Fedt kroppen er det centrale metaboliske orgel i insekter. Vi præsenterer et levende orgel kultur system, der gør det muligt for brugeren at studere isolerede fedt kropsvæv reaktioner på forskellige stimuli.
Insekt fedt kroppen spiller en central rolle i insekt metabolisme og næringsstof opbevaring, spejling funktion af leveren og fedtvæv i hvirveldyr. Insekt fedt kropsvæv er normalt fordelt i hele insekt kroppen. Det er dog ofte koncentreret i maven og fastgjort til kroppen bugvæggen.
Myg fedt kroppen er den eneste kilde til æggeblomme proteiner, som er kritiske for ægproduktion. Derfor, i vitro kultur af myg fedt kropsvæv repræsenterer et vigtigt system til studiet af myg fysiologi, stofskifte, og i sidste ende ægproduktionen. Fedt krop kultur proces begynder med udarbejdelsen af løsninger og reagenser, herunder aminosyre stamopløsninger, Aedes fysiologisk kogsaltopløsning salt stamopløsning (APS), calcium stamopløsning og fedt kroppen næringssubstratet. Processen fortsætter med fedt kroppen dissektion, efterfulgt af en eksperimentel behandling. Efter behandling, kan en række forskellige analyser udføres, herunder RNA sekventering (RNA-FF.), qPCR, Western blotting, proteomics og metabolomics.
I vores eksempel eksperiment vise vi protokollen gennem excision og kultur af fedt organer fra gul feber myg, Aedes aegypti, en vigtigste vektor af arboviruses herunder dengue, chikungunya og Zika. RNA fra fedt organer kulturperler under en fysiologisk tilstand kendt at upregulate æggeblomme proteiner versus kontrol blev udsat for at demonstrere den potentielle nytte af denne procedure for undersøgelser af genekspression RNA-Seq analyse.
Myg er vektorer af ødelæggende sygdomme hos mennesker, herunder malaria, dengue feber, chikungunya og Zika1,2,3. Trods intens internationale bestræbelser på at dæmme op for disse sygdomme og til at kontrollere overførsel af sygdom mosquito befolkninger, er epidemisk udbrud af myg-bårne sygdomme stadig almindelige, især i udviklingslandene. Effektive vacciner mod mange af disse sygdomme er enten ikke tilgængelige eller begrænsede effektivitet4,5. Den mest effektive måde at forebygge udbrud er at kontrollere mosquito befolkninger, primært gennem brug af insekticidbehandling. Insekticidresistens har dog udviklet sig i mange mosquito befolkninger og blive et fælles problem omkring verden6,7,8. Studiet af myg fysiologi er afgørende for udviklingen af nye redskaber og strategier til at kontrollere sygdommen.
Myg fedt kroppen spiller en central rolle i næringsstof opbevaring, metabolisk homøostase, reproduktion og xenobiotiske katabolisme9,10,11,12. Det er den vigtigste opbevaring organ for triglycerider, glykogen og aminosyrer i form af oplagring proteiner. Det fungerer også som placeringen af syntese for de fleste hemolymph proteiner og metabolitter. I myg er fedt kroppen den eneste kilde til æggeblomme protein produktion, der opstår i hunner, når de tager en blodmel13,14.
Den vigtigste celletype fedt kroppen er store, polyploide trophocyte eller adipocyt3,9,10,12. Fedt kropsvæv er organiseret i lapper eller skeder og kan findes i alle dele af kroppen af myg, med den største del ligger i maven, hvor store kamre af fedt kroppen er fastgjort til kroppen bugvæggen.
Myg fedt kroppen kultur system præsenteres her blev udviklet i 70 ‘ erne og er stadig et stærkt værktøj til at studere fedt kroppens fysiologi10, især i kombination med aktuelle analyse teknologi. Grundlaget for denne teknik er baseret på dyrkning af abdominal organ væggene og de tilknyttede fedt kropsvæv. Den hydrofobe karakter af abdominal neglebånd får det til at flyde på overfladen af næringssubstratet, med vedlagte lapper af abdominal fedt kroppen nedsænket. Spirakler og tracheolar struktur er vedligeholdt, sikrer iltning af kulturperler væv. Fremover, vil vi henvise til disse præparater som “fedt organer.” Isolerede fedt organer forbliver levedygtige i mere end 12 timer når inkuberes i den passende medium (ikke-offentliggjorte resultater). Fedt krop kultur er et værdifuldt redskab, der har behandlet en række spørgsmål vedrørende fedt kroppen endokrinologi og fysiologi9,10,12,15,16, 17.
Kulturperler fedt organer kan blive udsat for forskellige eksperimentelle og styre behandlinger, timing som kan besluttes af investigator. I slutningen af inkubationstiden, kan fedt organer indsamles og behandles til downstream analyser, herunder qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomics21eller metabolomics22. Eksperimenter kan udføres på forskellige skalaer, fra individuelle fedt organer til grupper af hundredvis, der kan dyrkes sammen.
De repræsentative resultater inkluderet her var afledt af fedt organer kulturperler aminosyrer og steroid hormon 20-hydroxy ecdysone at simulere blodmel aktivering af vitellogenesen16,17, 23,24. Vi analyseret og sammenlignet den differentiale genekspression af ikke-aktiveret versus aktiveret fedt organer via næste generation sequencing analyse.
Insekt orgel kultur blev brugt i udstrakt grad at studere insekt Endokrinologi, udvikling og metabolisme samt undersøge samspillet mellem specifikke organer og bakteriel symbionter29,30,31, 32,33,34. In vitro fedt kroppen orgel kultur var bruges specifikt til at studere aminosyre transport og regulering af æggeblomme protein produktion i myg og andre Diptera16,17,35 , 36. i løbet af processen af vitellogenesen, myg fedt kroppen bruger en bred vifte af high-specificitet aminosyre transportvirksomheder til at importere blodmel-afledte aminosyrer fra hemolymph til at syntetisere store mængder af æggeblomme proteiner12 ,19,35,36. Fedt krop kultur var medvirkende til afgrænsningen af fedt kroppen ernæringsmæssige krav i denne forbindelse18.
Kvalitet af råvaren, kvindelige myg, er afgørende for en vellykket gennemførelse af disse forsøg. Myg larver rejst i henhold til overfyldt forhold og fodres på high-næringsstof kost normalt giver de bedste resultater. Der er nogle vigtige variabler at overveje, når oprettelse af myg fedt krop kultur betingelser i laboratoriet for eksperimentel design. Vi viste i tidligere undersøgelser, at fedt kroppen genekspression varierer betydeligt afhængigt af de individuelle livshistorie og ernæringsmæssige status af myg11,22. Myg kultur betingelser bør være ensartet at reducere variation i størrelse og ernæringsmæssige reserver af eksperimentelle myg. Derudover bør personale udfører dissektioner være uddannet til at sikre hurtig og præcis dissektioner med ensartede resultater. Cellernes levedygtighed i isolerede fedt organer kan kontrolleres ved hjælp af forskellige farvning metoder37,38.
Den eksperimentelle design af et fedt krop kultur eksperiment bør tages højde antallet af dissektioner muligt i en given periode. Når store mængder af fedt organer er påkrævet, kan flere dissektion sessioner eller flere dissectors være nødvendigt. Der er en bred vifte af fremtidige ansøgninger om in vitro- fedt krop kultur i myg og andre insekter. Det bliver især nyttig ved afprøvning af potentielle lægemiddelkandidater til insekt kontrol. Brugen af transgene teknikker i insekter til at udtrykke særlige reporter proteiner i fedt kroppen trophocytes vil åbne nye metoder til at udvikle kraftfulde bioassays for studiet af fedt kroppens fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af NIH grant #SC1AI109055, 2014 NMSU HHMI grant #52008103 og NSF PGR yde #1238731. Vi takke deltagerne i NMSU forår 2015 BIOL302 Molekylær metoder klasse og Lavesh Bhatia for deres tekniske support med fedt krop kultur eksperimenter.
Scissors | Fiskars | 83872 | |
Fly pad | Genesee Scientific | 789060 | |
Battery-powered aspirator w/ collection vial | Hausherrs Machine Works, Inc. | 3740-01-210-2368 | |
Fine tip forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500085 | |
Light microscope | Leica Microsystems | ||
96 well plate | Sigma | CL S3383 | |
Sucrose | Sigma | S9378 | |
Alanine | Sigma | A7627 | |
Arginine | Sigma | A5006 | |
Asparagine | Sigma | A0884 | |
Aspartic Acid | Sigma | A9256 | |
Cysteine | Sigma | W326305 | |
Glutamic Acid | Sigma | G1251 | |
Glutamine | Sigma | G3126 | |
Glycine | Sigma | G2879 | |
Histidine | Sigma | H6034 | |
Isoleucine | Sigma | I2752 | |
Lysine | Sigma | L5501 | |
Leucine | Sigma | L8000 | |
Phenylalanine | Sigma | P2126 | |
Proline | Sigma | P0380 | |
Serine | Sigma | S4500 | |
Threonine | Sigma | T8625 | |
Tryptophan | Sigma | T0254 | |
Tyrosine | Sigma | T3754 | |
Valine | Sigma | V0500 | |
Methionine | Sigma | M9625 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
MgCl2-6H2O | Sigma | M2670 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
CaCl2-2H2O | Sigma | C8106 | |
Tris pH8.0 | Sigma | T1503 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
ddH2O | Sigma | W4502 |