуализации аксонов траекторий, обеспечивая дополнительное подтверждение идентичности двигательных нейронов, так как некоторые интернейронов также выражают GFP в Тде (mnx1: GFP) линии. В качестве альтернативы, другой трансгенной линии , что позволяет идентифицировать двигательных нейронов является линия ET2 60.
Фигура 6: напряжение цельноклеточного и ток-зажим запись из моторных нейронов 1 DPF данио EmbryОперационные системы. (A) мультфильм изображает специфические морфологические особенности первичных двигательных нейронов подтипов , присутствующих в данио спинного мозга. Первичные моторные нейроны идентифицируют по положению их сомов в пределах сегмента (то есть, ростральный [ROP], медиальный [MIP] или хвостовой [РПЖ]) 45. Кроме того, каждый подтип расширяет аксон к периферии с помощью отдельного пути. Совместное использование Тда (mnx1: GFP) линия и краситель маркировки раскрывает стереотипные аксоны оправки и идентичность двигательных нейронов подтипа во время записи. Используя методы, представленные здесь, можно последовательно запись из трех различных первичных двигательных нейронов подтипов в пределах одной и то же hemisegment. (B) запись напряжения-зажим показаны , что были получены из ROP, MIP, и колпачка, все в одном hemisegment. Шаг напряжения до +20 мВ был использован, чтобы вызвать токи от удерживающего потенциала -80 мВ. (С) В течение текущего зажима гecordings от ROP, MIP, и колпачком, короткие (1 мс, ~ 0,4 нА) текущие инъекции были применены, чтобы вызвать потенциал действия. Мембранный потенциал был проведен в ~ -65 мВ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Принципиальное различие между первичными и вторичными двигательными нейронами является большей somata из ранее рожденных нейронов. Тем не менее, вторичные двигательные нейроны подтипы не идентифицируемые по размеру сомы или позиции. Для записей от конкретных вторичных двигательных нейронов, две трансгенных линии, Тд (gata2: GFP) и Tg (islet1: GFP), были использованы для идентификации вторичных двигательных нейронов с вентрально и дорсально выступающими аксонами, соответственно 55, 61. Тем не менее, третий вторичный двигательный нейрон подтип присутствует в данио спинного мозга, с ОВБнс , что проект сверху и снизу 62. Соответственно, краситель может быть использован для заполнения вторичных двигательных нейронов во время записи , чтобы идентифицировать подтипы на основе морфологии (рис 7А) 8, 9. Часто, во время напряжения-зажима (рис 7В, звездочка) или ток зажимных записей (фиг.7Са и 7C», наконечники стрел) из вторичных двигательных нейронов, спонтанные или синаптические события записываются.
Фигура 7: напряжение цельноклеточного и ток-зажим запись из вторичных двигательных нейронов 2 DPF эмбрионов. (А) В Тд (gata2: GFP) линии, два различных вторичных двигательных нейронов подтипов выразить GFP 62. В левой hemisegment, вентральной вторичный двигательный нейрон(Звездочка и стрелка указывает сома и аксон, соответственно). В соседнем hemisegment, справа (хвостовых), есть вентральной / спинные вторичного двигательный нейрон (звездочка указывает сома, стрелки указывают на два аксонов, одну выступающую вентрально [нижняя стрелка] и другой дорсально [верхняя стрелка]). Эти нейроны были помечены красным флуоресцентным красителем во время записи. Для того, чтобы определить, брюшной / спинные нейроны вторичных моторные, крайне важно, чтобы гарантировать, что рассечение не удаляет мышцы в соседнем хвостовом hemisegment, таким образом, повреждение или удаление спинного аксона. После записи нейрон сома остается прикрепленными к микропипетки , как он отстранился от подготовки (правые верхние звездочек). При использовании красителей для заполнения нейронов во время записи, краситель часто протекает в то время как электрод находится в ванне, в результате чего красного флуоресцентного фона виден в спинном мозге и хордах (нижней звездочке в ростральном [слева] hemisegment < / EM>). (B) запись напряжения-зажим были получены из вентральных и вентрально / спинных вторичных двигательных нейронов. шаги напряжения (-30, -10, +10, +30, +50, +70, +90, +110 мВ и) вызывали наружу и внутрь токов. Незакрепленные потенциалы действия / депол ризация могут присутствовать в записях (звездочки). (С) Во время текущих зажимных записи из вторичных двигательных нейронов, краткий (1 мс) текущих инъекций увеличения амплитуды были применено к нейронам , чтобы вызвать потенциал действия (звездочки). (С») Примерами одиночных потенциалов действия сработавших во вторичных двигательных нейронах с помощью текущих инъекций ~ 0,4-Na показаны. На этом этапе, спонтанные потенциалы действия также наблюдаются (С и С», стрелка). (D) Продолжительные (100 мс) текущие инъекции (~ 0,35 нА) вызывают повторяющиеся обжиг потенциалов действия. Мембранный потенциал был проведен в ~ -65 мВ.нагрузка / 55507 / 55507fig7large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, позволяют электрической и морфологической характеристике сенсорных и моторных нейронов эмбрионов данио после минимального рассечения спинного мозга. Нейроны оставались здоровыми в течение не менее 1 ч, срок наложенного на этих записях. Нейроны были записаны с использованием стандартной конфигурации целой клетки, а также из дра пятен; последний способ сводит к минимуму проблемы пространственно-зажима , который может предотвратить детальное изучение биофизического ионных токов 9.
Важная задачей является достижение твердого прикрепления зародыша или личинок в камеру, чтобы удалить кожу и выполнить ограниченное рассечение, необходимое для обеспечения доступа к нейронам интереса. Препарат также должен быть надежно закреплен в камере для записи методов патч-зажим целых клеток. Метод, который отвечает на этот вызов посредством использования ветеринара шовного клея для прикрепления эмбриона или личинкикамера рассечение / запись описана здесь, подход , который был использован для рассечения других модельных организмов (например, дрозофилы) 63. Из нашего опыта обучения других, мы находим, что наиболее важный шаг в освоении является контролируемой и точной доставкой небольших количеств клея. Здесь клей дозирующее устройство, которое позволяет пользователю применять отрицательное и положительное давление, чтобы загрузить клей в или изгнать его из кончика микропипетки обсуждается. Используя шовный клей, эмбрионы и личинки могут быть прочно прикреплены к камере и ориентированы либо спинной стороной вверх или в боковом направлении. Таким образом, различные варианты доступа для различных нейронов доступны. Кроме того, слой силиконового эластомера на дне камеры может быть даже тоньше, чем 1 мм, указанной здесь, обеспечивая потенциальные оптические преимущества. Другой метод, более обычно используется для крепления подготовки к регистрирующей камере, включает в себя использование тонких вольфрамовых штифтов 1 <SUP>, 2, 3, 4, 5. Несмотря на то, что методы отличаются, оба позволяют электрофизиологическое доступ к данио нейронов спинного мозга, предоставляя исследователям вариантов, которые могут быть выбраны исходя из целей и задач эксперимента.
Данио препарат , описанный здесь , позволяет электрической и морфологического исследования нейронов спинного мозга в месте во время их ранних стадиях дифференцировки. При записи с нейронов спинного мозга с помощью этих методов, мы получили понимание клеточных эффектов нескольких мутаций, даже до идентификации поврежденного гена 6, 64, 65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH (F32 NS059120 к RLM и R01NS25217 и P30NS048154 к ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
- Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
- Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
- Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
- Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
- Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
- Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
- Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
- Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
- Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
- Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
- Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
- McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
- McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
- Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
- Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
- Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
- Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
- Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
- Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
- Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
- Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
- Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
- Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
- Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
- Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
- Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
- Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
- Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
- Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
- Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
- McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
- Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).
