Summary
Detta manuskript beskriver metoder för elektrofysiologiska registreringar från spinala neuroner i zebrafisk embryon och larver. Beredningen håller nervceller in situ och ofta innebär minimal dissektion. Dessa metoder medger för den elektrofysiologiska studier av en mängd olika spinala neuroner, från den inledande elektriska retbarhet förvärv genom de tidiga larvstadier.
Abstract
Zebrafisk, först introducerades som en utvecklingsmodell, har vunnit popularitet på många andra områden. Lättheten att uppfödning stort antal snabbt växande organismer, i kombination med den embryonala optisk klarhet, tjänstgjorde som initiala tvingande attributen i denna modell. Under de senaste två decennierna har framgången för denna modell ytterligare drivs av dess mottaglighet för storskalig mutagenes skärmar och hur lätt genmodifiering. På senare tid har gen-redigering metoder förlängt kraften i modellen.
För nerv studier, zebrafisk embryot och larv tillhandahålla en modell, till vilken flera metoder kan tillämpas. Här fokuserar vi på metoder som gör det möjligt att studera en väsentlig egenskap av nervceller, elektrisk retbarhet. Vår förberedelse för elektro studier av zebrafisk spinal nervceller innebär användning av veterinär sutur lim för att fästa beredningen till en inspelning kammare. Alternativa metoder för inspelningfrån zebrafisk embryon och larver involverar fastsättning av preparatet till kammaren med hjälp av en fin volfram stift 1, 2, 3, 4, 5. En volframstift är oftast används för att montera beredningen i en lateral riktning, även om det har använts för att montera larver dorsal-sidan uppåt 4. Suturen lim har använts för att montera embryon och larver i båda riktningarna. Med hjälp av lim, kan en minimal dissektion utföras, som ger tillgång till spinala neuroner utan användning av en enzymatisk behandling, varigenom man undviker skador uppstår. Men för larver, är det nödvändigt att tillämpa en kort enzymbehandling för att ta bort muskelvävnaden som omger ryggmärgen. De metoder som beskrivs här har använts för att studera de inneboende elektriska egenskaperna hos motoriska neuroner, interneuronen och sensoriska neuroner vid flera developmental stegen 6, 7, 8, 9.
Introduction
George Streisinger börjat använda sig av Danio rerio, allmänt känd som zebrafisk, som ett modellsystem för den genetiska analysen av vertebrat utveckling 10. Modellen erbjuder flera fördelar inklusive: (1) relativt enkel och billig djurhållning; (2) yttre befruktning, vilket tillåter enkel tillgång till embryon från de tidigaste utvecklingsstadierna; och (3) ett transparent embryo, vilket medger direkt och upprepade observationer av celler, vävnader och organ när de bildas.
Under de följande decennierna, flera framsteg ökade ytterligare kraften i zebrafisk modell. I synnerhet, framåt genetiska skärmar och hel-genomsekvenseringsinsatser spelade nyckelroller vid identifiering av mutationer och gener som är kritiska för många utvecklingsprocesser 11, 12, 13, 14,"> 15, 16. Gateway kloningsmetoder har gjort att rutinmässig tillämpning av transgen närmar 17, 18. Senaste framstegen inom genomet redigering, exemplifieras av transkriptionsaktivator-liknande (Talens) och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (CRISPR) -Cas9 nukleaser, möjliggöra den målinriktade införandet av mutationer, samt knock-out och knock-in närmar 19, 20, 21, 22. Kombinerade, dessa metoder gör zebrafisk en kraftfull modell för studier av de genetiska mekanismer som ligger bakom specifika beteenden och flera humana sjukdomar 23, 24, 25, 26, 27.
Arbetet är inriktat på att utvecklamental reglering och rollen av elektrisk aktivitet i neuronal utveckling. Fokus ligger på ryggmärgen, som zebrafisk modellen ger flera fördelar. För det första är det relativt lätt att få tillgång till zebrafisk på embryonala och larvstadier; Därför kan man studera ryggmärgen funktion under utvecklingsstadier som har färre nervceller och enklare kretsar 28, 29. Dessutom har zebrafisk ryggmärgen en mångfaldig uppsättning av neuroner, liknande andra ryggradsdjur, såsom demonstreras genom karakteristiska och särskiljande mönster av transkriptionsfaktorer 30, 31, 32, 33, 34, 35.
Majoriteten av studier i zebrafisk som syftar till att avslöja de mekanismer som ligger bakom funktionen hos ryggmärgskretsar, särskiltsådana som stödjer förflyttning, är förståeligt fokuserade på larvstadier 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Dock många av de neuroner som bildar de spinal lokomotivnäten initiera deras differentiering vid tidiga embryonala stadier, ~ 9-10 timmar efter befruktning (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Mot bakgrund av detta, att förstå hur de morfologiska och elektriska egenskaperna hos ryggrads nervceller uppstår och förändringen mellan embryonala och larvstadier är viktigt för en Overall förståelse av lokomotorisk kretsbildning och funktion.
De dissektion metoder som beskrivs här tillåter patch clamp-registreringar från spinala neuroner och har tillämpats med framgång på embryonala stadier (~ 17-48 HPF) och larvstadier (~ 3-7 dagar efter befruktning [dpf]). Detta tillvägagångssätt begränsar mängden dissekering som krävs för att ge tillgång till nervceller av intresse. Protokollet skiljer sig från majoriteten av de andra publicerade metoder för inspelning från zebrafisk spinala neuroner i det veterinär sutur lim används, snarare än en fin volfram stift, för att fästa embryo eller larv till inspelningen kammaren. Tillgängligheten av två olika metoder (dvs sutur lim kontra volfram stift) sörjer för montering av de zebrafisk embryon eller larver för elektrofysiologisk analys forskare med alternativa möjligheter att uppnå sina specifika experimentella mål.
Först förfaranden för att få tillgång och inspelning från en pop ulation av primära sensoriska neuroner, Rohon-Beard-celler, beskrivs. Cell organ dessa nervceller ligger inom rygg ryggmärgen. Rohon-Beard celler finns i många ryggradsdjur, skiljer tidigt i utvecklingen, och bakom den embryonala anslagskänslighet 6, 44, 47, 48.
För det andra, förfaranden för att få tillgång och inspelning från spinal motoriska nervceller är detaljerade. Zebrafisk spinala motorneuroner uppstå under två vågor av neurogenes. De tidigare födda primära motoriska nervceller uppstår vid slutet av gastrulation (~ 9-16 HPF), med bara 3-4 primära motoriska nervceller närvarande per hemisegment 45, 46, 49. I motsats, är den senare födda befolkningen av sekundära motoriska nervceller talrikare och uppstår under en långvarig period, som börjar vid ~ 14 hpfef "> 45, 50. Sekundär motor neuron genesis i mitten av trunkavsnitt är oftast kompletteras med 51 HPF 50. Sekundära motomeuroner anses vara motsvarigheten av motomeuroner i amnioternas 46. Intressant supraspinala neuroner, via dopamin, reglera locomotion hos larven och sekundär motor neuron genes i embryot och unga larv 50, 51. primära och sekundära motoriska nervceller varje innefatta flera olika subtyper. varje primära motoriska neuron subtyp projekt en perifer axon som innerverar en karakteristisk muskelgrupp, vilket resulterar i en stereotyp, identifiera axonal bana. i allmänhet sekundära motoriska nervceller följer de axonala banorna tidigare fastställts av primära motoriska nervceller. Således, med avseende på axonal banor, primära och sekundära motoriska nervceller är likartade, med undantag av att axonal tjocklek och somata storlek enre större för primära motoriska neuroner 45.
För det tredje, är metoder för inspelning från ett fåtal typer av interneuronen diskuteras. Emellertid, i dessa fall, är en begränsad mängd av avlägsnandet av andra ryggmärgsceller krävs, och sålunda ryggmärgen är mindre intakt än för inspelningar från Rohon-Beard celler eller motoriska nervceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC, Office of Laboratory Animal Resources, University of Colorado Anschutz Medical Campus).
1. Zebrafish Husbandry
- Höja och upprätthålla vuxna zebrafisk (Danio rerio) vid 28,5 ° C på en 10 h mörker / 14 h ljuscykel och med lämplig vattenbehandling och utbyte 52.
- Höja zebrafisk embryon / larver vid 28,5 ° C i embryo medium tills de når det önskade stadiet (t.ex. 2 dpf).
2. Framställning av Dissection Material
- Lim dispenser för zebrafisk dissektion
OBS: Detta protokoll innebär användning av veterinär sutur lim för att fästa beredningen till inspelningen kammaren. Framgångsrik användning av suturen limmet kräver användning av små mängder av lim på ett kontrollerat sätt. Limmet börjar härda så snart detmöter en vattenhaltig miljö. Därför drar limmet i en mikropipett och leverera små mängder med hjälp av en hemmagjord "lim dispenser" som gör det möjligt att tillämpa negativt eller positivt tryck genom munnen. Den centrala delen av limmet dispensern är en glas borrning, en pjäs som är inkluderad i paketet innehållande de borsilikat tunnväggiga glaskapillärer (Figur 1A). På en ände är hålet anslutet via ett stycke av flexibel slang till ett munstycke, medan den andra änden håller glasmikropipett (Figur 1).- Ta bort den svarta glödlampan från ett glas borrning och ersätta den med den vita gummiadapter från en annan glas borrning (figur 1B och 1C).
OBS: Detta dubbel adapter-capped glas borrning möjliggör anslutning till en glas mikropipett på en ände och, vid den andra änden, till ett stycke av flexibel slang via en liten, rak polypropylen beslag (Figur 1B, inlägg). <li> Klipp en bit av flexibel slang till en längd av ~ 38 cm. Fästa munstycket (t.ex. en gul 200 | il mikropipett spets) till änden av den flexibla slangen inte ansluten till glas borrningen.
OBS! Bit slang bör vara tillräckligt lång för att manipulation av glaset mikropipett under ett dissekera omfattning medan mikropipett gula tips är i munnen (figur 1D). - Ta bort den svarta glödlampan från ett glas borrning och ersätta den med den vita gummiadapter från en annan glas borrning (figur 1B och 1C).
Figur 1: Lim dispenser. (AC) En glas borrning ansluter till flexibel slang vid en ände och glaset mikropipett vid den andra. Adaptrarna gummi tillåta fastsättning via en liten polypropen beslaget (B, inlägg) till slangen och, så småningom, till en glas mikropipett vid den andra änden. (D) Den slutliga limdispenser har ett munstycke (exempelvis tillverkad av en plastic pipettspets) vid en ände av slangen och glaset borrningen med den fästa mikropipett vid den andra (pilspets).
- Dissektion / inspelning kammaren
OBS: dissektion Kammaren fungerar också som elektrofysiologi inspelningen kammaren. Kammaren är bildad på en glasplatta med användning av förskurna bitar av härdad silikonelastomer (Figur 2A).- Att förbereda silikonelastomeren, tillsätta basen och härdaren till ett koniskt plaströr vid ett 4: 1-förhållande, respektive.
- Blanda elastomerbasen och härdaren noggrant och häll blandningen i två 100 mm Petri skålar. Pour elasten till en tjocklek av <1 mm i en petriskål och ~ 2,5 mm i den andra.
- Låt silikonelastomeren härda genom exponering för luft för ~ 4-5 dagar. Vid behov av härdad elastomer förr, inkubera den vid 60 ° C.
- Skära bitar av den härdade silikonelastomeren till följande storlekar:
- Från ~ 1 mmtjock härdad elastomer, skära ut en ~ 3,8 x 6,3 cm rektangel; detta stycke fungerar som bottnen av kammaren (Figur 2A). Från ~ 2,5 mm tjock härdad silikon, skär en rektangel ~ 3,8 x 6,3 cm. Från den senare rektangel, skär ut en intern rektangel ~ 2,5 x 5 cm; den resulterande ramen tjänar som den övre delen av kammaren (Figur 2A).
- Att göra dissektionen / inspelningskammare, placera det tunna silikon rektangeln direkt på toppen av en glasskiva (5 x 7,6 cm), och se till att avlägsna eventuella luftbubblor mellan silikonet och glaset (Figur 2A). Placera silikon rektangel ram, skuren från den tjockare elastomer, på toppen av det tunna bottenskiktet av silikon.
- Kontrollera att de silikonskikten fäster väl vid varandra, och att det inte finns några luftbubblor mellan de två skikten (Figur 2A).
- Efter användning, demontera kammaren genom att ta bort den tjocka rektangeln silikonramen från botten silikon layer som är fäst till objektglaset. Skölj silikonytorna med ddHaO 2 O före användning och efter varje inspelningssession och torka med låg-ludd våtservetter.
- Lagra kammaren torrt för att förhindra svamptillväxt mellan de två delarna av silikon.
OBS: Om toxiner eller farmakologiska medel som kanske inte skölj lätt från silikon används, ägna särskilda kammare för dessa ändamål.
Figur 2: Elektrofysiologi kammaren och dissektion verktyg. (A) Kammaren används för dissektioner och elektrofysiologiska registreringar består av en glasskiva, på vilken är placerade två bitar av härdad silikonelastomer, skiktades på toppen av varandra för att ge en ram och en botten för en brunn. Storleken av brunnen, ~ 2,5 x 5 cm, tillåter användning av små volymer (2-2,5 ml) av extracellulärt inspelninglösning. Bottensilikonskiktet medger säker positionering av zebrafisk embryo med användning av vävnadslim som inte vidhäftar till glas. (B) En glasmikropipett (överst) används för lim leverans under dissekering. Den tunnväggiga glas dras för att skapa en lång, avsmalnande ände som senare skärs, vilket skapar en spets med en diameter av ~ 75 | j, m. Den avsmalnande glasmikropipett är fäst vid den fria änden av limmet dispenser (Figur 1D, pilspets) och främre-fylld med lim genom tillämpning av sugning. Den andra mikropipett (botten), drog som för en som används för ett patch-clamp inspelning, används för transektion av hindbrain och för avlägsnande hud. (C) Enligt en upprätt mikroskop, är en mikromanipulator används för att manövrera mikropipett för de slutliga dissektion stegen. En glasmikropipett, som i B, botten, är fäst till elektrodhållaren (pil). Muskel avlägsnande uppnås genom enpplying sugning genom slangen som är ansluten till luftutloppet (pilspets). Vid sin andra ände, ansluter slangen till en avstängningskran (svart pil) som, på sin andra sida (asterisk), har slang fäst till ett munstycke.
3. Dissekering av embryon och larver för Patch-clamp inspelningar från Spinal Neuroner
Figur 3: Rygg dissektion av en zebrafisk ryggmärg. (AA') Efter hindbrain transektion (a) av en 2-dpf embryo, huden skärs på de vänstra och högra sidorna av embryot (b). Ett andra snitt, vinkelrätt mot den första, utförs sedan (c). Därefter huden lyfts med hjälp av en mikropipett, så pincett att greppa och dra bort huden. (B) Avlägsnande av huden exponerar den dorsala ryggmärgen. Rostralt till den svarta linjen, skidn har avlägsnats och ytan av ryggmärgen (asterisk), innesluten i hjärnhinnorna, exponeras. Huden förblir intakt kaudalt den svarta linjen (pil). (CC') Spetsen av glaset mikropipett pressas på hjärnhinnorna, och snabba, laterala, korta rörelser utförs för att genomborra hjärnhinnorna. (DD 'och EE') När hjärnhinnorna är genomborrade (DD '), är mikropipetten avancerade och (EE') flyttas rostrally att riva hjärnhinnorna i två segment. Somata av Rohon-Beard neuroner uppkommer typiskt vid avlägsnande av hjärnhinnorna (pil). (FG') I en 7-dpf larv, skikt av muskel täcka den dorsala aspekten av ryggmärgen, hinde tillgång till Rohon-Beard neuroner. Efter avlägsnandet av huden, larven behandlas med 0,05% kollagenas. (F) En 5 min inkubation med 0,05% kollagenas är alltför stränga, vilket resulterari överdriven muskelskada, vilket framgår av den fransade muskel (pil och infälld). (F') Överdriven kollagenas behandling kan också skada Rohon-Beard neuroner (pil), avslöjade här genom deras uttryck av GFP i Tg (islet2b: gfp) linje. I Tg (islet2b: gfp) linje, dorsala ganglieneuroner uttrycker också gfp (pilspets). En kortare 1 min inkubation med 0,05% kollagenas lossar tillräckligt muskeln (G) samtidigt bevara myotome morfologi (pil och infälld). (G') Pigmentceller är närvarande på toppen av den mest dorsala muskelskiktet (pilspets). (H och I) I Tg (islet2b: gfp) linje, Rohon-Beard neuroner (pilar) och den dorsala rotganglion (pilspets) fortsätter att uttrycka GFP vid 7 dpf. Dorsal vyer av Tg (islet2b: gfp) zebrafisk embryon vid 2 dpf (H) end 7 dpf (I). I fält A Skalstrecken = 500 pm; BE (visat i fält B) Skala barer = 80 um; F 'och G' (visas i fält F) Skala barer = 200 pm; H och I (visas i fält H) Skala barer = 100 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Dissektion av embryon för inspelningar från Rohon-Beard celler
- Placera ett embryo i en dissektion kammare innehållande ~ 2-3 ml av Ringers lösning (Figur 2A). Immobilisera embryot genom att tillsätta ~ 100 mikroliter av 0,4% tricaine lösning till kammaren.
- Pull tunnväggiga glasmikropipetter på en mikropipett avdragare med användning av en låda filament för att erhålla en lång, tunn spets, som liknar en injektions mikropipett (figur 2B, överst) 53.
- Fäst drog glas mikropipett till glashålet of limmet dispenser. Under dissektionsmikroskop, att använda pincett bryta spetsen av glasmikropipett så att spetsen är ~ 75 | j, m (Figur 2B, överst).
OBS: Spets storlek ska vara tillräckligt stort för att möjliggöra en effektiv laddning av lim i spetsen genom tillämpning av undertryck (mun sug) till front fylla mikropipett, men tillräckligt liten för att den exakta tillämpningen av limmet via övertryck . - Ladda glasmikropipett med ~ 3-5 mikroliter av lim genom att applicera sug genom munstycket. Bringa limmet fyllda spets till dissektion kammaren.
OBS: Fylla mikropipett med lim kräver ett starkt sug. Om mikropipett fylls snabbt med svag sug, är toppen för stor. - Placera embryot i inspelningen kammaren (Figur 3A och 3A'); för inspelningar från embryon och unga larver (≤72 HPF), finns det ingen anledning att ta bort muskelvävnad.
- Föraspetsen av limmet belastade mikropipett nära huvudet av embryot / larv under bibehållande svagt positivt tryck till mikropipetten via munnen röret (för att förhindra införsel av vattenlösning). När spetsen är nära huvudet av embryot, applicera tillräcklig positivt tryck för att driva ut en liten droppe lim på botten av kammaren.
OBS: Limmet härdar en gång i kontakt med vattenlösningen, så det är viktigt att tillämpa och underhålla mild övertryck som den placeras i dissekering lösningen. - Använd en dissekera stift verktyg för att flytta embryot / larven mot droppe lim så att huvudet kommer i kontakt med limmet. Orientera embryot ryggsidan uppåt och tryck på huvudet för att säkerställa god kontakt med limmet.
- Som limmet härdar långsamt, använd dissekerande stiftet att placera om embryot / larven så att den ligger ventrala sidan nedåt, dorsal-sidan upp. Doppa dissekera stift verktyget i droppe lim och dra trådar av limmet över och över huvudetav embryot för att ytterligare säkra sin position.
OBS: Tricaine påskyndar den takt med vilken limmet härdar. För att ge mer tid att arbeta med lim, använda minimalt med tricaine som krävs för att immobilisera embryot / larv. Dessutom kan härdningshastigheten variera med olika massor av lim. Således när man använder en ny sats av lim, fastställa dess hastighet av härdning innan den används för dissekering. - När huvudet är ordentligt ansluten till silikon och limmet har stelnat, offra embryot / larven genom transektion vid bakhjäman nivå med en annan glasmikropipett (Figur 3A- a och 4a- a).
OBS: bakhjäman transection är den metod som används här för human djuroffer. Dock beroende på de experimentella mål (t.ex. studier av fiktiv simning), en annan metod kan behövas. - Innan fästa svansen till kammaren, ta bort huden från stammen.
- Använda sig aven färsk glasmikropipett (figur 2B, botten) för att ytligt skära in i huden flera gånger vid en position kaudalt om hindbrain (Figur 3A- b och 4a- b). Pierce huden ytligt genom att flytta pipetten vinkelrät mot rostro-kaudala axel på vardera sidan av bålen för dorsalt monterad (Fig 3A- b) prov eller på den exponerade sidan av stammen för att i sidled monterade proven (figur 4a- b).
- För att skapa en flik av hud för pincett att greppa, skrapa huden flera gånger med mikropipett på nivån för och vinkelrätt mot det första skäret i steg 3.1.10.1 (figur 3A- c och 4a- c).
- Med hjälp av pincett, så småningom lyfta huden fliken och dra huden kaudalt.
OBS: Detta resulterar ofta i avlägsnande av hela huden från stammen. Det är dock sometimes som krävs för att ta bort huden i flera sektioner genom att utföra upprepade skrapning och dra av huden. För vissa tillämpningar, kan partiellt avlägsnande av huden medge tillräcklig tillgång till de ryggmärgs segment av intresse (figurerna 3B och 4B). - Leverera en liten droppe lim nära svansen av embryot / larv. Använd denna lim för att fästa svansen till botten av dissekering kammaren. Under detta steg, som limmet härdar, justera läget av stammen med dissekerande stiftverktyget för att säkerställa att stammen förblir dorsalt orienterad och att det är stadigt fäst till kammaren.
- Efter denna inledande dissektion, skölj preparatet mycket med Ringers lösning för att avlägsna tricaine och skräp. Låt förberedelse för att vila ~ 5 min.
- Byt ut dissektion lösning med extracellulära inspelning lösning. Om det behövs, lägger ett immobiliserande medel till beredningen (t ex., Α-bungarotoxin [slutlig concentration av 1 | iM]).
OBS: 1 pM α-bungarotoxin immobiliserar 1 till 2 dpf embryon inom ~ 30 min. För äldre larver, kan behövas en högre koncentration av α-bungarotoxin. a-bungarotoxin bibehålls i badlösningen under inspelningar, vilka typiskt utförs inom en period av 1 h. Inspelning lösningar som innehåller tvåvärda katjoner, såsom kobolt, inte kräver tillsats av ett immobiliseringsmedel. För experiment som kräver förlängda registreringsperioder (över 1 h), är beredningen perfunderades med badlösningen med en hastighet av 0,5-1 ml / min. - Flytta dissektion kammaren med den monterade embryot till det stadium av en upprätt sammansatt mikroskop utrustat med en 40X nedsänkning i vatten lång arbetsför avstånd mål.
OBS: Detta mikroskop är en del av riggen där inspelningar kommer att utföras. Riggen bör också vara utrustad med en huvudsteg, en patch-clamp-förstärkare, en mikromanipulator, och ett datainsamlings / datorsystem (Figur 2C). - Montera en tom borosilikat tjockväggiga glasmikropipett på elektrod innehavaren av huvudsteg (figurerna 2B, botten och 2C, pil). Bifoga slang (innerdiameter: 0,16 cm, ytterdiameter: 0,32 cm, och längd: ~ 90 cm) vid en ände till luftutloppet av elektrodhållaren (pilspets) och vid den andra änden till en trevägskran (figur 2C , svart pil).
- Placera ett munstycke vid en ände av en annan bit av slang (~ 60-70 cm i längd) och koppla den till trevägskran vid den andra änden (Figur 2C, svart asterisk).
OBS: Denna rörsystemet gör det möjligt att tillämpa positiva och negativa tryck på insidan av inspelningen pipetten under tätningsbildning.
- Placera ett munstycke vid en ände av en annan bit av slang (~ 60-70 cm i längd) och koppla den till trevägskran vid den andra änden (Figur 2C, svart asterisk).
- Ta mikropipett tips till den mest dorsala delen av ryggmärgen och försiktigt genomborra hjärnhinnorna. Följ med snabba, korta, sidorörelser loosen hjärnhinnorna (Figur 3C och 3C).
- Efter mikropipett spetsen har passerat hjärnhinnorna, avancera och höja mikropipett att dra hjärnhinnorna bort från ryggmärgen (Figur 3D och 3D).
- Flytta mikropipett rostrally, framåt över en till två hemisegments att exponera Rohon-Beard-celler (Figur 3E och 3E).
OBS: Dissekera minimalt med hjärnhinnorna som krävs för att bara avslöja några Rohon-Beard celler. Efter varje inspelning, är ytterligare dissektion utfördes för att avslöja mera Rohon-Beard celler. I både embryon och larver, kan Rohon-Beard neuroner ibland brista vid kontakt med plåstret mikropipett. Andra ryggmärgen nervceller inte beter detta sätt, vilket antyder att detta kan återspegla unika egenskaper hos Rohon-Beard celler, såsom deras Mekanosensitivitet. Som stöd för detta, flera lösningskompositionerna (t ex joniska komponenteroch osmolaritet) testades, och ingen har förhindrat detta beteende Rohon-Beard celler.
- Dissekering av larver för inspelningar från Rohon-Beard celler
OBS! I 7 DPF larver måste muskeln som omger rygg ryggmärgen tas bort. Följ steg 3.1.1 till 3.1.15 (med en larv substituerad för ett embryo) innan behandling med enzymet.- Att avlägsna muskeln, inkubera larven med 0,05% kollagenas under 1 min.
- Ta bort kollagenas genom att skölja preparatet ~ 5 gånger med Ringers lösning. Följ med ~ 5 sköljningar av extracellulärt lösning att helt ta bort kollagenas.
- Utföra återstoden av dissektion efter montering inspelningen kammaren på scenen av mikroskopet av inspelningen riggen. Bifoga ett borsilikat tjockväggiga patch mikropipett (figur 2B, botten) till elektrodhållaren och bryta spetsen av mikropipetten genom att försiktigt borsta den mot botten avsilikonkammaren.
- Använd något trasiga mikropipett att retas muskeln bort och utsätta rygg ryggmärgen. Att avlägsna muskelfibrer från beredningen genom avsugning genom slangen fäst till elektrodhållaren utlopp. Använda mikromanipulator för att förflytta mikropipett utmed längden av en muskelfiber samtidigt tillämpa sug.
OBS: Målet är att först använda mikropipett att mekaniskt lossa muskler och sedan suga bort och ta bort de individuella muskelfibrer. Ibland under avlägsnandet av muskeln blir mikropipett igensatt med sugs vävnad.- Att rensa mikropipett, borsta mikropipett mot bottnen av kammaren, något som bryter spetsen, medan man blåser luft genom slangen för att driva ut innehållet.
OBS: Om storleken på mikropipett spetsen blir alltför stor, kan en ny mikropipett behövas. Storleken på mikropipett tips är mer kritisk när du tar bort muskelskikten closest till membran som omger ryggmärgen eller hjärnhinnorna (små mikropipett tips möjliggöra mer kontrollerad arbete).
- Att rensa mikropipett, borsta mikropipett mot bottnen av kammaren, något som bryter spetsen, medan man blåser luft genom slangen för att driva ut innehållet.
- Avlägsna hjärnhinnorna som beskrivs i steg 3.1.18-3.1.20 med användning av en ny mikropipett (figur 2B, nederst).
Figur 4: Lateral dissektion av zebrafisk ryggmärgen. Monteringszebrafisk embryon i en lateral orientering underlättar tillgång till motoriska neuroner. Avlägsnandet av muskeln och dissektion av mening att exponera motomeuroner utförs under en upprätt mikroskop anpassat med en 40X vattenimmersionsobjektiv (se figur 2). (A) Motor neuron cellkroppar är belägna ventralt och lateralt i ryggmärgen. Embryon är bundna till kammaren så att deras dorsala sidan är vänd mot elektrodhållaren.Observera att suturen limmet verkar vit när den hårdnar (asterisker). När väl hindbrain är transected (a), huden skärs ytligt flera gånger vid ett ställe (b) kaudalt om hindbrain med användning av en glasmikropipett. Ytterligare ytliga skärsår (c), vinkelräta mot den första uppsättningen (b), bildning av en flik hud som pincett kan greppa för avlägsnandet av huden. (BG) En tom glasmikropipett, drog till en kort, avsmalnande spets (Figur 2B, nederst), är fäst på elektrodhållaren. Mikropipetten manövreras med hjälp av mikromanipulator för den efterföljande fina dissekering och avlägsnande av muskelvävnad. (B) Spetsen av glaset mikropipett först bryts något genom att försiktigt borsta den mot botten av kammaren, skapar en ojämn ände och en större spetsdiameter. Mikropipetten förflyttas utmed längden av muskelfibrerna medan sug appliceras. Muskelfibrer avlägsnas ett skiktvid en tidpunkt för att förhindra störningar av de underliggande hjärnhinnorna. Med embryon, är de mest dorsala muskelskikten avlägsnas först, eftersom dessa tenderar att vara tunnare. Huden avlägsnas inte från fler caudal hemisegments (pil). (C) Den dorsala halv av muskeln i ett hemisegment har avlägsnats (pil). (D) Svarta linjer avgränsa ett hemisegment saknar muskelfibrer, med intakta hjärnhinnorna täcker ryggmärgen (asterisk). (EE') Med användning av en mikropipett, appliceras tryck på hjärnhinnorna vid en position något dorsal till motorneuron somata. Snabba, korta, sidorörelser hos mikropipetten leder till piercing av hjärnhinnorna. (FF') Mikropipetten föres fram ventralt, mot den ventrala aspekten av hemisegment, och lyfte att separera hjärnhinnorna från neuronal vävnad. (GG) Meninges är transected genom förflyttning av mikropipetten rostrally längs längden av denhemisegment. Neuroner uppkommer omedelbart från den exponerade ryggmärgen och är nu tillgänglig för lappelektroder (pil). Skalstrecken = 500 ^ m i (A); Skalstrecken = 100 ^ m i BG (visad i panel B).
- Dissektion av embryon för motorneuron och interneuronen inspelningar
- Placera embryot i en dissektion kammare innehållande Ringers lösning och immobilisera embryo med tricaine, som i steg 3.1.1.
- Montera embryot i sidled, med sin ryggsidan vänd mot den sida av kammaren som är optimal för användaren (typiskt beror på handedness). Följ steg 3.1.2-3.1.17 och säkerställa att embryot förblir plant mot silikon (figur 4A och 4A').
- Använda ett borsilikat tjockväggiga mikropipett med en spets som har brutits till ~ 25 | im för att skrapa och sug muskeln bort och exponera hjärnhinnorna, såsom beskrivs i steg 3.2.4-3.2.4.1 (Figur 4B - <strong> 4D).
- När muskelskikten avlägsnas från hemisegment (er) av intresse (Figur 4D), byt ut glasmikropipett med en ny som har en intakt spets (Figur 2B, nederst). Punktera hjärnhinnorna vid en position som är dorsalt till målneuroner. Användning mikromanipulator, tryck mikropipett ner på hjärnhinnorna och sedan flytta den snabbt i sidled för att riva och korsa hjärnhinnorna (figur 4E och 4E').
- Vid spricker hjärnhinnorna, avancera och höja mikropipett att lyfta hjärnhinnorna bort från ryggmärgen (Figur 4F och 4F). Flytta mikropipett rostrally att riva membranet längs längden av den hemisegment (Figur 4G och 4G).
OBS: För inspelningar från Rohon-Beard celler och primära motoriska nervceller, är dissektion begränsad till clearing hjärnhinnorna bort från immediate målregionen. Däremot för inspelningar från interneuronen och sekundära motoriska nervceller, är det nödvändigt att avlägsna nervceller i ryggmärgen som hindrar tillgång till cellen av intresse. I det senare fallet, på grund av den omfattande störning av ryggmärgskretsar, är studier begränsade till analys av inneboende elektriska membranegenskaper.
4. Elektrofysiologiska inspelningar från Spinal Neuroner
- För inspelningar från Rohon-Beard-celler och motoriska nervceller, använd borsilikat tjockväggiga glaskapillärer dras till en resistans på ~ 3 Mohm när den är fylld med pipetten lösningen (Figur 2B, nederst).
- Applicera positivt tryck genom att blåsa försiktigt genom slangen fäst till elektrodhållaren före nedsänkning av mikropipett i badet.
OBS: Det positiva trycket förhindrar skräp från att igensättning mikropipett spetsen och upprätthålls genom att vrida trevägskran till offline position. En gång nära målet neuron, kommer det positiva trycket att resultera i en distinkt inbuktning av cellmembranet, en användbar indikator som mikropipetten är tillräckligt nära för att initiera tätningsbildning. - Frigöra det positiva trycket genom att vrida kranen ventilen till öppet läge under applicering av ytterligare ljus sug genom munstycket.
- Efter bildandet av en GQ-tätning mellan cellmembranet och mikropipett spetsen, applicera korta pulser av sug för att spräcka membranet och uppnå en hel-cellkonfiguration.
- Efter upprättande av en stabil helcells-konfiguration, med ett ingångsmotstånd 500 Mohm och en åtkomst motstånd 10 Mohm, erhålla inspelningar i antingen spännings- eller ström-clamp-läge.
- Applicera positivt tryck genom att blåsa försiktigt genom slangen fäst till elektrodhållaren före nedsänkning av mikropipett i badet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har framgångsrikt spelats in från Rohon-Beard neuroner i 17 HPF embryon genom 7 dpf larver (figur 5A och 5B). När Rohon-Beard celler registrerades, var preparatet monterade dorsal-sidan upp. Sådan montering möjliggör entydig identifiering av Rohon-Beard celler baserat på deras ytliga rygglägen och stora Soma storlekar. Identifieringen är dessutom bekräftas av den stereotypa hyperpolariserade vilande membranpotential av dessa neuroner (Figur 5, inlägg tabell) 6, 54. Dessutom, som primära sensoriska neuroner, Rohon-Beard neuroner saknar synaptisk inmatning. Därför, i frånvaro av elektrisk stimulering, bör inga förändringar i membranpotential förekommer vid inspelning i ström-clamp-läge (figur 5B). Eftersom de initiala inspelningar från Rohon-Beard-celler i zebrafisk utfördes <sup class = "xref"> 6, olika transgena linjerna (t.ex. Tg (islet2b: gfp), Tg (ngn: gfp), och Tg (isletss: gfp)) har genererats som uttrycker fluorescerande reportrar i dessa neuroner, vilket ytterligare underlättar deras identifiering 55, 56, 57.
Figur 5: Hela-cell spännings- och ström-clamp inspelningar från Rohon-Beard neuroner i en och 2 dpf embryon och 7 dpf larver. (A) Spänning-clamp inspelningar av utåt och inåt strömmar erhölls från Rohon-Beard neuroner i 1- (tunn svart linje), 2- (tjock svart linje), och 7-dpf (grå linje) embryon / larver. Hållpotentialen var -80 mV och strömmarna framkallades av en depolariserande steg till 20 mV. (B) Enkelaktionspotentialer framkallas genom kortvarig (1 ms) ströminjektioner (~ 0,35 nA) till Rohon-Beard neuroner av 1- (tunn svart linje), 2- (tjock svart linje), och 7-dpf (grå linje) embryon / larver. (B') I frånvaro av elektrisk stimulering, inga förändringar i membranpotential, såsom spontana postsynaptiska depolarisationer, inträffar i Rohon-Beard neuroner. Den infällda tabell sammanfattar de värden på vilande membranpotentialer som spelats in från Rohon-Beard neuroner av 1- (n = 21) och 2- (n = 9) dpf embryon och 7- (n = 7) dpf larver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Transgena linjer som tillåter entydig identifiering av andra ryggradsneuronundertyper finns också. Bland dessa, den mnx1 transgena linjen Tg (mnx1: gfp) uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i en delmängd av spinala motorneuroner snart efter deras specifikation (~ 14-16 HPF) <sup class = "xref"> 58, 59. På grund av den stereotypa positionering av de primära motoriska nervceller inom varje hemisegment (figur 6A), tillsammans med uttryck av GFP i mnx1 transgena, är det möjligt att identifiera de olika primära motoriska neuron undertyper (Figur 6B och 6C). Inklusive ett fluorescerande färgämne i inspelningen elektroden lösning gör det möjligt för visualisering av axonala banor, som ger ytterligare bekräftelse av motorneuron identitet, som vissa intemeuroner uttrycker också gfp i Tg (mnx1: gfp) linje. Alternativt är en annan transgen linje som möjliggör identifiering av motoriska nervceller i ET2 linjen 60.
Figur 6: Hela-cellspänningen och ström-clamp inspelningar från motoriska nervceller i ett dpf zebrafisk embryos. (A) En tecknad film visar de specifika morfologiska egenskaper hos de primära motoriska neuronundertyper närvarande i den zebrafisk ryggmärgen. Primära motomeuroner identifieras genom positionen av deras soma inom ett segment (dvs rostralt [ROP], mediala [MiP], eller kaudalt [CaP]) 45. Dessutom sträcker sig varje subtyp ett axon till periferin via en distinkt väg. Den kombinerade användningen av Tg (mnx1: gfp) linje och färgämnesmärknings avslöjar den stereotypa axonal arbor och identiteten för den motor neuron subtypen under en inspelning. Genom att använda de metoder som presenteras här, är det möjligt att sekventiellt spela in från tre olika primära motorneuron subtyper inom samma hemisegment. (B) Spänning-clamp inspelningar visas som erhölls från ROP, MIP, och CaP, allt i en enda hemisegment. Ett spänningssteg till 20 mV användes för att framkalla strömmar från en hållpotential av -80 mV. (C) Under ström-clamp recordings från ROP, MIP, och CaP, korta (1 ms, ~ 0,4 nA) nuvarande injektioner applicerades för att utlösa en aktionspotential. Membranpotentialen hölls vid ~ -65 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En principiell skillnad mellan primära och sekundära motoriska nervceller är den större somata av de tidigare födda neuroner. Emellertid sekundära motoriska neuronundertyper inte är identifierbara genom soma storlek och placering. För inspelningar från specifika sekundära motoriska nervceller, två transgena linjer, Tg (gata2: gfp) och Tg (islet1: gfp), har använts för identifiering av sekundära motoriska nervceller med ventralt och dorsalt utskjutande axoner, respektive 55, 61. Emellertid är tredjedel sekundär motor neuron subtyp närvarande i den zebrafisk ryggmärgen, med axons det projektet dorsalt och ventralt 62. Följaktligen kan färgämne användas för att fylla sekundära motoriska nervceller under inspelningar för att identifiera subtyper på grundval av morfologi (Figur 7A) 8, 9. Ofta, under spänningsklämma (figur 7B, asterisker) eller ström-clamp inspelningar (Figur 7C och 7C', pilspetsar) från sekundära motomeuroner, spontana eller synaptiska händelser registreras.
Figur 7: Hela-cellspänningen och ström-clamp inspelningar från sekundära motoriska nervceller av 2 dpf embryon. (A) I Tg (gata2: gfp) linje, två olika sekundära motoriska neuron subtyper uttrycka gfp 62. I den vänstra hemisegment, en ventral sekundär motor neuron(Asterisk och pilen indikerar soma och axon, respektive). I grann hemisegment, till höger (caudal), finns det en ventral / dorsal sekundär motor neuron (asterisk indikerar soma; pilar indikerar de två axoner, en utskjutande ventralt [nedre pil] och den andra dorsalt [top pil]). Dessa neuroner märktes med ett rött fluorescerande färgämne under inspelningarna. Att identifiera ventrala / dorsala sekundära motoriska nervceller, är det viktigt att säkerställa att dissektion inte avlägsnar muskel i den angränsande kaudala hemisegment, därigenom skadar eller tar bort den dorsala axonet. Efter inspelningen förblir neuron soma fäst mikropipetten när den dras bort från beredningen (höger topp asterisk). Vid användning av färgämnen för att fylla neuroner under inspelningar, ofta läcker färgämnet medan elektroden är i badet, vilket resulterar i en röd fluorescerande bakgrunden som syns i ryggmärgen och notokord (nedre asterisk i rostral [vänster] hemisegment < / Em>). (B) Spänning-clamp-registreringar erhölls från ventrala och ventrala / dorsala sekundära motoriska nervceller. Spänningssteg (till -30, -10, 10, 30, 50, 70, 90, och 110 mV) framkallade utåt och inåt strömmar. Icke-klämmande aktionspotentialer / depolarisationer kan vara närvarande i de inspelningar (asterisker). (C) Under ström-clamp inspelningar från sekundära motoriska neuroner, korta (1 ms) nuvarande injektioner av ökande amplitud applicerades på neuronerna för att utlösa en aktionspotential (asterisker). (C') Exempel på enstaka aktionspotentialer utlöses i sekundära motoriska nervceller vid ~ 0,4-nA ström injektioner visas. I detta skede, är spontana aktionspotentialer observeras också (C och C, pilspetsar). (D) Långvarig (100 ms) nuvarande injektioner (~ 0,35 nA) utlösa repetitiva bränning av aktionspotentialer. Membranpotentialen hölls vid ~ -65 mV.belastning / 55507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder som beskrivs här gör det möjligt att elektriska och morfologiska karakteriseringen av sensoriska och motoriska nervceller i zebrafiskembryon efter minimal dissektion av ryggmärgen. Nervceller förblir friska i minst 1 timme, den tidsfrist som ålagts dessa inspelningar. Neuroner har registrerats med användning av standard helcells-konfiguration, samt från kärnförsedda patchar; den senare metoden minimerar utrymmes clamp frågor som kan utesluta en detaljerad biofysiska studier av jonströmmar 9.
En viktig utmaning är att uppnå fast infästning av embryo eller larven till kammaren för att ta bort huden och utföra en begränsad dissektion krävs för att ge tillgång till nervceller av intresse. Preparatet måste också vara ordentligt fäst till registreringskammaren för helcells-patch-clamp metoder. En metod som möter denna utmaning genom användning av veterinär sutur lim för att fästa embryot eller larv tilldissektion / inspelningen kammaren beskrivs här, en metod som har använts för dissektion av andra modellorganismer (t.ex., Drosophila) 63. Från vår erfarenhet att utbilda andra, finner vi att det mest kritiska steget att bemästra är kontrollerad och exakt leverans av små mängder av lim. Här, är ett lim dispenseranordning som tillåter en användare att applicera negativt och positivt tryck för att ladda lim in i eller för att driva ut den från spetsen av en mikropipett diskuteras. Använder suturen lim, kan embryon och larver vara fast monterade till kammaren och orienterade antingen dorsala sidan uppåt eller i sidled. På detta sätt, olika alternativ för en mängd olika nervceller åtkomst finns. Också, kan skiktet av silikonelastomer på kammarens botten vara ännu tunnare än 1 mm som anges här, vilket ger potentiella optiska fördelar. En annan metod, oftare används för att fästa beredningen till ett registreringskammare, innefattar användning av fina volframstift 1 <sup>, 2, 3, 4, 5. Även om det metoder skiljer sig åt, både tillåter elektro tillgång till zebrafisk spinal nervceller, vilket ger forskare med alternativ som kan väljas baserat på de mål och utmaningar försöket.
Zebrafisk preparat som beskrivs här gör det möjligt att elektriska och morfologiska studier av spinal nervceller in situ under sin tidigaste stadierna av differentiering. Genom att spela in från spinala neuroner med användning av dessa metoder, har vi fått insikt i de cellulära effekterna av flera mutationer, även före identifieringen av den skadade genen 6, 64, 65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från NIH (F32 NS059120 till RLM och R01NS25217 och P30NS048154 till ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
- Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
- Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
- Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
- Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
- Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
- Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
- Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
- Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
- Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
- Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
- Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
- McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
- McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
- Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
- Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
- Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
- Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
- Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
- Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
- Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
- Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
- Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
- Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
- Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
- Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
- Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
- Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
- Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
- Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
- Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
- McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
- Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).
