Summary
Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.
Abstract
Zebravis, voor het eerst geïntroduceerd als een ontwikkelingsmodel, hebben opgedaan populariteit in vele andere gebieden. Het gemak van het houden van grote aantallen snel ontwikkelende organismen, gecombineerd met de embryonale optische helderheid, diende als de eerste overtuigende kenmerken van dit model. In de afgelopen twee decennia is het succes van dit model verder voortgestuwd door zijn ontvankelijkheid voor grootschalige mutagenese schermen en door het gemak van transgenese. Meer recent zijn gen-editing benaderingen van de kracht van het model uitgebreid.
Voor neurologische studies, de zebravis embryo en larven kunnen dus model waaraan meerdere methoden kunnen worden toegepast. Hier richten we ons op methoden die de studie van een essentiële eigenschap van neuronen, elektrische prikkelbaarheid mogelijk te maken. De voorbereiding van de elektrofysiologische studie van zebravis spinale neuronen omvat het gebruik van lijm dierenarts hechting aan het preparaat een opnamekamer garanderen. Alternatieve methoden voor het opnemenvan zebravis embryo's en larven omvatten de hechting van het preparaat aan de kamer met een fijne wolfraamstift 1, 2, 3, 4, 5. Een wolfraamstift wordt meestal gebruikt om het preparaat in een zijdelingse richting zet, al is gebruikt om larven dorsale zijde omhoog 4 monteren. De hechting lijm is gebruikt om embryo's en larven in beide richtingen te monteren. Gebruik van de lijm kan een minimale dissectie worden uitgevoerd, waardoor de toegang tot spinale neuronen zonder toepassing van een enzymatische behandeling, waardoor schade geen vermijden. Voor larven, is het noodzakelijk een korte enzymbehandeling toepassing op het spierweefsel rond het ruggenmerg verwijderd. De hier beschreven methoden zijn toegepast om de intrinsieke elektrische eigenschappen van motorneuronen, interneuronen en sensorische neuronen op verschillende developmentà bestuderenl trappen 6, 7, 8, 9.
Introduction
George Streisinger pionier in het gebruik van Danio rerio, beter bekend als de zebravis als een modelsysteem voor de genetische analyse van gewervelde ontwikkeling 10. Het model biedt verscheidene voordelen waaronder: (1) betrekkelijk eenvoudige en goedkope veeteelt; (2) externe bevruchting, waardoor u gemakkelijk toegang tot de embryo's uit de vroegste ontwikkelingsfasen; en (3) een transparante embryo, die rechtstreeks en herhaalde waarnemingen van cellen, weefsels en organen zij vormen.
In de daaropvolgende decennia verschillende ontwikkelingen verder vergroot de kracht van de zebravis model. In het bijzonder naar voren genetische screens en hele genoom sequencing inspanningen speelden een belangrijke rol in de identificatie van mutaties en genen van cruciaal belang voor vele ontwikkelingsprocessen 11, 12, 13, 14,"> 15 16. Gateway klonering werkwijzen kon de routinematige toepassing van transgene benaderingen 17, 18. Recente vooruitgang in genoom uitgeven, met als voorbeeld transcriptie-activator-achtige (Talens) en geclusterde regelmatige afstand van elkaar korte palindroom herhalingen (CRISPR) -Cas9 nucleasen, zorgen voor de beoogde invoering van mutaties, evenals knock-out en knock-in benadert 19, 20, 21, 22. Gecombineerd, deze methoden maken zebravis een krachtig model voor de studie van de genetische mechanismen die ten grondslag liggen aan specifieke gedragingen en verschillende ziekten bij de mens 23, 24, 25, 26, 27.
Dit werk richt zich op de ontwikkeling vanmentale regelgeving en de rol van de elektrische activiteit in neuronale ontwikkeling. De nadruk ligt op het ruggenmerg, waarbij de zebravismodel verschaft verscheidene voordelen. Ten eerste is het relatief eenvoudig om toegang te krijgen tot de zebravis op de embryonale en larvale stadia; Daarom kan men ruggenmerg functie te bestuderen tijdens ontwikkelingsstadia die minder neuronen en eenvoudigere circuits 28, 29 hebben. Bovendien is de zebravis ruggenmerg heeft een diverse set van neuronen, vergelijkbaar met andere gewervelde dieren, zoals gedemonstreerd door karakteristieke en kenmerkende patronen van transcriptiefactoren 30, 31, 32, 33, 34, 35.
De meeste studies in zebravis die gericht zijn op de mechanismen die de functie van het ruggenmerg ten grondslag liggen bloot circuits, met nameDegenen die voortbeweging ondersteunen, zijn begrijpelijkerwijs gericht op larvale stadia 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Veel van de neuronen die het ruggenmerg loc netwerken vormen initiëren hun differentiatie in vroege embryonale stadia ~ 9-10 uur na bevruchting (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Met het oog hierop, begrijpen hoe de morfologische en elektrische eigenschappen van spinale neuronen ontstaan en verandering tussen de embryonale en larvale stadia is belangrijk voor een overall kennis van de vorming en functie bewegingsapparaat circuit.
De dissectie hier beschreven methoden mogelijk patch clamp opnamen van spinale neuronen en met succes toegepast op embryonale stadia (~ 17-48 HPF) en larvale stadia (~ 3-7 dagen na de bevruchting [DPF]). Deze aanpak beperkt de hoeveelheid dissectie die nodig is om de toegang tot de neuronen van belang. Het protocol verschilt van de meeste andere gepubliceerde methoden voor het registreren van zebravis spinale neuronen doordat dierenarts hechting lijm wordt toegepast, in plaats van een fijne wolfraamstift, het embryo of larven hechten aan de registratiekamer. De beschikbaarheid van twee verschillende benaderingen (dwz hechtdraad lijm ten opzichte van de wolfraam pin) voor het monteren van de zebravis embryo's of larven voor elektrofysiologische analyse geeft onderzoekers met alternatieve mogelijkheden om hun specifieke experimentele doelen te bereiken.
Ten eerste, de procedures voor het openen en het opnemen van een pop ulatie primaire sensorische neuronen, Rohon Beard-cellen beschreven. De cellichamen van deze neuronen liggen in de dorsale ruggenmerg. Rohon-Beard cellen bestaan in diverse gewervelde species, differentiëren vroeg in de ontwikkeling en ten grondslag aan de embryonale aanslagreactie 6, 44, 47, 48.
Ten tweede, procedures voor het openen en het opnemen van spinale motorische neuronen gedetailleerd. Zebravis spinale motorische neuronen voordoen bij twee golven van neurogenese. De eerder geboren primaire motorische neuronen ontstaan eind van gastrulatie (~ 9-16 HPF), met slechts 3-4 primaire motorische neuronen onderhavige per hemisegment 45, 46, 49. Daarentegen De latere populatie van secundaire motorische neuronen talrijker en ontstaat gedurende langere tijd, te beginnen bij ~ 14 HPFef "> 45 50. secundaire motor neuron genesis midden bundelsegmenten wordt meestal afgesloten met 51 HPF 50. Secundaire motorneuronen worden beschouwd als de tegenhanger van motorneuronen in amnioten zijn 46. Interessant supraspinale neuronen, via dopamine reguleren motoriek in de larve en secundaire motor neuron ontstaan in het embryo en jonge larven 50, 51. Primaire en secundaire motorische neuronen bevatten elk verschillende subtypes. elke primaire motorische neuron subtype projecteert een perifere axon dat een kenmerk spiergroep innerveert, leidt tot een stereotype, identificeren axonale traject. In het algemeen, secundaire motorneuronen volgen axonale trajecten eerder bij primaire motorische neuronen. Aldus opzichte van axonale trajecten, primaire en secundaire motorische neuronen vergelijkbaar, behalve dat axonale dikte en grootte een somatare groter voor primaire motorische neuronen 45.
Ten derde, werkwijzen voor het opnemen van enkele soorten interneuronen besproken. In deze gevallen beperkt verwijdering van andere ruggenmerg cellen is vereist, om zo het ruggenmerg meer intact dan bij opnamen van Rohon-Beard cellen of motorneuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC; Office of Laboratory Animal Resources, Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus).
1. zebravis Veehouderij
- Verhogen en volwassen zebravis (Danio rerio) te handhaven op 28,5 ° C op een 10 uur donker / 14 uur lichtcyclus en met de juiste waterbehandeling en uitwisseling 52.
- Verhogen zebravis embryo / larven bij 28,5 ° C in embryo medium totdat de gewenste fase (bijvoorbeeld 2 dpf) te bereiken.
2. Voorbereiding van de Dissection Materials
- Lijm dispenser voor zebravis dissectie
Opmerking: Dit protocol omvat het gebruik van lijm dierenarts hechting aan het preparaat de registratiekamer bevestigen. Succesvolle gebruik van de hechting lijm vereist de toepassing van kleine hoeveelheden lijm op een gecontroleerde manier. De lijm begint te verharden zodra hetontmoet een waterige omgeving. Derhalve trekt de lijm in een micropipet en leveren geringe hoeveelheden via zelfgemaakte "lijmdispenser" die de toepassing van negatieve of positieve druk via de mond mogelijk maakt. Het centrale deel van de lijm pomp een glas boring, een stuk dat is opgenomen in het pakket met de dunwandige borosilicaat glazen capillairen (Figuur 1A). Aan één uiteinde is de boring via een stuk buigzame slang met een mondstuk, terwijl het andere einde bezit het glazen micropipet (Figuur 1).- Verwijder de bol van het ene glas boring en vervangen door de witte rubberen adapter van een glas boring (figuur 1B en 1C).
Opmerking: Deze dubbele-adapter bedekte glazen boring maakt verbinding met een glazen micropipet aan één uiteinde en aan het andere einde, een stuk flexibele buis via een kleine, rechte polypropyleen fitting (Figuur 1B, bijvoegsel). <li> Snijd een stuk flexibele buis met een lengte van ~ 38 cm. Bevestig het mondstuk (bijvoorbeeld een gele 200 pl micropipettip) aan het einde van de flexibele buis niet met het glas boring.
Opmerking: Het buisstuk moet lang genoeg zijn om manipulatie van de glazen micropipet toe onder een dissectie scope terwijl de micropipet gele tip in de mond (figuur 1D) zijn. - Verwijder de bol van het ene glas boring en vervangen door de witte rubberen adapter van een glas boring (figuur 1B en 1C).
Figuur 1: Lijm dispenser. (AC) Een glazen boring verbindt met flexibele buis aan een einde en de glazen micropipet op het andere. De rubberen adapters maken bevestiging via een kleine polypropyleen fitting (B, bijvoegsel) aan de buis en uiteindelijk op een glazen micropipet aan het andere uiteinde. (D) de laatste lijmdispenser een mondstuk (bijvoorbeeld vervaardigd uit een plastic pipetpunt) aan een einde van de buis en de glazen boring met de bijgevoegde micropipet aan het andere (pijlpunt).
- Dissectie / registratiekamer
OPMERKING: De dissectie kamer dient ook als elektrofysiologie opname kamer. De kamer wordt gevormd op een glasplaat met behulp voorgesneden stukken uitgeharde siliconenelastomeer (figuur 2A).- Het siliconenelastomeer bereiden, voeg de basis en het hardingsmiddel een plastic conische buis in een 4: 1 verhouding, respectievelijk.
- Meng het elastomeer base en het hardingsmiddel grondig en giet het mengsel in twee 100 mm petrischalen. Giet het elastomeer een dikte van <1 mm in een petrischaal en -2,5 mm in de andere.
- Laat het siliconenelastomeer te genezen door blootstelling aan lucht voor ~ 4-5 dagen. Als eerder geharde elastomeer nodig, incubeer deze bij 60 ° C.
- Gesneden stukken van de uitgeharde siliconenelastomeer de volgende afmetingen:
- Van de ~ 1 mm-longhaasjes geharde elastomeer, snijd een -3,8 x 6,3 cm rechthoek; Dit stuk vormt de bodem van de kamer (figuur 2A). Van het ~ 2,5 mm dikke siliconen, snijd een rechthoek -3,8 x 6,3 cm. Van de laatste rechthoek uitgesneden interne rechthoek ~ 2,5 x 5 cm; de resulterende kader geeft de bovenzijde van de kamer (figuur 2A).
- De dissectie / registratiekamer maken, plaatst de dunne silicone rechthoek direct bovenop een glasplaat (5 x 7,6 cm), en eventueel aanwezige luchtbellen tussen de siliconen en glazen (figuur 2A) verwijderd. Plaats de siliconen Rechthoekkader, gesneden uit de dikkere elastomeer, bovenop de dunne bodemlaag van siliconen.
- Controleren of de siliconenlagen hechten goed aan elkaar en dat er geen luchtbellen tussen de twee lagen (figuur 2A).
- Na gebruik ontmantelen de kamer door verwijdering van de dikke rechthoek siliconen rek van beneden siliconen layter die is bevestigd aan het glasplaatje bevestigd. Spoel de siliconen oppervlakken DDH 2 O vóór gebruik en na elk registratiesessie en droog met pluisarme doekjes.
- Bewaar de kamer droge schimmelgroei tussen de twee stukken van siliconen voorkomen.
Opmerking: Als toxinen of farmacologische middelen die niet gemakkelijk kunnen spoelen van de siliconen worden gebruikt wijden specifieke kamers voor deze doeleinden.
Figuur 2: Elektrofysiologie kamer en dissectie-instrumenten. (A) De kamer voor de dissecties en elektrofysiologische opnames bestaat uit een glasplaat waarop zijn geplaatst twee stukken uitgeharde siliconenelastomeer, gelaagd bovenop elkaar om een frame en een bodem van een put te verschaffen. De grootte van de put, ~ 2,5 x 5 cm, maakt het gebruik van kleine volumes (2-2,5 ml) extracellulaireoplossing. De onderste siliconenlaag zorgt voor veilige plaatsing van de zebravis embryo gebruikt weefselkleefstof dat niet hecht aan glas. (B) Een glazen micropipet (bovenaan) wordt gebruikt lijm afgifte tijdens de dissectie. De dunwandige glas getrokken lang, taps toelopend uiteinde dat later wordt gesneden, het creëren van een punt met een diameter van ~ 75 urn. De tapse glazen micropipet wordt het vrije uiteinde van de lijmdispenser (figuur 1D, pijlpunt) en voorzijde gevuld met lijm door toepassing van zuiging gevoegd. De overige micropipet (onder), getrokken zoals één gebruikt voor een patch-clamp-opname, wordt gebruikt voor het doorsnijden van de achterhersenen en huid verwijderen. (C) Onder een microscoop rechtop wordt een micromanipulator gebruikt om de micropipet te manoeuvreren de uiteindelijke dissectie stappen. Een glazen micropipet, zoals in B, bodem, wordt de elektrodehouder (pijl) bevestigd. Spier verwijdering wordt bereikt door eenpplying zuiging door de slang verbonden met de luchtuitlaat (pijlpunt). Aan zijn andere uiteinde is de slang verbonden met een kraan (zwarte pijl) dat aan zijn andere zijde (asterisk) heeft buismateriaal bevestigd aan een mondstuk.
3. Ontleding van embryo's en larven van patch-clamp opnamen van spinale neuronen
Figuur 3: Dorsale dissectie van een zebravis ruggenmerg. (AA') na transectie achterhersenen (a) een 2-dpf embryo, de huid wordt aan de linker en rechterkant van het embryo (b) snijden. Een tweede fractie, loodrecht op de eerste, wordt dan uitgevoerd (c). Vervolgens wordt de huid opgetild met behulp van een micropipet, waardoor pincet te grijpen en weg te trekken van de huid. (B) Het verwijderen van de huid onthult de dorsale ruggenmerg. Rostraal van de zwarte lijn, de skin is verwijderd en het oppervlak van het ruggenmerg (asterisk), binnen de hersenvliezen, wordt blootgesteld. De huid blijft intact caudaal van de zwarte lijn (pijl). (CC) Het uiteinde van de glazen micropipet wordt aangedrukt de hersenvliezen en snelle zijwaartse korte bewegingen uitgevoerd om de hersenvliezen doorboren. (DD en EE ") Als de hersenvliezen doorboord (DD '), de micropipet wordt voortbewogen en (EE) bewogen rostraal aan de hersenvliezen scheuren in twee segmenten. De somata van neuronen Rohon-Beard meestal ontstaan na verwijdering van de hersenvliezen (pijl). (FG) in een 7-dpf larve, spierlagen betrekking op de dorsale zijde van het ruggenmerg, belemmeren toegang tot Rohon-Beard neuronen. Na verwijdering van de huid, wordt de larve behandeld met 0,05% collagenase. (F) een 5 min incubatie met 0,05% collagenase te streng, wat resulteertin overmatige slijtage spier, zoals blijkt uit de verzwakte spieren (pijl en inzet). (F) Overmatige collagenase behandeling kan ook schade Rohon-Beard neuronen (pijl), hier onthuld door hun expressie van GFP in de Tg (islet2b: GFP) lijn. In de Tg (islet2b: GFP) lijn, dorsale wortel ganglion neuronen ook GFP (pijlpunt) tot expressie brengen. Een kortere 1 min incubatie met 0,05% collagenase los voldoende de spier (G) met behoud van de morfologie myotoom (pijl en inzet). (G) Pigment cellen aanwezig bovenop de dorsale spierlaag (pijlpunt). (H en I) In de Tg (islet2b: GFP) lijn, Rohon-Beard neuronen (pijlen) en de dorsale wortel ganglion (pijlpunt) blijven GFP expressie 7 dpf. Dorsale uitzicht op Tg (islet2b: GFP) zebravis embryo's in 2 dpf (H) eend 7 dpf (I). In paneel A Schaalbalken = 500 urn; BE (getoond in paneel B) Schaal bar = 80 urn; F en G '(getoond in paneel F) Schaal bar = 200 urn; H en I (getoond in paneel H) Schaal bar = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Dissectie van embryo's voor opnamen van Rohon-Beard cellen
- Plaats een embryo in een dissectie kamer die -2-3 ml Ringer-oplossing (figuur 2A). Blokkeer de embryo door toevoeging -100 pl 0,4% tricaïne oplossing naar de kamer.
- Pull dunwandige glazen micropipetten op een micropipet trekker via een doos filament om een lange, dunne punt, vergelijkbaar met een injectie micropipet (Figuur 2B, bovenste) 53 te verkrijgen.
- Bevestig de getrokken glazen micropipet om het glas boring of de lijm dispenser. Onder de dissectiemicroscoop gebruik pincet om het uiteinde van de glazen micropipet te breken zodat de punt ~ 75 urn (figuur 2B, geplaatst).
OPMERKING: De tip maat zal groot genoeg zijn om efficiënt laden van de lijm mogelijk in de punt door de toepassing van negatieve druk (monding zuiging) worden voor vullen van de micropipet, maar klein genoeg om de precieze toepassing van de lijm via positieve druk toe . - Laad de glazen micropipet met ~ 3-5 pi van lijm door het toepassen van zuiging door het mondstuk. Breng de lijm gevulde tip om de dissectie kamer.
LET OP: Het vullen van de micropipet met lijm vereist een sterke zuigkracht. Indien de micropipet vult snel met zwakke zuig-, de tip te groot. - Plaats het embryo in de opnamekamer (Figuur 3A en 3A); voor opnamen van embryo's en jonge larven (≤72 HPF), is er geen noodzaak om spierweefsel te verwijderen.
- Brengenhet uiteinde van de lijm geladen micropipet nabij de kop van het embryo / larve terwijl lichte overdruk naar de micropipet via de mond buis (om het binnendringen van waterige oplossing te voorkomen). Zodra de punt nabij de kop van het embryo toepassing voldoende overdruk om een kleine druppel lijm drijven op de bodem van de kamer.
OPMERKING: De lijm uithardt eenmaal in contact met de waterige oplossing, dus is het belangrijk aan te brengen en te onderhouden lichte overdruk als deze zich in de dissectie oplossing. - Gebruik een dissectie penwerktuig het embryo / larve bewegen naar de druppel lijm zodat de kop contact met de lijm maakt. Richt de embryo dorsale-kant naar boven en druk op het hoofd om een goed contact met de lijm te garanderen.
- Aangezien de lijm langzaam uithardt, gebruik ontleden pin te herpositioneren het embryo / larve zodat het ligt ventrale naar beneden, rug naar boven. Dompel de dissectie pin gereedschap in de druppel lijm en trekken draden van de lijm op en over het hoofdvan het embryo zijn positie verder te beveiligen.
OPMERKING: tricaïne versnelt het tempo waarin de lijm verhardt. Als u meer tijd om te werken met de lijm mogelijk te maken, gebruik dan de minimale hoeveelheid tricaïne die nodig is om de embryo / larve immobiliseren. Bovendien kan de hardingssnelheid variëren met verschillende veel lijm. Wanneer derhalve gebruik van een nieuwe batch lijm, bepalen de snelheid van harden alvorens het voor dissectie. - Zodra de kop stevig is bevestigd aan de siliconen en de lijm is verhard, offeren het embryo / larve door doorsnijding op de achterhersenen niveau een glazen micropipet (Figuur 3A-a en 4A-a).
OPMERKING: hindbrain doorsnijding is de methode die hier wordt gebruikt voor humane het offeren van dieren. Echter, afhankelijk van de experimentele doelen (bijvoorbeeld, de studie van de fictieve zwemmen), een andere methode kan nodig zijn. - Alvorens de staart naar de kamer, verwijdert de huid van de romp.
- Gebruikeen vers glazen micropipet (Figuur 2B, onderste) oppervlakkig snijden de huid meerdere malen in een positie caudaal van de achterhersenen (figuur 3A-B en 4A-B). Doordring de huid oppervlakkig door het bewegen van de pipet loodrecht op het rostro-caudale as aan weerszijden van de romp van dorsaal bevestigd (figuur 3A-b) of monsters aan de zichtzijde van de romp voor het zijdelings gemonteerde monsters (Figuur 4A b).
- Een huidflap voor pincetten te grijpen creëren, schraap de huid verschillende keren met de micropipet op het vlak van en loodrecht op de eerste snede in stap 3.1.10.1 (Figuur 3A-C en 4A-C).
- Met een pincet geleidelijk til de huidflap en trek de huid caudaal.
LET OP: Dit resulteert vaak in het verwijderen van het geheel van de huid tegen de stam. Het is echter sometimes nodig om de huid in verschillende secties te verwijderen door het uitvoeren van herhaalde schrapen en trekken van de huid. Voor sommige toepassingen kan gedeeltelijk verwijderen van de huid voldoende toegang tot het ruggenmerg interessante segmenten (Figuren 3B en 4B) mogelijk. - Lever een kleine druppel lijm in de buurt van de staart van het embryo / larve. Gebruik lijm om de staart hechten aan de bodem van de kamer dissectie. Tijdens deze stap, omdat de lijm verhardt, wordt de plaats van de stam met het ontleden penwerktuig zodat de romp blijft dorsaal gericht en dat hij stevig bevestigd aan de kamer.
- Na deze eerste dissectie, spoel de voorbereiding uitgebreid met Ringer-oplossing voor tricaïne en vuil te verwijderen. Laat de voorbereiding rusten ~ 5 min.
- Vervang de dissectie oplossing met extracellulaire oplossing. Voeg indien nodig een immobiliserend middel aan het preparaat (bijv., Α-bungarotoxine [laatste concentration van 1 uM]).
Opmerking: 1 uM α-bungarotoxine immobiliseert 1-2 DPF embryo binnen ~ 30 minuten. Voor oudere larven, kan een hogere concentratie van α-bungarotoxine nodig zijn. a-bungarotoxine wordt in de badoplossing bij opnames die kenmerkend worden uitgevoerd binnen 1 uur. Opname oplossingen die divalente kationen, zoals kobalt, niet de toevoeging van een immobiliserend middel vereist. Voor experimenten waarbij langere opnameperiodes (over 1 uur), wordt het preparaat geperfundeerd met badoplossing met een snelheid van 0,5-1 ml / min. - Verplaats de dissectie kamer met gemonteerde embryo tot het stadium van een rechtopstaande samengestelde microscoop uitgerust met een 40X water immersie objectief lange werkende afstand.
LET OP: Deze microscoop maakt deel uit van het tuig waar de opnamen worden uitgevoerd. Het tuig moet ook worden uitgerust met een headstage, een patch-clamp versterker, een micromanipulator en een data acquisitie / computersysteem (figuur 2C). - Zet een lege borosilicaat dikwandige glazen micropipet op de elektrodehouder van de headstage (figuren 2B, 2C en bodem, pijl). Attach buis (binnendiameter 0,16 cm, buitendiameter 0,32 cm en lengte: ~ 90 cm) aan één uiteinde aan de luchtuitlaat van de elektrodehouder (pijlpunt) en aan het andere einde met een driewegkraan (figuur 2C , zwarte pijlpunt).
- Plaats een mondstuk aan een einde van een ander buisstuk (~ 60-70 cm lang) en bevestigen aan de driewegkraan aan het andere uiteinde (figuur 2C, zwarte asterisk).
Opmerking: Deze slangensysteem voorziet in de toepassing van positieve en negatieve druk op de binnenzijde van de opname pipet tijdens afdichting vormen.
- Plaats een mondstuk aan een einde van een ander buisstuk (~ 60-70 cm lang) en bevestigen aan de driewegkraan aan het andere uiteinde (figuur 2C, zwarte asterisk).
- Breng de micropipettip aan de dorsale gedeelte van het ruggenmerg en voorzichtig doorboren de hersenvliezen. Volg met snelle, korte, zijwaartse bewegingen te Loosen de meninges (Figuur 3C en 3C).
- Nadat de micropipettip de hersenvliezen heeft doorlopen, vooruit en de micropipet te maken tegen de hersenvliezen verwijderd van het ruggenmerg (figuur 3d en 3d') te trekken.
- Verplaats de micropipet rostraal, voortbewegen op 1-2 hemisegments tot Rohon Beard-cellen (Figuur 3E en 3E) bloot.
OPMERKING: Ontleden de minimale hoeveelheid van de hersenvliezen die nodig is om slechts een paar Rohon-Beard cellen bloot te leggen. Na elke opname wordt extra dissectie uitgevoerd om meer Rohon-Beard cellen onthullen. Zowel embryo's en larven kunnen Rohon-Beard neuronen soms barsten bij contact met de patch micropipet. Andere ruggenmerg neuronen zich niet gedragen op deze manier, wat suggereert dat dit zou kunnen weerspiegelen unieke eigenschappen van de Rohon-Beard cellen, zoals hun mechanische gevoeligheid. Ter ondersteuning van deze verschillende samenstellingen oplossing (bijv ionencomponentenen osmolariteit) getest en geen ervan het gedrag van Rohon-Beard cellen voorkomen.
- Dissectie van de larven voor opnamen van Rohon-Beard cellen
LET OP: In 7 DPF larven, moet de spieren rond de dorsale ruggenmerg worden verwijderd. Volg stappen 3.1.1 tot 3.1.15 (een larve vervanging van een embryo) vóór behandeling met het enzym.- De spier te verwijderen, incubeer de larve met 0,05% collagenase gedurende 1 minuut.
- Verwijder de collagenase door het spoelen van de voorbereiding ~ 5 keer met de Ringer's oplossing. Volg met ~ 5 spoelingen van extracellulaire oplossing voor de collagenase volledig te verwijderen.
- Voer de rest van de dissectie na montage de opname kamer op het podium van de microscoop van de opname rig. Bevestig een boorsilicaat dikwandige patch micropipet (Figuur 2B, onder) de elektrodehouder en breek de punt van de micropipet door zachtjes borstelen tegen de bodem vande siliconen kamer.
- Met de enigszins gebroken micropipet om de spier verwijderd plagen en bloot de dorsale ruggenmerg. Om spiervezels uit het preparaat te verwijderen, afzuigen door de buis aan de elektrodehouder uitlaat. Met de micromanipulator om de micropipet te bewegen langs de lengte van een spiervezel tijdens het aanbrengen van zuiging.
Opmerking: Het doel is om eerst de micropipet gebruikt mechanisch losmaken spieren en vervolgens weg te zuigen en verwijder de afzonderlijke spiervezels. Af en toe, tijdens het verwijderen van de spieren, de micropipet verstopt raakt met de afgezogen weefsel.- De micropipet ontstoppen, borstel de micropipet tegen de bodem van de kamer, wat het breken van de punt, terwijl het blazen van lucht door de buis om de inhoud te verdrijven.
LET OP: Als de grootte van de micropipet tip buitensporig groot is, kan een nieuwe micropipet nodig zijn. De grootte van de micropipettip kritischer bij het verwijderen van de spierlagen closest de vliezen rond het ruggenmerg of meninges (kleine micropipet uiteinden kan meer worden bediend).
- De micropipet ontstoppen, borstel de micropipet tegen de bodem van de kamer, wat het breken van de punt, terwijl het blazen van lucht door de buis om de inhoud te verdrijven.
- Verwijder de hersenvliezen zoals beschreven in stap 3.1.18-3.1.20 met een nieuwe micropipet (Figuur 2B, onderaan).
Figuur 4: Laterale dissectie van de zebravis ruggenmerg. Montage zebravis embryo's in een zijdelingse oriëntatie vergemakkelijkt de toegang tot motorneuronen. De verwijdering van de spieren en dissectie van de meninges de motorneuronen blootstellen wordt uitgevoerd onder een microscoop rechtop ingericht met een 40X water immersie objectief (zie figuur 2). (A) Motor neuron cellichamen ventraal en lateraal gelegen in het ruggenmerg. Embryo's worden bevestigd aan de kamer zodat de dorsale zijde naar de elektrodehouder.Merk op dat de hechting lijm wit lijkt zodra het verhardt (sterretjes). Zodra de achterhersenen wordt doorsneden (a), wordt de huid oppervlakkig meerdere malen te snijden bij een plaats (b) caudaal van de hindbrain met een glazen micropipet. Aanvullende oppervlakkige insnijdingen (c), loodrecht op de eerste reeks (b), vormen een lip huid die pincet kan grijpen voor het verwijderen van de huid. (BG) Een lege glazen micropipet, getrokken naar een korte, taps toelopende punt (figuur 2B, onder), wordt de elektrodehouder verbonden. De micropipet wordt gemanoeuvreerd met behulp van de micromanipulator voor de daaropvolgende fijne dissectie en verwijdering van spierweefsel. (B) Het uiteinde van de glazen micropipet wordt eerst enigszins gebroken door zachtjes borstelen tegen de bodem van de kamer, waardoor een scherp uiteinde en een grotere tip diameter. De micropipet wordt bewogen langs de lengte van de spiervezels terwijl zuiging wordt toegepast. Spiervezels verwijderd één laagop een moment om de verstoring van de onderliggende hersenvliezen te voorkomen. In embryo's, worden de dorsale spierlagen eerst verwijderd, omdat deze vaak dunner. De huid niet verwijderd uit meer caudaal hemisegments (pijl). (C) De dorsale helft van de spier in een hemisegment weggelaten (pijl). (D) Zwarte lijnen bakenen een hemisegment zonder spiervezels, met intacte meninges die het ruggenmerg (asterisk). (EE) Met behulp van een micropipet, wordt druk uitgeoefend op de hersenvliezen op een punt net dorsaal motorneuron somata. Snelle, korte, zijwaartse bewegingen van de micropipet tot het doorboren van de hersenvliezen. (FF) De micropipet wordt ventraal voortbewogen, naar het ventrale aspect van de hemisegment en opgeheven om de hersenvliezen scheiden van neuronaal weefsel. (GG) Meninges worden doorsneden door de micropipet rostraal bewegen over de lengte van dehemisegment. Neuronen onmiddellijk blijken uit de blootgestelde ruggenmerg en zijn nu toegankelijk voor strookelektrodes (pijl). Schaalbalken = 500 urn (A); Schaalbalken = 100 urn BG (getoond in paneel B).
- Dissectie van embryo's voor motor neuron en interneuron opnames
- Plaats het embryo in een dissectie ruimte bevattende Ringer's oplossing en immobiliseren het embryo met tricaïne, zoals in stap 3.1.1.
- Monteer het embryo zijdelings met zijn dorsale zijde tegenover de zijde van de kamer die optimaal is voor de gebruiker (gewoonlijk afhankelijk handigheid). Volg stap 3.1.2-3.1.17 en zorgen dat het embryo plat tegen de silicone (figuur 4A en 4A) blijft.
- Gebruik een boorsilicaat dikwandige micropipet met een tip die is gebroken om ~ 25 urn te schrapen en zuig de spier verwijderd en bloot de hersenvliezen, zoals beschreven in stap 3.2.4-3.2.4.1 (Figuur 4B - <strong> 4D).
- Zodra de spierlagen van de hemisegment (s) van belang (figuur 4D) worden verwijderd, vervangen glazen micropipet met een nieuwe die een intact uiteinde (figuur 2B, onder) heeft. Doorboren de hersenvliezen op een positie die dorsaal de doelneuronen. Gebruik van de micromanipulator, duwt de micropipet beneden op de hersenvliezen en bewegen vervolgens snel zijwaarts te scheuren en beweeg de hersenvliezen (Figuur 4E en 4E).
- Na het verbreken van de hersenvliezen, te bevorderen en de micropipet te verhogen tot de hersenvliezen uit de buurt van het ruggenmerg (figuur 4F en 4F) op te heffen. Verplaats de micropipet rostraal aan het membraan langs de lengte van de hemisegment (Figuur 4G en 4G) scheuren.
OPMERKING: Bij opnames van Rohon-Beard elementen en motorische neuronen, dissectie is beperkt tot het wissen van de hersenvliezen verwijderd van de immediate doelgebied. Daarentegen voor opnamen van interneuronen en secundaire motorische neuronen, is het noodzakelijk om neuronen in het ruggenmerg die toegang tot de cel van belang weg staan. In het laatste geval door de omslachtige verstoring van ruggenmerg schakelingen studies beperkt tot de analyse van intrinsieke elektrische membraaneigenschappen.
4. elektrofysiologische registraties van Spinal Neuronen
- Voor opnames van Rohon-Beard cellen en motorische neuronen, gebruikt boorsilicaat dikwandige glazen capillairen getrokken om een weerstand van ~ 3 MQ, wanneer gevuld met de pipetoplossing (figuur 2B, onderaan).
- Toepassen overdruk door zachtjes blazen door de buis aan de elektrodehouder voorafgaand aan het onderdompelen van de micropipet in het bad.
OPMERKING: De overdruk voorkomt dat vuil verstopt de micropipettip en wordt onderhouden door de driewegkraan in de uit positie. Eenmaal bij het doelneuron, zal de positieve druk tot een opvallende inkeping van het celmembraan, een nuttige indicator die de micropipet dicht genoeg bij de vorming van verbinding initiëren. - Laat de overdruk door de kraan klep naar de open stand tijdens het toepassen van additionele het zuigen door het mondstuk.
- Na de vorming van een GQ-afdichting tussen het celmembraan en de micropipettip toepassen korte pulsen van zuiging op het membraan scheuren en een hele-cel configuratie bereiken.
- Na instelling van een stabiele whole-cell configuratie met een ingangsweerstand 500 MQ en toegangscode weerstand 10 MQ verkrijgen opnamen in beide spanning- en stroom-clamp modus.
- Toepassen overdruk door zachtjes blazen door de buis aan de elektrodehouder voorafgaand aan het onderdompelen van de micropipet in het bad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben met succes opgenomen van Rohon-Beard neuronen in 17 HPF embryo tot 7 DPF larven (figuur 5A en 5B). Wanneer Rohon-Beard cellen werden opgenomen, werd de bereiding gemonteerd dorsale kant naar boven. Dergelijke bevestiging maakt de ondubbelzinnige identificatie van Rohon-Beard cellen op basis van hun oppervlakkige dorsale positie en grote soma maten. De identificatie wordt bovendien bevestigd door de stereotiepe gehyperpolariseerde rust membraanpotentiaal van deze neuronen (figuur 5, tabel bijvoegsel) 6, 54. Zoals primaire sensorische neuronen, Rohon-Beard neuronen missen synaptische input. Daarom, bij gebrek aan elektrische stimulering, geen veranderingen in membraanpotentiaal optreedt tijdens het opnemen in de huidige-clamp stand (figuur 5B). Sinds de eerste opnames van Rohon-Beard cellen in de zebravis werden uitgevoerd <sup class = "xref"> 6, verschillende transgene lijnen (bijvoorbeeld Tg (islet2b: GFP), Tg (NGN: GFP), en Tg (isletss: GFP)) werden gegenereerd die fluorescente reporters drukken in deze neuronen, verder te vergemakkelijken de identificatie 55, 56, 57.
Figuur 5: Whole-cell spannings- en stroom-clamp opnames van Rohon-Beard neuronen in 1 en 2 dpf embryo's en larven 7 dpf. (A) Voltage-clamp opnames van uiterlijke en innerlijke stromen werden verkregen van Rohon-Beard neuronen in 1- (dunne zwarte lijn), 2- (dikke zwarte lijn) en 7-dpf (grijze lijn) embryo / larven. De vasthoudende potentiaal was -80 mV en stromen werden opgewekt door depolariserende stap tot +20 mV. (B) Single actiepotentialen opgewekt door kort (1 ms) huidigeinjecties (~ 0,35 nA) tot Rohon-Beard neuronen van 1- (dunne zwarte lijn), 2- (dikke zwarte lijn) en 7-dpf (grijze lijn) embryo / larven. (B) In afwezigheid van elektrische stimulatie, geen veranderingen in membraanpotentiaal zoals spontane depolarisaties postsynaptische voordoen in Rohon-Beard neuronen. De inzet tabel worden de waarden van rustende membraanpotentialen opgenomen van Rohon-Beard neuronen van 1- (n = 21) en 2- (n = 9) dpf embryo en 7 (n = 7) dpf larven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Transgene lijnen die duidelijke identificatie van andere spinale neuronen subtypen mogelijk zijn ook beschikbaar. Hiervan mnx1 de transgene lijn Tg (mnx1: GFP) tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) in een subset van spinale motorische neuronen spoedig na hun specificatie (~ 14-16 HPF) <sup class = "xref"> 58, 59. Vanwege de stereotiepe positionering van de primaire motorische neuronen binnen elk hemisegment (figuur 6A), tezamen met de expressie van GFP in de transgene mnx1, is het mogelijk om de verschillende primaire motorische neuron subtypen (Figuur 6B en 6C) te identificeren. Omvattende een fluorescerende kleurstof in de registratie-elektrode oplossing maakt de visualisatie van axonale trajecten aanvullende bevestiging van de motor neuron identity, zoals sommige interneuronen ook GFP tot expressie brengen in de Tg (mnx1: GFP) lijn. Alternatief andere transgene lijn die de identificatie van motorneuronen maakt het ET2 leiding 60.
Figuur 6: Whole-cell voltage en stroom-clamp opnamen van motorische neuronen van 1 dpf zebravis embryos. (A) Een schildert de specifieke morfologische kenmerken van de primaire motorische neuron subtypen in de zebravis ruggenmerg. Primaire motorische neuronen worden aangeduid door de positie van de soma binnen een segment (dat wil zeggen, rostrale [Rgt] mediale [MiP] of caudale [CaP]) 45. Bovendien is elk subtype zich een axon naar de periferie via een afzonderlijk pad. Het gecombineerde gebruik van de Tg (mnx1: GFP) lijn en kleurstof etikettering onthult de stereotiepe axonale spil en de identiteit van de motor neuron subtype tijdens een opname. Met de hier gepresenteerde werkwijzen is het mogelijk om achtereenvolgens opnemen van drie verschillende primaire motorische neuron subtypes binnen dezelfde hemisegment. (B) Voltage-clamp opnames getoond die werden verkregen uit Rgt, MiP en CaP, allemaal in een enkele hemisegment. Een spanningssprong tot +20 mV werd gebruikt om stromen ontlokken een vasthoudende potentiaal van -80 mV. (C) Tijdens dezelfde clamp-recordings van RoP, MiP en CaP, kort (1 ms, -0,4 nA) lopende injecties werden op een actiepotentiaal veroorzaken. De membraanpotentiaal werd gehouden op ~ -65 mV. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Een principieel onderscheid tussen primaire en secundaire motorneuronen is groter somata van de eerder geboren neuronen. Echter, secundaire motor neuron subtypen niet identificeerbaar door soma grootte en positie. Voor opnames van specifieke secundaire motorische neuronen, twee transgene lijnen, Tg (GATA2: GFP) en Tg (islet1: GFP), zijn gebruikt voor het identificeren van secundaire motorneuronen met ventraal en dorsaal projecteren axonen, respectievelijk 55, 61. Echter, een derde secundaire motor neuron subtype aanwezig is bij de zebravis ruggenmerg, met axons dat project dorsaal en ventraal 62. Dienovereenkomstig kunnen kleurstoffen worden gebruikt om secundaire motorische neuronen vullen tijdens opnames aan subtype te identificeren op basis van morfologie (figuur 7A) 8, 9. Vaak in combinatie met voltage-clamp (figuur 7B, sterretjes) of stroom-clamp opnamen (Figuur 7C en 7C, pijlpunten) uit secundaire motorneuronen, spontane of synaptische gebeurtenissen worden.
Figuur 7: Whole-cell voltage en stroom-clamp opnamen van secundaire motorische neuronen van 2 dpf embryo. (A) In de Tg (GATA2: GFP) lijn, twee secundaire motor neuron subtypes uitdrukken GFP 62. In de linker hemisegment, ventrale secundaire motor neuron(Asterisk en pijl wijzen soma en axon, respectievelijk). In het naburige hemisegment, rechts (caudale), is er een ventrale / dorsale secundaire motor neuron (asterisk geeft soma, pijlen de twee axonen, een uitstekend ventraal [onderste pijl] en de andere dorsaal [top pijl]). Deze neuronen werden gelabeld met een rode fluorescerende kleurstof tijdens de opnames. Ventrale / dorsale secundaire motorische neuronen te identificeren, is het essentieel om te waarborgen dat de dissectie geen spieren verwijdert in de aangrenzende caudale hemisegment, waardoor beschadiging of verwijdering van de dorsale axon. Na de opname blijft de neuron soma aan de micropipet zoals wordt weggetrokken uit het preparaat (rechtsboven asterisk). Bij gebruik van kleurstoffen neuronen vullen tijdens opnames, de kleurstof lekt vaak terwijl de elektrode in het bad, waardoor een rode fluorescerende achtergrond zichtbaar in het ruggenmerg en notochord (onderste sterretje rostrale [left] hemisegment < / Em>). (B) Voltage-clamp opnamen werden verkregen van ventrale en ventrale / dorsale secundaire motorneuronen. Spanningsstappen (-30, -10, +10, +30, +50, +70, +90 en +110 mV) veroorzaakte buiten en naar binnen stromen. Geklemde actiepotentialen / depolarisaties kan in de opnamen (sterretjes) zijn. (C) Tijdens dezelfde clamp-opnamen van secundaire motorische neuronen, kort (1 ms) stroom injecties met toenemende amplitude werden op de neuronen een actiepotentiaal (sterretjes) activeren. (C) Voorbeelden van enkelvoudige actiepotentialen in secundaire motorneuronen veroorzaakt door -0,4-nA stroom injecties worden weergegeven. Op dit moment zijn spontane actiepotentialen eveneens waargenomen (C en C', pijlpunten). (D) Langdurige (100 ms) stroom injecties (~ 0,35 nA) leiden tot de herhaalde afgeven van actiepotentialen. De membraanpotentiaal werd gehouden op ~ -65 mV.load / 55507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven werkwijzen maken de elektrische en morfologische karakterisering van sensorische en motorische neuronen van zebravis embryo's na een minimale dissectie van het ruggenmerg. Neuronen gezond blijven gedurende ten minste 1 uur, de tijdslimiet opgelegd aan deze opnames. Neuronen werden opgenomen met de standaard whole-cell configuratie, alsmede uit kernhoudende pleisters; deze methode kunnen space-clamp problemen die een gedetailleerde studie van biofysische ionenstromen 9 kunnen uitsluiten.
Een belangrijke uitdaging om de stevige bevestiging van de embryo of larve de kamer bereiken om de huid te verwijderen en de beperkte dissectie nodig is om toegang tot de neuronen van belang zijnde te voeren. Het preparaat moet ook goed worden vastgezet aan de registratiekamer het whole-cell patch-clamp methodes. Een werkwijze die dit probleem aan door het gebruik van dierenarts hechting lijm op het embryo of larven te bevestigende dissectie / registratiekamer is beschreven, een aanpak die is gebruikt voor de ontleding van andere modelorganismen (bijvoorbeeld Drosophila) 63. Vanuit onze ervaring anderen te trainen, vinden we dat de meest kritische fase te beheersen is de gecontroleerde en precieze levering van kleine hoeveelheden lijm. Hier wordt een lijm afgifte-inrichting waarmee een gebruiker negatieve en positieve druk lijm in te laden of te verdrijven uit de punt van een micropipet toepassen besproken. Met de lijm voorziene hechtdraad, kunnen embryo's en larven stevig zijn bevestigd aan de kamer en georiënteerd hetzij dorsale zijde omhoog of zijwaarts. Op deze manier verschillende toegangsopties voor een verscheidenheid van neuronen zijn beschikbaar. Ook kan de laag siliconenelastomeer op de kamerbodem zelfs dunner dan 1 mm hier vermeld, omdat potentiële optische voordelen zijn. Een andere werkwijze, vaker gebruikt voor de bereiding van een registratiekamer hechten, omvat het gebruik van fijne wolfraam pinnen 1 <sup>, 2, 3, 4, 5. Terwijl dat methoden verschillen, zowel toestaan elektrofysiologische toegang tot zebravis spinale neuronen, en biedt onderzoekers met opties die kunnen worden geselecteerd op basis van de doelstellingen en uitdagingen van het experiment.
De zebravis bereiding beschreven maakt de elektrische en morfologische studie van spinale neuronen in situ tijdens de vroegste stadia van differentiatie. Door het opnemen van spinale neuronen met behulp van deze werkwijzen, hebben we inzicht gekregen in de cellulaire effecten van verschillende mutaties, ook voor de identificatie van de gelaedeerde gen 6, 64, 65.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH (F32 NS059120 naar RLM en R01NS25217 en P30NS048154 te ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88 (1), 1-13 (1999).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Whole cell patch-clamp recordings from identified spinal neurons in the zebrafish embryo. Methods Cell Sci. 25, 59-64 (2003).
- Masino, M. A., Fetcho, J. R. Fictive Swimming Motor Patterns in Wild Type and Mutant Larval Zebrafish. J Neurophysiol. 93 (6), 3177-3188 (2005).
- Wen, H., Brehm, P. Paired motor neuron-muscle recordings in zebrafish test the receptor blockade model for shaping synaptic current. J Neurosci. 25 (35), 8104-8111 (2005).
- Ribera, A. B., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish Touch-Insensitive Mutants Reveal an Essential Role for the Developmental Regulation of Sodium Current. J Neurosci. 18, 9181-9191 (1998).
- Pineda, R. H., Heiser, R. A., Ribera, A. B. Developmental, molecular, and genetic dissection of INa in vivo in embryonic zebrafish sensory neurons. J Neurophysiol. 93, 3582-3593 (2005).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Zebrafish motor neuron subtypes differ electrically prior to axonal outgrowth. J Neurophysiol. 102, 2477-2484 (2009).
- Moreno, R. L., Ribera, A. B. Spinal neurons require Islet1 for subtype-specific differentiation of electrical excitability. Neural Dev. 9 (1), 19 (2014).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Haffter, P., et al. The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio. Development. 123, 1-36 (1996).
- Vogel, G. Genomics: Sanger will sequence zebrafish genome. Science. 290 (5497), 1671 (2000).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev Cell. 21 (1), 48-64 (2011).
- Yates, A., et al. Ensembl. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D710-D716 (2016).
- Kawakami, K. Transgenesis and gene trap methods in zebrafish by using the Tol2 transposable element. Methods Cell Biol. 77, 201-222 (2004).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Huang, P., Xiao, A., Zhou, M., Zhu, Z., Lin, S., Zhang, B. Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs. Nat Biotechnol. 29, 699-700 (2011).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
- Chang, N., et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in zebrafish embryos. Cell Res. 23 (4), 465-472 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Levin, E. D., Cerutti, D. T. Behavioral neuroscience of zebrafish. Methods of behavior analysis in neuroscience. Buccafusco, J. J. , CRC Press. (2009).
- Stewart, A., Gaikwad, S., Kyzar, E., Green, J., Roth, A., Kalueff, A. Modeling anxiety using adult zebrafish: A conceptual review. Neuropharmacology. 62, 135-143 (2012).
- Mushtaq, M. Y., Verpoorte, R., Kim, H. K. Zebrafish as a model for systems biology. Biotechnol Genet Eng Rev. 29 (2), 187-205 (2013).
- Phillips, J. B., Westerfield, M. Zebrafish models in translational research: tipping the scales toward advancements in human health. Dis Model Mech. 7 (7), 739-743 (2014).
- Weis, J. S. Analysis of the development of nervous system of the zebrafish, Brachydanio rerio. I. The normal morphology and development of the spinal cord and ganglia of the zebrafish. J Embryol Exp Morphol. 19 (2), 109-119 (1968).
- Bernhardt, R. R., Chitnis, A. B., Lindamer, L., Kuwada, J. Y. Identification of spinal neurons in the embryonic and larval zebrafish. J Comp Neurol. 302 (3), 603-616 (1990).
- Tsuchida, T., et al. Topographic organization of embryonic motor neurons defined by expression of LIM homeobox genes. Cell. 79 (6), 957-970 (1994).
- Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: Moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
- Fetcho, J. R., McLean, D. L. Some principles of organization of spinal neurons underlying locomotion in zebrafish and their implications. Ann N Y Acad Sci. 1198, 94-104 (2010).
- Del Barrio, M. G., et al. A transcription factor code defines nine sensory interneuron subtypes in the mechanosensory area of the spinal cord. PLoS One. 8 (11), (2013).
- Satou, C., Kimura, Y., Hirata, H., Suster, M. L., Kawakami, K., Higashijima, S. Transgenic tools to characterize neuronal properties of discrete populations of zebrafish neurons. Development. 140 (18), 3927-3931 (2013).
- McLean, D. L., Fan, J., Higashijima, S., Hale, M. E., Fetcho, J. R. A topographic map of recruitment in spinal cord. Nature. 446, 71-75 (2007).
- McLean, D. L., Masino, M. A., Koh, I. Y., Lindquist, W. B., Fetcho, J. R. Continuous shifts in the active set of spinal interneurons during changes in locomotor speed. Nat. Neurosci. 11, 1419-1429 (2008).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Spinal interneurons differentiate sequentially from those driving the fastest swimming movements in larval zebrafish to those driving the slowest ones. J. Neurosci. 29, 13566-13577 (2009).
- Ampatzis, K., Song, J., Ausborn, J., El Manira, A. Separate microcircuit modules of distinct V2a interneurons and motoneurons control the speed of locomotion. Neuron. 83, 934-943 (2014).
- Ljunggren, E. E., Haupt, S., Ausborn, J., Ampatzis, K., El Manira, A. Optogenetic activation of excitatory premotor interneurons is sufficient to generate coordinated locomotor activity in larval zebrafish. J. Neurosci. 34, 134-139 (2014).
- Menelaou, E., VanDunk, C., McLean, D. L. Differences in the morphology of spinal V2a neurons reflect their recruitment order during swimming in larval zebrafish. J Comp Neurol. 522, 1232-1248 (2014).
- Hubbard, J. M., et al. Intraspinal Sensory Neurons Provide Powerful Inhibition to Motor Circuits Ensuring Postural Control during Locomotion. Curr Biol. 26 (21), 2841-2853 (2016).
- Song, J., Ampatzis, K., Björnfors, E. R., El Manira, A. Motor neurons control locomotor circuit function retrogradely via gap junctions. Nature. 529 (7586), 399-402 (2016).
- Lamborghini, J. E. Rohon-beard cells and other large neurons in Xenopus embryos originate during gastrulation. J. Comp. Neurol. 189, 323-333 (1980).
- Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6, 2278-2289 (1986).
- Kimmel, C. B., Westerfield, M. Primary neurons of the zebrafish. Signals and Sense: Local and Global Order in Perceptual Maps. Edelman, G. M., Gall, W. E., Cowan, W. M. , Wiley-Liss. New York. 561-588 (1990).
- Metcalfe, W. K., Myers, P. Z., Trevarrow, B., Bass, M. B., Kimmel, C. B. Primary neurons that express the L2/HNK-1 carbohydrate during early development in the zebrafish. Development. 110 (2), 491-504 (1990).
- Rossi, C. C., Kaji, T., Artinger, K. B. Transcriptional control of Rohon-Beard sensory neuron development at the neural plate border. Dev Dyn. 238, 931-943 (2009).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Progress in Neurobiology. 69 (6), 419-449 (2003).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Dev Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
- Lambert, A. M., Bonkowsky, J. L., Masino, M. A. The conserved dopaminergic diencephalospinal tract mediates vertebrate locomotor development in zebrafish larvae. J Neurosci. 32 (39), 13488-13500 (2012).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. (1995).
- Oesterle, A. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette pullers. , Sutter Instrument. (2015).
- Spitzer, N. C. The ionic basis of the resting potential and a slow depolarizing response in Rohon-Beard neurons of Xenopus tadpoles. J Physiol. 255 (1), 105-135 (1976).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20, 206-218 (2000).
- Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo. Mech Dev. 120, 211-218 (2003).
- Palanca, A. M., et al. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev Neurobiol. 73, 152-167 (2013).
- Flanagan-Street, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132, 4471-4481 (2005).
- Arkhipova, V., Wendik, B., Devos, N., Ek, O., Peers, B., Meyer, D. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365, 290-302 (2012).
- Balciunas, D., Davidson, A. E., Sivasubbu, S., Hermanson, S. B., Welle, Z., Ekker, S. C. Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).
- Meng, A., Tang, H., Ong, B. A., Farrell, M. J., Lin, S. Promoter analysis in living zebrafish embryos identifies a cis-acting motif required for neuronal expression of GATA-2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 6267-6272 (1997).
- Menelaou, E., McLean, D. L. A gradient in endogenous rhythmicity and oscillatory drive matches recruitment order in an axial motor pool. J Neurosci. 32, 10925-10939 (2012).
- Rohrbough, J., Pinto, S., Mihalek, R. M., Tully, T., Broadie, K. latheo, a Drosophila gene involved in learning, regulates functional synaptic plasticity. Neuron. 23 (1), 55-70 (1999).
- McKeown, K. A., Moreno, R., Hall, V. L., Ribera, A. B., Downes, G. B. Disruption of Eaat2b, a glutamate transporter, results in abnormal motor behaviors in developing zebrafish. Dev Biol. 362 (2), 162-171 (2012).
- Carmean, V., et al. pigk mutation underlies macho behavior and affects Rohon-Beard cell excitability. J Neurophysiol. 114 (2), 1146-1157 (2015).
