Fett kroppen är centrala metaboliska organ i insekter. Vi presenterar en levande kultur organsystem som ger användaren möjlighet att studera Svaren isolerade fett vävnad på olika stimuli.
Insekt fett kroppen spelar en central roll i insekt metabolism och näringsämnen lagring, spegling funktioner i lever och fettvävnad hos ryggradsdjur. Insekt fett vävnad är vanligtvis fördelade i insekt kroppen. Det är dock ofta koncentrerade i buken och bifogas kroppen bukväggen.
Mygga fett kroppen är den enda källan till äggula proteiner, som är kritiska för äggproduktion. Därför i vitro kultur mygga fett kroppsvävnader representerar en viktig system för studier av mygga fysiologi, metabolism, och slutligen, äggproduktion. Fett kroppen kultur processen börjar med beredning av lösningar och reagenser, inklusive aminosyra stamlösningar, Aedes fysiologisk koksaltlösning salt stamlösning (APS), kalcium stamlösning och fett kroppen odlingsmedium. Processen fortsätter med fett kroppen dissektion, följt av en experimentell behandling. Efter behandling, kan en mängd olika analyser utföras, inklusive RNA sekvensering (RNA-Seq), qPCR, Western blotting, proteomik och metabolomik.
I vårt exempel experiment visar vi protokollet genom excision och kultur av fett organ från den gula feber Myggan, Aedes aegypti, en rektor vektor av arboviruses bland annat denguefeber och chikungunya Zika. RNA från fett organ odlade under ett fysiologiskt tillstånd känt att upregulate äggula proteiner kontra kontroll var föremål för RNA-Seq analys att demonstrera den potentiella nyttan av detta förfarande för utredningar av genuttryck.
Myggor är vektorer av förödande mänskliga sjukdomar, inklusive malaria, denguefeber, chikungunya och Zika1,2,3. Trots intensiva internationella ansträngningar att stävja dessa sjukdomar och att kontrollera sjukdom-sändning mygga populationer, är epidemiska utbrott moskitburen sjukdomar fortfarande vanligt, särskilt i utvecklingsländerna. Effektiva vacciner mot många av dessa sjukdomar är antingen inte tillgänglig eller begränsad effekt4,5. Det mest effektiva sättet att förhindra utbrott är att styra mygga populationer, främst genom användning av insektsmedel behandlingar. Insektsmedel motstånd har dock utvecklats i många mygga populationer och blivit ett vanligt problem runt den värld6,7,8. Studien av mygga fysiologi är avgörande för utvecklingen av nya verktyg och strategier för att bekämpa sjukdomar.
Mygga fett kroppen spelar en central roll i näringsämnen lagring, metabolisk homeostas, reproduktion och xenobiotiska katabolism9,10,11,12. Det är den huvudsaklig lagring orgeln för triglycerider, glykogen och aminosyror i form av lagring proteiner. Det fungerar också som plats för syntes för de flesta hemolymph proteiner och metaboliter. I myggor är fett kroppen den enda källan till äggula proteinproduktion som förekommer hos kvinnor efter de ta en blodmjöl13,14.
Den huvudsakliga celltypen av fett kroppen är stor, polyploida trophocyte eller fettceller3,9,10,12. Fett vävnad är uppdelad i loberna eller slidor och kan hittas i alla delar av kroppen av mygga, med den största delen ligger i buken, där stora loberna i fett kroppen bifogas kroppen bukväggen.
Mygga fett kroppen kultur systemet presenteras här utvecklades i ‘ 70-talet och är fortfarande ett kraftfullt verktyg för att studera fett kroppen fysiologi10, särskilt i kombination med nuvarande teknik för analys. Grunden för denna teknik är baserad på isoleringen av buken kropp väggarna och den associerade fett vävnaden. Den hydrofoba karaktären av buken nagelband orsakar det att flyta på ytan av odlingssubstratet, med bifogade loberna av buk fett kroppen nedsänkt. De externa och tracheolar struktur upprätthålls, att säkerställa syresättning av odlade vävnad. Hädanefter hänvisar vi till dessa preparat som ”fett organ”. Isolerade fett organ förblir lönsamt för mer än 12 h när inkuberas i lämpligt medium (opublicerade resultat). Fett kroppen kultur är ett värdefullt verktyg som har tagit upp en mängd frågor om fett kroppen endokrinologi och fysiologi9,10,12,15,16, 17.
Odlade fett organ kan utsättas för olika experimentella och styra behandlingar, tidpunkten för som kan beslutas av prövaren. I slutet av inkubationstiden, kan fett organ samlas in och bearbetas för nedströms analyser, inklusive qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomik21eller metabolomik22. Experiment kan utföras på olika skalor, från enskilda fat organ till grupper av hundratals som kan vara odlade tillsammans.
De representativa resultat ingår här härleddes från fett organ odlade i närvaro av aminosyror och den steroid hormon 20-hydroxy ecdysone att simulera blodmjöl aktiveringen vitellogenesis16,17, 23,24. Vi analyserade och jämförde differentiell genuttrycket av inte-aktiverat kontra aktiverade fett organ via nästa generations sekvensering analys.
Insekt orgelkultur användes flitigt studera insekt endokrinologi, utveckling och ämnesomsättningen, samt för att undersöka samspelet mellan specifika organ och bakteriell symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fett kroppen orgelkultur användes specifikt för att studera aminosyra transport och reglering av äggula proteinproduktionen i myggor och andra Diptera16,17,35 , 36. under processen för vitellogenesis, mygga fett kroppen använder en matris av hög-specificitet aminosyra transportörer för att importera blodmjöl framställda aminosyror från hemolymph att syntetisera stora mängder äggula proteiner12 ,19,35,36. Fett kroppen kulturen var avgörande för avgränsningen av fett kroppen näringsbehov i detta sammanhang18.
Kvaliteten på utgångsmaterialet, kvinnliga myggor, är avgörande för framgången för dessa experiment. Mygglarver upp i under-trångt villkor och utfodras på hög näringsämnen Dieter vanligtvis ger bästa resultat. Det finns några viktiga variabler att överväga vid fastställandet av mygga fett kroppen odlingsbetingelser i laboratoriet experimental designmässigt. Vi visade i tidigare studier som fett kroppen genuttrycket varierar betydligt beroende på individuell livshistoria och näringsstatus av mygga11,22. Mygga kultur villkoren bör vara enhetliga för att minska variationen i storlek och näringsmässiga reserver av experimentella myggor. Dessutom bör personal som utför dissektionerna utbildas för att säkerställa snabb och noggrann dissektioner med konsekventa resultat. Cellernas viabilitet i isolerade fett organ kan kontrolleras med hjälp av olika färgning metoder37,38.
Experimentell design av ett fett kroppen kultur experiment bör beakta antalet dissektioner möjligt under en viss tidsperiod. När stora mängder fett organ krävs behövas flera dissektion sessioner eller flera analysera. Det finns ett brett utbud av framtida ansökningar om in vitro- fett kroppen kultur i myggor och andra insekter. Det kommer att vara särskilt användbart för att testa potentiella läkemedelskandidater för insektskontroll. Användningen av transgena tekniker i insekter att uttrycka särskilda reporter proteiner i fett kroppen trophocytes kommer att öppna upp nya metoder för att utveckla kraftfulla bioassays för studien av fett kroppen fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöds av NIH grant #SC1AI109055, de 2014 NMSU HHMI grant #52008103 och NSF PGR bevilja #1238731. Vi tackar deltagarna för NMSU våren 2015 BIOL302 molekylära metoder klassen och Lavesh Bhatia för deras tekniska support med fett kroppen kultur experimenten.
Scissors | Fiskars | 83872 | |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | Hausherrs Machine Works, Inc. | 3740-01-210-2368 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500085 | |
Light microscope | Leica Microsystems | ||
96 well plate | Sigma | CL S3383 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Alanine | Sigma | A7627 | |
Arginine | Sigma | A5006 | |
Asparagine | Sigma | A0884 | |
Aspartic Acid | Sigma | A9256 | |
Cysteine | Sigma | W326305 | |
Glutamic Acid | Sigma | G1251 | |
Glutamine | Sigma | G3126 | |
Glycine | Sigma | G2879 | |
Histidine | Sigma | H6034 | |
Isoleucine | Sigma | I2752 | |
Lysine | Sigma | L5501 | |
Leucine | Sigma | L8000 | |
Phenylalanine | Sigma | P2126 | |
Proline | Sigma | P0380 | |
Serine | Sigma | S4500 | |
Threonine | Sigma | T8625 | |
Tryptophan | Sigma | T0254 | |
Tyrosine | Sigma | T3754 | |
Valine | Sigma | V0500 | |
Methionine | Sigma | M9625 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
MgCl2-6H2O | Sigma | M2670 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
CaCl2-2H2O | Sigma | C8106 | |
Tris pH8.0 | Sigma | T1503 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
ddH2O | Sigma | W4502 |