Summary
Dette manuskript beskriver metoder til elektrofysiologiske optagelser fra spinal neuroner i zebrafisk embryoner og larver. Præparatet fastholder neuroner in situ og ofte indebærer minimal dissektion. Disse fremgangsmåder tillader den elektrofysiologiske undersøgelse af en række spinale neuroner, fra den oprindelige erhvervelse elektrisk ophidselse gennem de tidlige larvestadier.
Abstract
Zebrafisk, først introduceret som en udviklingsmæssig model, har vundet popularitet i mange andre områder. Den lette opdræt stort antal hurtigt udvikle organismer, kombineret med den embryonale optisk klarhed, tjente som indledende overbevisende attributter i denne model. I løbet af de seneste to årtier har succesen af denne model blevet yderligere fremdrives ved sin modtagelighed for store mutagenese skærme og ved den lethed transgenese. På det seneste har gen-redigering tilgange udvidet magt modellen.
For neurologiske undersøgelser, zebrafisk embryo og larve som model til hvilken flere metoder kan anvendes. Her vil vi fokusere på metoder, der tillader undersøgelse af en væsentlig egenskab af neuroner, elektrisk ophidselse. Vores forberedelse til elektrofysiologisk undersøgelse af zebrafisk spinale neuroner involverer anvendelsen af dyrlæge sutur lim for at fastgøre præparatet til et registreringskammer. Alternative metoder til registreringfra zebrafisk embryoner og larver involverer fastgørelsen af præparatet til kammeret ved hjælp af en fin wolfram ben 1, 2, 3, 4, 5. En wolfram stift er oftest anvendes til at montere præparat i en lateral orientering, selv om det har været anvendt til at montere larver dorsale opad 4. Suturen limen er blevet anvendt til at montere embryoner og larver i begge orienteringer. Ved hjælp af lim, kan en minimal dissektion udføres, giver adgang til spinale neuroner uden anvendelse af en enzymatisk behandling, hvorved der undgås skade medføre. Men for larver, er det nødvendigt at anvende en kort enzymbehandlingen til fjernelse af muskel væv, der omgiver rygmarven. De her beskrevne metoder er blevet anvendt til at undersøge de iboende elektriske egenskaber af motoriske neuroner, interneuroner og sensoriske neuroner i flere developmental stages 6, 7, 8, 9.
Introduction
George Streisinger banebrydende anvendelse af Danio rerio, almindeligvis kendt som zebrafisk, som modelsystem til genetisk analyse af hvirveldyr udvikling 10. Modellen giver flere fordele, herunder: (1) relativt simple og billige husdyrhold; (2) ekstern befrugtning, der giver nem adgang til embryoner fra de tidligste udviklingsstadier; og (3) en transparent embryo, hvilket tillader direkte og gentagne observationer af celler, væv og organer som de dannes.
I løbet af de følgende årtier, flere fremskridt yderligere øget magt zebrafisk model. Især forward genetiske skærme og hel-genom sekventering af indsatsen spillet en nøglerolle i identifikationen af mutationer og gener er kritiske for mange udviklingsmæssige processer 11, 12, 13, 14,"> 15, 16. Gateway kloningsmetoder har tilladt rutinemæssig anvendelse af transgene nærmer 17, 18. Nylige fremskridt i genom redigering, eksemplificeret ved transkriptionsaktivator-lignende (Talens) og grupperet regelmæssigt spatierede korte palindrome repeats (CRISPR) -Cas9 nukleaser, muliggøre målrettet indførelse af mutationer, samt knock-out og knock-in nærmer 19, 20, 21, 22. kombinerede, disse metoder gør zebrafisk en kraftfuld model til undersøgelse af de genetiske mekanismer bag specifikke adfærd og flere humane sygdomme 23, 24, 25, 26, 27.
Dette arbejde fokuserer på at udviklemental regulering og den rolle, elektriske aktivitet i neuronal udvikling. Fokus er på rygmarven, som den zebrafisk model giver flere fordele. Det første er det relativt let at få adgang til zebrafisk på embryonale og larvestadier; derfor kan man studere rygmarv funktion under udviklingsstadier, der har færre neuroner og enklere kredsløb 28, 29. Desuden zebrafisk rygmarv har et bredt sæt af neuroner, der ligner andre hvirveldyr, som demonstreret ved karakteristiske og karakteristiske mønstre af transskriptionsfaktorerne 30, 31, 32, 33, 34, 35.
De fleste undersøgelser i zebrafisk, der sigter mod at afdække de mekanismer, der ligger til grund for funktionen af rygmarv kredsløb, isærdem, der understøtter bevægelse, forståeligt nok fokuseret på larvestadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Men mange af de neuroner, der danner spinal lokomotiv net indlede deres differentiering på tidlige embryoniske stadier, -9-10 timer efter befrugtning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. I lyset af dette, at forstå, hvordan de morfologiske og elektriske egenskaber af spinale neuroner opstår og skift mellem de embryonale og larvestadier er vigtigt for en Overall forståelse af lokomotorisk kredsløb dannelse og funktion.
Dissektion fremgangsmåder beskrevet her tillader patch clamp optagelser fra spinale neuroner og er blevet anvendt med succes på fosterstadiet (~ 17-48 HPF) og larvestadier (~ 3-7 dage efter befrugtning [dpf]). Denne tilgang begrænser mængden af dissektion forpligtet til at give adgang til de neuroner af interesse. Protokollen afviger fra størstedelen af de andre publicerede metoder til optagelse fra zebrafisk spinale neuroner i at dyrlæge sutur lim anvendes, snarere end en fin wolfram stift, at fastgøre embryo eller larve til registreringskammeret. Tilgængeligheden af to forskellige fremgangsmåder (dvs. sutur lim versus wolfram pin) til montering af zebrafiskembryoer eller larver til elektrofysiologisk analyse giver forskere med alternative muligheder for at nå deres specifikke eksperimentelle mål.
Først, procedurer for adgang til og optagelse fra en pop ulering af primære sensoriske neuroner, Rohon-Beard celler, er beskrevet. Cellen organer disse neuroner ligger inden for dorsale rygmarven. Eksisterer Rohon-Beard celler i talrige arter af hvirveldyr, differentiere tidligt i udviklingen, og ligger til grund for den embryoniske anslagsfølsomt 6, 44, 47, 48.
For det andet, procedurer for adgang til og optagelse fra spinale motoriske neuroner er detaljeret. Zebrafisk spinale motorneuroner opstå under to bølger af neurogenese. De tidligere fødte primære motoriske neuroner opstår i slutningen af gastrulation (~ 9-16 HPF), med kun 3-4 primær motorneuroner stede pr hemisegment 45, 46, 49. I modsætning hertil senere fødte population af sekundære motoriske neuroner er mere talrige og opstår under en længere periode, der starter ved ~ 14 HPFef "> 45, 50. Sekundær motorneuroner genese i midten af centrallinjesegmenter er hovedsagelig afsluttet ved 51 HPF 50. Sekundære motorneuroner anses for at være modstykket motoriske neuroner i amniotes 46. Interessant supraspinale neuroner via dopamin, regulere bevægelse i larve og sekundære motorneuroner genese i embryoet og unge larve 50, 51. primære og sekundære motoriske neuroner hver omfatte adskillige forskellige undertyper. hver primær motor neuron undertype projekter en perifer axon der innerverer en karakteristisk muskel gruppe, hvilket resulterer i en stereotyp, identificere axonal bane. Generelt sekundære motorneuroner følger de axonale pathways tidligere fastsatte af primære motoriske neuroner. således med hensyn til axonale baner, primære og sekundære motorneuroner er ens, med den undtagelse, at axonal tykkelse og somato størrelse enre større for primære motorneuroner 45.
For det tredje er metoder til optagelse fra et par typer af interneuroner diskuteret. Men i disse tilfælde er en begrænset mængde af fjernelse af andre rygmarv celler kræves, og dermed rygmarven er mindre intakt end for optagelser fra Rohon-Beard celler eller motorneuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz Medical Campus).
1. zebrafisk Husbandry
- Hæve og opretholde voksen zebrafisk (Danio rerio) ved 28,5 ° C på et 10 timer mørk / 14 timers lys cyklus og med passende vandbehandling og udveksling 52.
- Hæv zebrafisk embryoner / larver ved 28,5 ° C i embryo medium, indtil de når den ønskede fase (fx 2 dpf).
2. Fremstilling af Dissection Materialer
- Lim dispenser til zebrafisk dissektion
BEMÆRK: Denne protokol involverer anvendelsen af dyrlæge sutur lim til at fastgøre præparatet til registreringskammeret. Vellykket anvendelse af suturen lim kræver anvendelse af små mængder af lim på en kontrolleret måde. Limen begynder at hærde, så snart denmøder et vandigt miljø. Derfor trækker limen i en mikropipette og levere små mængder ved hjælp af en hjemmelavet "lim dispenser", der gør det muligt at anvende negativ eller positivt tryk gennem munden. Den centrale del af den lim dispenser er et glas boring, et stykke, der er medtaget i emballagen indeholdende borsilicatmaterialerne tyndvægget glaskapillarer (figur 1A). Den ene ende, er boringen forbundet via et stykke fleksibel slange til et mundstykke, medens den anden ende holder glasmikropipette (figur 1).- Fjerne den sorte pære fra et glas boring og erstatte det med den hvide gummiadaptor fra anden glas boring (figur 1B og 1C).
BEMÆRK: Denne dobbelte-adapter-udjævnede glas boring muliggør tilslutning til en glasmikropipette den ene ende og ved den anden ende, til et stykke fleksibel slange via en lille, lige polypropylen fitting (figur 1B, indsat). <li> Skær et stykke fleksibel slange til en længde på ~ 38 cm. Vedhæfte mundstykket (fx en gul 200 pi mikropipettespids) til enden af den fleksible slange ikke er forbundet med glas boring.
BEMÆRK: stykke rør bør være lang nok til at tillade manipulation af glasmikropipette under et dissektionsmikroskop mens mikropipetten gul spids er i munden (figur 1D). - Fjerne den sorte pære fra et glas boring og erstatte det med den hvide gummiadaptor fra anden glas boring (figur 1B og 1C).
Figur 1: Lim dispenser. (AC) Et glas boring forbinder til fleksible slange i den ene ende og glasmikropipette ved den anden. Gummi adaptere tillade binding via en lille polypropylen fitting (B, indsat) til røret og i sidste ende til en glasmikropipette ved den anden ende. (D) Den endelige lim Dispenseren har et mundstykke (fx fremstillet af et plastic pipettespids) i den ene ende af røret og glasset boring med vedlagte mikropipette ved den anden (pilespids).
- Dissektion / optagelse kammer
BEMÆRK: dissektion kammer fungerer også som elektrofysiologi registreringskammeret. Kammeret er udformet på en glasplade ved anvendelse af forskårne stykker af hærdet siliconeelastomer (figur 2A).- Til fremstilling siliconeelastomeren, tilsæt basen og hærdningsmidlet til et konisk plastrør ved et 4: 1-forhold.
- Bland elastomer base og hærdningsmidlet grundigt og hæld blandingen i to 100 mm petriskåle. Hæld elastomeren til en tykkelse på <1 mm i en petriskål og ~ 2,5 mm i den anden.
- Tillad silikoneelastomeren at helbrede ved udsættelse for luft til ~ 4-5 dage. Hvis hærdede elastomer er nødvendig før, inkuberes det ved 60 ° C.
- Skære stykker af den hærdede siliconeelastomer til følgende størrelser:
- Fra ~ 1 mm-thick hærdede elastomer, skære en ~ 3,8 x 6,3 cm rektangel; dette stykke tjener som bunden af kammeret (figur 2A). Fra ~ 2,5 mm tykt hærdet silikone, skæres et rektangel ~ 3,8 x 6,3 cm. Fra sidstnævnte rektangel, skåret ud en intern rektangel ~ 2,5 x 5 cm; den resulterende ramme tjener som toppen af kammeret (figur 2A).
- At gøre dissektion / optagelse kammer, placere den tynde silikone rektangel direkte oven på et objektglas (5 x 7,6 cm) og sørge for at fjerne eventuelle luftbobler mellem silicone og glasset (figur 2A). Placer silikone rektangelrammeværktøjet, skåret fra den tykkere elastomer, oven på det tynde bundlag af silikone.
- Kontrollere, at silikone lag vedhæfte godt til hinanden, og at der ikke er nogen luftbobler mellem de to lag (Figur 2A).
- Efter brug demontere kammeret ved at fjerne den tykke rektangel silikone ramme fra bunden silikone layis, som er fastgjort til objektglasset. Skyl silikone overflader med ddH2O før anvendelse og efter hver optagelse og tør med lav-lint klude.
- Opbevar kammeret tørre for at undgå svampevækst mellem de to stykker af silicone.
BEMÆRK: Hvis der anvendes toksiner eller farmakologiske midler, der ikke skylles let fra silikone, dedikere specifikke kamre til disse formål.
Figur 2: Elektrofysiologi kammer og dissektion værktøjer. (A) Kammeret anvendes til dissektioner og elektrofysiologiske registreringer består af et objektglas, hvorpå der er anbragt to stykker af hærdet siliconeelastomer, i lag oven på hinanden for at tilvejebringe en ramme og en bund for en brønd. Størrelsen af brønden, ~ 2,5 x 5 cm, tillader anvendelse af små volumener (2-2,5 ml) af ekstracellulær optagelseløsning. Den nederste Silikonelaget muliggør sikker positionering af zebrafisk embryo hjælp vævsklæber, der ikke klæber til glas. (B) En glasmikropipette (øverst) anvendes til lim levering i dissektion. Den tyndvæggede glas trækkes at skabe en lang, tilspidset ende, der er senere skæres, hvilket skaber en spids med en diameter på ~ 75 um. Den tilspidsede glasmikropipette er fastgjort til den frie ende af limdoseringsapparat (figur 1D, pilespids) og front fyldt med lim ved anvendelse af sugning. Den anden mikropipette (nederst), trukket så for én anvendes til en patch-clamp-måling, anvendes til overskæring af baghjernen og til fjernelse hud. (C) Under en opretstående mikroskop, er en mikromanipulator anvendes til manøvrering af mikropipetten for de endelige dissektion trin. Et glas mikropipette, som i B, bund, er fastgjort til elektrodeholder (pil). Muskel fjernelse opnås ved enpplying sugning gennem slangen forbundet til luftudtaget (pilespids). Ved sin anden ende, slangen forbindelse til en stophane (sort pilespids), at på sin anden side (stjerne), har rørene forbundet til et mundstykke.
3. Dissektion af embryoer og larver for Patch-clamp Optagelser fra Spinal Neuroner
Figur 3: Dorsal dissektion af en zebrafisk rygmarv. (AA') Efter baghjerne overskæring (a) af en 2-dpf embryo, huden skåret på venstre og højre side af (b) embryo. Et andet snit, vinkelret på det første, udføres derefter (c). Dernæst huden løftes ved hjælp af en mikropipette, så pincet til at gribe og trække væk huden. (B) Fjernelse af huden udsætter den dorsale rygmarv. Rostralt til den sorte linje, skin er fjernet og overfladen af rygmarven (asterisk), indeholdt i meninges, er udsat for. Huden forbliver intakt kaudalt for sorte linje (pil). (CC') Spidsen af glasmikropipette presses på meninges og hurtige, lateral, korte bevægelser udføres for at gennembore meninges. (DD 'og EE') Når meninges gennembrydes (DD), mikropipetten er avanceret og (EE) bevæges rostralt at rive meninges i to segmenter. Somata af Rohon-Beard neuroner opstår typisk ved fjernelse af meninges (pil). (FG) I en 7-dpf larve, muskellag dække den dorsale aspekt af rygmarven, kan hindre adgang til Rohon-Beard neuroner. Efter fjernelse af huden, er larven behandlet med 0,05% collagenase. (F) En 5 minutters inkubation med 0,05% collagenase er for strenge, hvilket resultereri overdreven muskelskade, som det fremgår af flosset muskel (pil og indsat). (F') Overdreven collagenasebehandling kan også beskadige Rohon-Beard neuroner (pil), afsløret her ved deres ekspression af GFP i Tg (islet2b: gfp) linje. I Tg (islet2b: gfp) linje, dorsalrodganglieneuroner udtrykker også gfp (pilespids). En kortere 1 min inkubering med 0,05% collagenase tilstrækkeligt løsner musklen (G), mens bevare myotome morfologi (pil og indsat). (G') Pigment celler er til stede på toppen af den mest dorsale muskellag (pilespids). (H og I) I Tg (islet2b: gfp) linje, Rohon-Beard neuroner (pile) og dorsalrodsganglion (pilespids) fortsat at udtrykke GFP på 7 dpf. Dorsal visninger af Tg (islet2b: gfp) zebrafiskembryoer ved 2 dpf (H) end 7 dpf (I). I panel A Målestok = 500 um; BE (vist i panel B) Skala søjler = 80 um; F 'og G (vist i panel F) Skala søjler = 200 um; H og I (vist i panel H) Skala søjler = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Dissektion af embryoner til optagelser fra Rohon-Beard celler
- Placere et embryo i en dissektion kammer indeholdende -2-3 ml Ringers opløsning (figur 2A). Immobilisere embryo ved tilsætning ~ 100 pi 0,4% tricain opløsning til kammeret.
- Pull tyndvæggede glasmikropipetter på en mikropipette aftrækker anvendelse af en kasse filament for at opnå en lang, tynd spids, svarende til en injektion mikropipetten (figur 2B, top) 53.
- Fastgør mikropipette af trukket glas til glasset boring of limen dispenser. Under dissektionsmikroskop, for at bruge pincet bryde spidsen af glasmikropipette så spidsen er ~ 75 um (figur 2B, top).
BEMÆRK: Spidsen størrelse bør være stor nok til at tillade effektiv læsning af limen ind i spidsen ved anvendelse af negativt tryk (mund sugning) til front-fylde mikropipetten, men små nok til at tillade den præcise anvendelse af limen via overtryk . - Indlæse glasmikropipette med ~ 3-5 pi lim ved at påføre sugning gennem mundstykket. Bringe lim fyldt spidsen til dissektion kammeret.
BEMÆRK: Fyldning af mikropipette med lim kræver stærk sugning. Hvis mikropipetten fylder hurtigt med svag sugning, spidsen er for stor. - Placer embryo i registreringskammeret (figur 3A og 3A); til optagelser fra embryoner og unge larver (≤72 HPF), er der ingen grund til at fjerne muskelvæv.
- Tage medspidsen af lim-loaded mikropipette nær hovedet af embryoet / larve under opretholdelse svagt overtryk til mikropipetten via munden rør (for at forhindre indtrængen af vandig opløsning). Når spidsen er i nærheden af hovedet af embryonet, anvende tilstrækkeligt positivt tryk til at uddrive en lille dråbe lim på bunden af kammeret.
BEMÆRK: limen hærder gang i kontakt med den vandige opløsning, så det er vigtigt at anvende og vedligeholde mild positivt tryk, som det er placeret i dissektion opløsning. - Brug et dissekere pin værktøj til at flytte embryo / larve mod dråbe lim så hovedet kommer i kontakt med lim. Vend embryo dorsale side opad, og tryk på hovedet for at sikre god kontakt med lim.
- Som limen langsomt hærder, bruge dissekere pin til repositionere embryoet / larve så den ligger ventrale nedad, dorsal opad. Dyp dissekere pin værktøjet i dråbe lim og trække tråde af limen lidt og på tværs af hovedetaf embryonet for yderligere at sikre sin position.
BEMÆRK: tricaine fremskynder den hastighed, hvormed limen hærder. For at give mere tid til at arbejde med den lim, skal du bruge minimal mængde tricaine kræves for at immobilisere embryo / larve. Yderligere kan hærdningshastigheden variere med forskellige partier af lim. Når følgelig anvendelse af en ny batch af lim, konstatere sin hastighed på hærdning før det bruges dissektion. - Når hovedet er sikkert fastgjort til silikone og limen er størknet, ofre embryo / larve ved overskæring på baghjerne niveau med en anden glas mikropipette (figur 3A-a og 4A- a).
BEMÆRK: baghjerne transsektion er den metode, der bruges her til human dyr offer. Men afhængigt af de eksperimentelle mål (fx studiet af fiktive svømning), kan der være behov for en anden metode. - Før fastgørelse af halen til kammeret, fjerne huden fra stammen.
- Bruget frisk glas mikropipette (figur 2B, nederst) til overfladisk skære huden flere gange ved en position kaudalt for baghjernen (figur 3A-B og 4A- b). Gennembore huden overfladisk ved at bevæge pipetten vinkelret på Rostro-caudale akse på hver side af stammen for dorsalt monteret (figur 3A-B) prøver eller på den udsatte side af stammen til sideværts monterede prøver (Figur 4A- b).
- At skabe en hudlap for pincet til at fange, skrabe huden flere gange med mikropipetten på niveau med og vinkelret på den første snit i trin 3.1.10.1 (figur 3A-c og 4A- c).
- Ved hjælp af en pincet, efterhånden løfte huden klap og trække huden kaudalt.
BEMÆRK: Dette resulterer ofte i fjernelsen af helheden af huden fra stammen. Men det er sometimes nødvendige for at fjerne huden i flere sektioner ved at udføre gentog skrabning og trækning af huden. For nogle anvendelser kan delvis fjernelse af huden give tilstrækkelig adgang til de rygmarv segmenterne af interesse (figur 3B og 4B). - Levere en lille dråbe lim nær halen af embryo / larve. Bruge denne lim til at fastgøre halen til bunden af dissektion kammeret. Under dette trin som limen hærder, justere placeringen af stammen med dissekere pin redskab til at sikre, at stammen forbliver dorsalt orienteret og at det er solidt fastgjort til kammeret.
- Efter denne indledende dissektion, skylles præparatet grundigt med Ringers opløsning til fjernelse tricain og snavs. Få præparatet til at hvile i ~ 5 min.
- Udskift dissektion løsning med ekstracellulær optagelse løsning. Hvis det er nødvendigt, tilføjer en immobiliserende middel til fremstillingen (f.eks. Α-bungarotoxin [endelig koncentration af 1 uM]).
BEMÆRK: 1 uM α-bungarotoxin immobiliserer 1 til 2 dpf embryoner inden ~ 30 min. For ældre larver, kan være behov for en højere koncentration af α-bungarotoxin. a-bungarotoxin holdes i badopløsningen under optagelser, som typisk udføres inden for en periode på 1 time. Optagelse opløsninger, der indeholder divalente kationer, såsom kobolt, kræver ikke tilsætning af en immobiliserende middel. Til forsøg, der kræver forlængede optagelsestidspunkter (over 1 time), er præparatet perfunderet med badopløsning med en hastighed på 0,5-1 ml / minut. - Flyt dissektion kammer med den monterede embryo på scenen af en opretstående forbindelse mikroskop udstyret med en 40X vand immersionsobjektiv lange arbejdstid afstande.
BEMÆRK: Denne mikroskop er en del af riggen, hvor optagelserne vil blive udført. Riggen bør også være udstyret med et hovedtrin, en patch-clamp-forstærker, en mikromanipulator, og en dataindsamlings- / computersystem (figur 2C). - Montere en tom borsilicat tykvægget glas mikropipette på elektroden indehaveren af hovedtrin (figurerne 2B, bund og 2C, pil). Vedhæfte rør (indvendig diameter: 0,16 cm, udvendig diameter: 0,32 cm, og længden: ~ 90 cm) ved den ene ende til luftudtaget af elektrodeholderen (pilespids) og ved den anden ende til en trevejshane (figur 2C , sort pilespids).
- Placere et mundstykke i den ene ende af et andet stykke af røret (~ 60-70 cm i længden) og fastgør den til de tre-vejs stophane i den anden ende (figur 2C, sort asterisk).
BEMÆRK: Denne slange system giver mulighed for anvendelse af positive og negative tryk til indersiden af optagelsen pipetten under forseglingsdannelse.
- Placere et mundstykke i den ene ende af et andet stykke af røret (~ 60-70 cm i længden) og fastgør den til de tre-vejs stophane i den anden ende (figur 2C, sort asterisk).
- Bringe mikropipettespidsen til den mest dorsale del af rygmarven og forsigtigt gennembore meninges. Følg med hurtig, at korte, sidelæns bevægelser loosen meninges (figur 3C og 3C).
- Efter mikropipettespidsen har gennemkøres hjernehinderne, forhånd og hæve mikropipetten at trække meninges væk fra rygmarven (Figur 3D og 3D').
- Flytte mikropipetten rostralt, fremføring i løbet af 1 til 2 hemisegments at eksponere Rohon-Beard celler (figur 3E og 3E).
BEMÆRK: Skær den minimale mængde af meninges kræves kun at eksponere et par Rohon-Beard celler. Efter hver optagelse, er yderligere dissektion udføres for at afsløre flere Rohon-Beard celler. I begge embryoner og larver kan Rohon-Beard neuroner lejlighedsvis briste ved kontakt med patch mikropipette. Andre rygmarv neuroner ikke opfører sig på denne måde, hvilket tyder på, at dette kan afspejle unikke egenskaber af de Rohon-Beard celler, såsom deres mechanosensitivity. Til støtte for denne, flere opløsningssammensætninger (fx ioniske komponenterog osmolaritet) testet, og ingen har forhindret denne adfærd Rohon-Beard celler.
- Dissektion af larver til optagelser fra Rohon-Beard celler
BEMÆRK: I 7 dpf larver, skal muskel omkring dorsale rygmarv fjernes. Følg trin 3.1.1 til 3.1.15 (med en larve substitueret for et foster) før behandling med enzymet.- At fjerne musklen, inkuber larve med 0,05% collagenase i 1 min.
- Fjern kollagenase ved at skylle forberedelse ~ 5 gange med Ringers opløsning. Følg med ~ 5 skylninger af ekstracellulær løsning til helt at fjerne collagenase.
- Gennemføre den resterende del af dissektion efter montering registreringskammeret på scenen af mikroskopet af optagelsen riggen. Vedhæfte et borsilicat tykvægget patch mikropipette (figur 2B, nederst) til elektrodeholderen og bryde spidsen af mikropipette ved forsigtigt børste det mod bunden afsilicone kammer.
- Brug lidt brudt mikropipette at drille musklen væk og udsætte den dorsale rygmarven. At fjerne muskelfibre fra præparatet sugning gennem slangen er fastgjort til elektrodeholderen udløb. Brug mikromanipulator at flytte mikropipetten langs længden af en muskel fiber mens der suges.
BEMÆRK: Målet er først at bruge mikropipette til mekanisk løsne muskler og derefter at suge væk og fjern de enkelte muskelfibre. Lejlighedsvis, under fjernelsen af musklen, bliver mikropipetten tilstoppet med den suges væv.- At rense mikropipetten, børste mikropipetten mod bunden af kammeret, let at bryde spidsen, mens blæse luft gennem røret for at uddrive indholdet.
BEMÆRK: Hvis størrelsen af mikropipettespidsen bliver alt for stor, kan en ny mikropipette være nødvendig. Størrelsen af mikropipettespidsen er mere kritisk, når fjernelse muskellagene closest til membraner, der omgiver rygmarven eller meninges (små mikropipette tip tillader mere kontrolleret arbejde).
- At rense mikropipetten, børste mikropipetten mod bunden af kammeret, let at bryde spidsen, mens blæse luft gennem røret for at uddrive indholdet.
- Fjerne meninges som beskrevet i trin 3.1.18-3.1.20 anvendelse af en ny mikropipette (figur 2B, nederst).
Figur 4: Lateral dissektion af zebrafisk rygmarven. Montering zebrafiskembryoer i en lateral orientering letter adgangen til motoriske neuroner. Fjernelsen af musklen og dissektion af meninges at blotlægge de motoriske neuroner udføres under en opretstående mikroskop indrettet med en 40X vand immersionsobjektiv (se figur 2). (A) Motor neuron cellelegemer er placeret ventralt og sideværts inden rygmarven. Embryoer fastgjort til kammeret, således at deres dorsale sideflader elektrodeholderen.Bemærk, at sutur lim forekommer hvidt, når det hærder (asterisk). Når baghjernen gennemskæres (a), huden skæres overfladisk flere gange ved et sted (b) kaudalt for baghjernen anvendelse af en glasmikropipette. Yderligere overfladiske snit (c), vinkelret på det første sæt (b), danner en hud fane, pincet kan få fat i til fjernelse af huden. (BG) En tom glasmikropipette, trukket til en kort, konisk spids (figur 2B, nederst), er knyttet til indehaveren af elektroden. Mikropipetten manøvreres ved hjælp af mikromanipulator for den efterfølgende fine dissektion og fjernelse af muskelvæv. (B) Spidsen af Glasmikropipetten først brydes let ved forsigtigt børste det mod bunden af kammeret, hvilket skaber en takket ende og en større spids diameter. Mikropipetten bevæges langs længden af muskelfibrene mens sugning påføres. Muskelfibre fjernes et lagad gangen for at forhindre forstyrrelser af de underliggende meninges. I embryoner er de mest dorsale muskellag fjernes først, da disse har tendens til at være tyndere. Huden fjernes ikke fra flere kaudale hemisegments (pil). (C) Den dorsale halvdel af musklen i en hemisegment er blevet fjernet (pil). (D) Sorte linjer afgrænse en hemisegment blottet for muskelfibre, med intakte meninges dækker rygmarven (asterisk). (EE) Med en mikropipette påføres tryk til meninges ved en position lidt dorsal til motorneuroner somata. Hurtige, korte, laterale bevægelser af mikropipetten føre til piercing af meninges. (FF) Den mikropipetten fremføres ventralt, hen imod det ventrale aspekt af hemisegment, og løftes for at adskille meninges fra det neuronale væv. (GG') meninges er transected ved at bevæge mikropipetten rostralt langs længden afhemisegment. Neuroner straks komme ud af den eksponerede rygmarv og er nu tilgængelige for patch elektroder (pil). Skalapanelerne = 500 um i (A); Skalapanelerne = 100 um i BG (vist i panel B).
- Dissektion af embryoner til motorisk neuron og interneuron optagelser
- Placer embryo i en dissektion kammer indeholdende Ringers opløsning og immobilisere embryoet med tricain, som i trin 3.1.1.
- Montere embryonet sideværts, med dens dorsale side modstående side af kammeret, der er optimal for brugeren (afhænger typisk håndethed). Følg trin 3.1.2-3.1.17 og sikre, at fosteret forbliver fladt mod silicone (figur 4A og 4A).
- Brug et borsilicat tykvægget mikropipette med en spids, der er blevet brudt til ~ 25 um til skrabe og suge musklen væk og udsætte meninges, som beskrevet i trin 3.2.4-3.2.4.1 (figur 4B - <strong> 4D).
- Når muskellagene fjernes fra hemisegment (erne) af interesse (figur 4D), udskifte glasmikropipette med en ny en, der har en intakt spids (figur 2B, nederst). Punktere meninges ved en position, der er dorsalt til mål-neuroner. Brug af mikromanipulator, skubbe mikropipette ned på meninges og derefter flytte det hurtigt sidelæns for at rive og krydse meninges (figur 4E og 4E').
- Ved sprængning meninges, forhånd og hæve mikropipetten at løfte meninges væk fra rygmarven (Figur 4F og 4F). Flyt mikropipetten rostralt at rive membranen langs længden af hemisegment (figur 4G og 4G).
BEMÆRK: optagelser fra Rohon-Beard og primærbatterier motorneuroner, er dissektion begrænset til at meninges væk fra immediate målområdet. I modsætning hertil for optagelser fra interneuroner og sekundære motoriske neuroner, er det nødvendigt at fjerne neuroner i rygmarven, der hindrer adgang til cellen af interesse. I sidstnævnte tilfælde, på grund af den omfattende forstyrrelse af rygmarven kredsløb, udføres undersøgelser begrænset til analysen af iboende elektriske membranegenskaber.
4. elektrofysiologiske registreringer fra Spinal Neuroner
- For optagelser fra Rohon-Beard celler og motoriske neuroner, bruge borsilicat tykvæggede glaskapillarer trukket til en modstand på ~ 3 MQ når den fyldes med pipetten opløsning (figur 2B, nederst).
- Anvende positivt tryk ved at blæse forsigtigt gennem røret fastgjort til elektrodeholderen før nedsænkning mikropipetten i badet.
BEMÆRK: Den positive tryk forhindrer snavs i at tilstoppe mikropipettespidsen og opretholdes ved at dreje trevejs stophane til off position. En gang i nærheden målneuronen, vil det positive tryk resultere i en karakteristisk fordybning af cellemembranen, en nyttig indikator for, at mikropipetten er tæt nok til at initiere forseglingsdannelse. - Slip det positive tryk ved at dreje stophaneventilen til den åbne stilling, mens anvendelse yderligere lys sugning gennem mundstykket.
- Efter dannelsen af en GQ-forsegling mellem cellemembranen og mikropipettespidsen, anvende korte pulser af sugning for at sprænge membranen og opnå en helcellekonfigurationen.
- Efter etablering af en stabil helcellekonfigurationen, med en indgangsmodstand 500 MQ og en adgang modstand 10 MQ, opnå optagelser i enten spændings- eller strøm-clamp modus.
- Anvende positivt tryk ved at blæse forsigtigt gennem røret fastgjort til elektrodeholderen før nedsænkning mikropipetten i badet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har med succes optaget fra Rohon-Beard neuroner i 17 HPF embryoner gennem 7 dpf larver (figur 5A og 5B). Når blev registreret Rohon-Beard celler blev præparatet monteret dorsale opad. Sådan montering giver mulighed for utvetydig identifikation af Rohon-Beard celler baseret på deres overfladiske dorsale positioner og store soma størrelser. Identifikationen er yderligere bekræftet af den stereotype hyperpolariserede hvilemembranpotentiale af disse neuroner (figur 5, indsat tabel) 6, 54. Som primære sensoriske neuroner, Rohon-Beard neuroner mangler synaptisk input. Derfor, i mangel af elektrisk stimulering, bør ingen ændringer i membranpotentiale forekommer under optagelse i strøm-clamp modus (figur 5B). Da de oprindelige optagelser fra Rohon-Beard celler i zebrafisk blev udført <sup class = "xref"> 6, forskellige transgene linjer (fx Tg (islet2b: gfp), Tg (NGN: gfp), og Tg (isletss: gfp)) er blevet frembragt, som udtrykker fluorescerende reportere i disse neuroner, yderligere at lette deres identifikation 55, 56, 57.
Figur 5: Whole-cell spændings- og strøm-clamp optagelser fra Rohon-Beard neuroner i 1 og 2 dpf embryoner og 7 dpf larver. (A) Voltage-clamp optagelser af udadgående og indadgående strømme blev opnået fra Rohon-Beard neuroner i 1- (tynd sort linje), 2- (tyk sort linie) og 7-dpf (grå linie) embryoner / larver. Holdepotentialet var -80 mV og strømme fremkaldt ved en depolariserende trin til +20 mV. (B) Single aktionspotentialer fremkaldes ved kort (1 ms) strøminjektioner (~ 0,35 nA) til Rohon-Beard neuroner 1- (tynd sort linje), 2- (tyk sort linie) og 7-dpf (grå linie) embryoner / larver. (B') I mangel af elektrisk stimulering, ingen ændringer i membranpotentiale, såsom spontane postsynaptiske depolariseringer, forekommer i Rohon-Beard neuroner. Det indsatte tabel sammenfatter værdierne af hvilende membranpotentialer optaget fra Rohon-Beard neuroner af 1- (n = 21) og 2- (n = 9) dpf embryoner og 7- (n = 7) dpf larver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Transgene linier, der tillader utvetydig identifikation af andre spinal neuron undertyper er også tilgængelige. Blandt disse mnx1 transgene linje Tg (mnx1: gfp) udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) i en undergruppe af spinale motoriske neuroner kort efter deres specifikation (~ 14-16 HPF) <sup class = "xref"> 58, 59. På grund af den stereotype positionering af de primære motoriske neuroner inden for hver hemisegment (figur 6A), sammen med ekspressionen af GFP i den mnx1 transgene, er det muligt at identificere de forskellige primære motoriske neuron undertyper (figur 6B og 6C). Herunder et fluorescerende farvestof i registreringselektroden opløsning giver mulighed for visualisering af axonale baner, giver yderligere bekræftelse af motorisk neuron identitet, som nogle interneuroner også udtrykker GFP i Tg (mnx1: gfp) linje. Alternativt er en anden transgen linje, der muliggør identifikationen af motoriske neuroner er ET2 linie 60.
Figur 6: Whole-celle spænding og strøm-clamp optagelser fra motoriske neuroner i 1 dpf zebrafisk EmbryOS. (A) En tegneserie afbilder specifikke morfologiske træk ved de primære motor neuron undertyper stede i zebrafisk rygmarven. Primære motorneuroner identificeres ved positionen af deres soma inden for et segment (dvs. rostrale [rop], mediale [MIP], eller kaudalt [CaP]) 45. Desuden hver undertype udvider et axon til periferien via en særskilt bane. Den kombinerede anvendelse af Tg (mnx1: gfp) linie og farvestof mærkning afslører den stereotype axonal arbor og identiteten af motorneuroner undertype under en optagelse. Ved hjælp af de metoder, der præsenteres her, er det muligt at sekventielt rekord fra tre forskellige primære motor neuron undertyper inden for samme hemisegment. (B) Voltage-clamp optagelser vist, at blev opnået fra rop, MIP, og CaP, alle i samme hemisegment. En spænding trin til +20 mV blev anvendt til at fremkalde strømme fra et holdepotentiale på -80 mV. (C) I strøm-clamp recordings ROP, MIP, og CaP, korte (1 ms, ~ 0,4 nA) nuværende injektioner blev påført udløse et aktionspotentiale. Membranpotentialet blev holdt ved ~ -65 mV. Klik her for at se en større version af dette tal.
En principiel forskel mellem primære og sekundære motoriske neuroner er større somata af de tidligere-fødte neuroner. Imidlertid sekundære motor neuron undertyper ikke kan identificeres ved soma størrelse og position. For optagelser fra specifikke sekundære motoriske neuroner, to transgene linier, Tg (gata2: gfp) og Tg (islet1: gfp), er blevet anvendt til identifikation af sekundære motoriske neuroner med ventralt og dorsalt fremspringende axoner, henholdsvis 55, 61. Imidlertid en tredje sekundær motor neuron subtype er til stede i zebrafisk rygmarv, med axons dette projekt dorsalt og ventralt 62. Følgelig kan farvestof anvendes til at fylde sekundære motoriske neuroner under optagelser til at identificere undertyper på grundlag af morfologi (figur 7A) 8, 9. Ofte, under spænding-klemme (figur 7B, asterisker) eller strøm-clamp optagelser (figur 7C og 7C', pilehoveder) fra sekundære motoriske neuroner, registreres spontane eller synaptiske begivenheder.
Figur 7: Whole-celle spænding og strøm-clamp optagelser fra sekundære motoriske neuroner af 2 dpf embryoner. (A) I Tg (gata2: gfp) linje, to forskellige sekundære motoriske neuron undertyper udtrykke GFP 62. I venstre hemisegment, en ventral sekundær motor neuron(Stjerne og pil indikerer soma og Axon, henholdsvis). I den nærliggende hemisegment, til højre (caudale), der er en ventral / dorsal sekundær motor neuron (stjerne angiver soma; pilene angiver de to axoner, en fremspringende ventralt [nederste pil] og den anden dorsalt [top pil]). Disse neuroner blev mærket med et rødt fluorescerende farvestof under optagelserne. At identificere ventral / dorsale sekundære motoriske neuroner, er det afgørende at sikre, at dissektion ikke fjerner muskel i den tilstødende kaudale hemisegment, derved beskadige eller fjerne den dorsale axon. Efter optagelsen forbliver neuron soma fastgjort til mikropipetten, når den trækkes væk fra præparatet (højre øverste asterisk). Når der anvendes farvestoffer til at fylde neuroner under optagelser, farvestoffet ofte lækker mens elektroden er i badet, hvilket resulterer i et rødt fluorescerende baggrund synlig i rygmarven og notochord (nederste stjerne i rostralt [venstre] hemisegment < / Em>). (B) Voltage-clamp optagelser blev opnået fra ventrale og ventrale / dorsale sekundære motoriske neuroner. Spændingstrin (-30, -10, +10, +30, +50, +70, +90 og + 110 mV) fremkaldte udad og indadgående strømme. Unclamped aktionspotentialer / depolariseringer kan være til stede i optagelser (asterisker). (C) I strøm-clamp optagelser fra sekundære motoriske neuroner, korte (1 ms) aktuelle injektioner af stigende amplitude blev påført neuronerne at udløse et aktionspotentiale (stjerner). (C') Eksempler på enkelte aktionspotentialer udløst i sekundære motoriske neuroner ved ~ 0,4-nA aktuelle injektioner er vist. På dette stadium er spontane aktionspotentialer også observeret (C og C', pilespidser). (D) Langvarig (100 ms) løbende injektioner (~ 0,35 nA) udløse gentagne affyring af aktionspotentialer. Membranpotentialet blev holdt ved ~ -65 mV.belastning / 55.507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De her beskrevne metoder giver mulighed for elektrisk og morfologiske karakterisering af sensoriske og motoriske neuroner i zebrafisk embryoner efter minimal dissektion af rygmarven. Neuroner forblive sunde i mindst 1 time, den frist, der er pålagt disse optagelser. Neuroner er blevet optaget ved hjælp af standard helcellekonfigurationen, samt fra kerneholdige plastre; sidstnævnte metode minimerer rum-clamp problemer, der kan udelukke en detaljeret biofysisk undersøgelse af ionstrømme 9.
En vigtig udfordring er at opnå den faste binding af embryonet eller larve til kammeret for at fjerne huden og udføre begrænset dissektion kræves for at give adgang til neuronerne af interesse. Fremstillingen skal også fastgjort korrekt på registreringskammeret for hel-celle patch-clamp metoder. En fremgangsmåde, der opfylder denne udfordring via anvendelse af dyrlæge sutur lim til at fastgøre embryo eller larve tildissektionen / registreringskammeret beskrives her, en tilgang, der er blevet anvendt til dissektion af andre modelorganismer (fx Drosophila) 63. Fra vores erfaring uddannelse andre, finder vi, at det mest kritiske skridt at mestre er kontrolleret og præcis levering af små mængder af lim. Her, er en lim dispenser enhed, der tillader en bruger at anvende negative og positive tryk til at indlæse lim ind i eller at udstøde det fra spidsen af en mikropipette diskuteret. Anvendelse suturen lim, kan embryoner og larver være solidt fastgjort til kammeret og orienteret enten dorsale opad eller sideværts. På denne måde, forskellige adgangsmuligheder til en række forskellige neuroner er til rådighed. Desuden kan laget af siliconeelastomer på kammerbunden være endnu tyndere end 1 mm specificeret her, hvilket giver potentielle optiske fordele. En anden fremgangsmåde, mere almindeligt anvendt til at fastgøre præparatet til en optagelse kammer, involverer anvendelse af fine wolfram pins 1 <sup>, 2, 3, 4, 5. Mens at metoder er forskellige, både tillader elektrofysiologisk adgang til zebrafisk spinal neuroner, giver forskerne med muligheder, der kan vælges ud fra de mål og udfordringer i forsøget.
Zebrafisk fremstilling beskrevet her tillader elektrisk og morfologiske undersøgelse af spinale neuroner i situ under deres tidligste stadier af differentiering. Ved optagelse fra spinale neuroner ved hjælp af disse fremgangsmåder, har vi opnået indsigt i de cellulære virkninger af adskillige mutationer, selv før identifikationen af det læderede gen 6, 64, 65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (F32 NS059120 til RLM og R01NS25217 og P30NS048154 til ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
- Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
- Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
- Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
- Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
- Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
- Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
- Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
- Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
- Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
- Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
- Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
- McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
- McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
- Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
- Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
- Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
- Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
- Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
- Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
- Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
- Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
- Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
- Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
- Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
- Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
- Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
- Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
- Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
- Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
- Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
- McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
- Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).
