Summary

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Published: August 12, 2017
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

Abstract

A principal preocupação no transplante é alcançar tolerância específica através da indução de células reguladoras. A compreensão dos mecanismos de tolerância requer modelos confiáveis. Aqui, descrevemos modelos de tolerância ao enxerto cardíaco em ratos, induzido pelo bloqueio dos sinais costimulation ou upregulation das moléculas imunorreguladores, através da transferência de genes. Cada um desses modelos permitidos na vivo a geração de células reguladoras, tais como pilhas de T reguladoras (Tregs), células B regulamentares (Bregs) ou células mieloides regulamentares (RegMCs). Este manuscrito, descrevemos dois protocolos complementares que foram usados para identificar e definir a atividade das células reguladoras in vitro e in vivo para determinar a sua responsabilidade na indução de tolerância e manutenção. Primeiro, um ensaio supressiva em vitro permitiu a rápida identificação de células com capacidade supressiva sobre efetoras imune respostas de forma dose-dependente e pode ser usado para uma análise mais aprofundada como medição de citocinas ou citotoxicidade. Em segundo lugar, a transferência adotiva de células de um destinatário Tratado tolerante para um destinatário transplantado recentemente irradiado, destaque as propriedades de tolerogenic dessas células em respostas imunes de enxerto dirigido de controlo e/ou convertendo novas células reguladoras ( denominado tolerância infecciosa). Esses métodos não são restritos às células com marcadores fenotípicos conhecidos e podem ser estendidos para qualquer população celular. Além disso, o doador dirigido allospecificity de células reguladoras (uma meta importante no campo) podem ser avaliados usando células de doador de terceiros ou do enxerto em vitro ou na vivo. Finalmente, para determinar a capacidade de tolerogenic específicos destas células reguladoras, nós fornecemos protocolos para avaliar as respostas humoral anticorpo antidoador e a capacidade do destinatário para desenvolver respostas humorais contra antígenos conhecidos novos ou antigos. Os modelos de tolerância descrito podem ser usados para caracterizar mais células reguladoras, para identificar novos biomarcadores e imunorreguladores moléculas e são adaptáveis a outros modelos de transplante ou doenças auto-imunes em roedores ou humanos.

Introduction

Aloenxerto cardíaco em ratos é um modelo de transplante de órgão confiável para avaliar tratamentos de indução de tolerância, para decifrar os mecanismos de indução de tolerância e de manutenção e tem o potencial para induzir as células reguladoras funcionalmente competentes e dominantes. Os protocolos abaixo descrevem um totalmente incompatibilidade heterotópica cardíaca enxerto de um rato de doador de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) em um rato de destinatário Lewis 1A (LEW.1A, RT1um). Nesta combinação de enxerto, rejeição aguda ocorre rapidamente (em cerca de 7 dias) e pode ser facilmente avaliada pelo enxerto batendo medição através de palpação do abdômen. Aqui propomos três protocolos para induzir a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos. Nestes modelos, tolerância é induzida e/ou mantida por tipos de diferentes células reguladoras. Primeiro, o bloqueio de CD40-CD40L interações com um adenovírus codificação CD40Ig (AdCD40Ig) induziu a geração de CD8+ Tregs capazes de induzir tolerância quando enviaram transferidos para destinatários secundários enxertados1. Além disso, a depleção de CD8 em destinatários AdCD40Ig-Tratado gerados Bregs e RegMCs2,+ células (com anticorpos anti-CD8α). Análise profunda de CD8+ Tregs Propriedades destacou o papel fundamental de várias moléculas de imunorreguladores definido como interleucina-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando que a superexpressão de IL-34 (com um vetor de vírus adeno-associados) induzida por Tregs através de geração de RegMCs, superexpressão da FGL-2 induzida Bregs, subjacentes a complexa rede de células reguladoras.

Rejeição crônica se desenvolve lentamente e é a longo prazo, uma análise aprofundada é necessário para distinguir tolerância contra rejeição crônica. Enxerto é geralmente avaliado por infiltração celular, fibrose, espessamento da deposição de C4d vascular da parede e complemento por immunohistology7. Enquanto histologia métodos requerem o sacrifício de animais ou biópsia do enxerto, aqui nós descrevemos um método simples para avaliar diferentes características do aloenxerto tolerada: o surgimento e a função das células reguladoras e as respostas de anticorpos específicos antidoador de sangue amostra por citometria de fluxo (aqui, nós usamos a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação).

Manutenção da tolerância para o enxerto após a detenção do tratamento é geralmente associada com a indução de células reguladoras8. Nas últimas décadas, os estudos enfocaram CD4+Tregs caracteriza-se por unanimidade-los por marcadores de chave Foxp3+, CD25altae CD1279,10,11. Da mesma forma, vários marcadores foram atribuídos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28, CD45RCbaixo, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre os anos, a expressão de GITR, CTLA4 e citocinas (IL-10, 34-TGFβ, IL, IL-35, FGL-2) foram adicionalmente associados a um Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. No entanto, populações de células reguladoras emergentes, tais como Bregs, RegMCs ou NKTregs, faltam de marcadores específicos relevantes. Com efeito, Bregs principalmente são relatados como imaturo CD24+ células, com expressão de CD27 ambígua e, por vezes, produção de IL-10, TGFβ ou granzime B22,23,24. A complexidade da linhagem mieloide célula requer uma combinação de vários marcadores para definir seu perfil de regulamentar ou proinflammatory como CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Finalmente, alguns marcadores têm sido relatados para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, mas mais estudos são necessários para fenotipicamente eles descrever27,28,29 ,30,31,32. Assim, evidências de atividade supressiva são necessários para legitimar ainda mais descrição fenotípica para a identificação de novos biomarcadores, novos mediadores imunorreguladores e alargar o âmbito de aplicação de novas terapias celulares.

Propomos dois métodos complementares para avaliar a atividade supressora de células. Primeiro, o método em vitro consiste de células supressivas com células efetoras rotulada T estimuladas pelo doador alogênico células apresentadoras (APCs) em diferentes proporções ao longo de 6 dias de cultivo, e analisando o efetor proliferação de células T que reflete a imunossupressão doador-dirigido. Células de ratos tratadas podem ser comparadas diretamente às células de ingênuo ratos e ratos enxertados não tratados para atividade supressora (ou para qualquer outra população de celular regulamentar), em uma variação da proporção de supressor: effector. Além disso, este método não requer qualquer transplante, e os resultados são obtidos dentro de 6 dias. Em segundo lugar, o método na vivo consiste em transferir as células reguladoras pretendidas de um rato Tratado para um destinatário transplantado recentemente irradiado. Enquanto as células B, células mieloides ou T células de ratos não tratados ingênua são geralmente incapazes para inibir a rejeição aguda e para prolongar a sobrevivência do enxerto após transferência adotiva, células com atividade supressora potentiated de destinatários tratados têm esses atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia induzida pela irradiação do destinatário é recomendada para permitir que as células enviaram transferidas para ser afectada pela homeostase do sangue e dominar mais facilmente as respostas imunes do anti doadores. Para ambos os métodos, a utilização em vitro de alogênico de terceiros APCs ou na vivo transferência adotiva de supressiva células em destinatários enxertados com um coração de terceiros permitem análise da especificidade antidoador. Considerando que o método na vivo requer um número substancial de células, mal representado subpopulações de células podem ser mais facilmente avaliadas para atividade supressiva em vitro33.

Respostas humorais também podem ser medidas para avaliar o estado de tolerância e o controle de respostas de anticorpos direcionados aos antígenos do doador. Com efeito, a tolerância pode ser caracterizada por ausência de resposta humoral em direção o doador mas a conservação da capacidade para os destinatários desenvolver a resposta humoral a antígenos novos e preservação da memória respostas. Em primeiro lugar, o princípio da deteção de Alo-anticorpo baseia-se no reconhecimento de células do doador por destinatários anticorpos após incubação do tipo de célula do doador com soro de um destinatário enxertado. Respostas humorais, segunda dirigidas aos antígenos exógenos podem ser avaliada seguir estimulação de destinatários tolerantes a longo prazo com Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionado com adjutor de Freund completo. A presença de anticorpos IgM e IgG específicos contra antígenos pode ser detectada dias 4 e 13, respectivamente, após a imunização, com o ensaio de imunoabsorção ligado enzima (ELISA)34. Em terceiro lugar, a preservação da memória imune respostas pode ser avaliada pela injeção de xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) em dias -7 e + 3 de transplante e hemácias coloração com destinatário soro coletado em dias + 8 e + 17 após o transplante. Todos estes métodos permitem a identificação de subtipos de imunoglobulinas usando anticorpos específicos do secundários e aquisição rápida dos resultados em menos de 1,5 h por FACS coloração ou algumas horas por ELISA.

Finalmente, esses protocolos são projetados para a caracterização de modelos de transplante e podem ser, em certa medida, aplicada aos modelos de doença auto-imune. Os princípios do método podem ser transpostos para todas as espécies.

Protocol

Nota: Todos os protocolos aqui tenham sido aprovados por um Comitê de ético e devem ser realizados de forma estéril. 1. geração de tolerância em um modelo de aloenxerto cardíaco em ratos Lew.1W para procedimento de aloenxerto LEW.1A Anestesiar um macho dador LEW.1W rato utilizando isoflurano-O2 inalação, suplementada com 1% N2O após 5 min. lugar o animal em decúbito dorsal e desinfectar o abdômen com betadine para realizar…

Representative Results

A avaliação da atividade supressora seguindo a classificação da APCs (Figura 1), células do Respondente e Tregs simultaneamente (Figura 2), ou individualmente (Figura 4), e qualquer outras putativos regulamentar as células (Figura 3), pode ser feito na vivo por injecção directa das células reguladoras e em vitro por medida do brilho CFSE (<stro…

Discussion

Transferência adotiva de splenocytes total para um destinatário recentemente transplantada é uma maneira eficiente para detectar a presença de células reguladoras induzido ou potencializadas por um tratamento. Linfopenia transitória induzida por irradiação de anfitrião promove a sobrevivência da pilha após a transferência e o estabelecimento da tolerância. Além disso, a irradiação sub-letais deixa tempo para células com propriedades tolerogenic para converter para novas células reguladoras durante recon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi realizado no contexto do projeto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que é parte do programa de governo francês “Investissements d’Avenir” gerenciado pela ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e pelo projeto IHU-Cesti financiado também pelo ” Programa de governo francês investissements d’Avenir”, gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.

Materials

animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCR Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, &. #. 2. 0. 1. ;., Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft–but not blood transfusion alone–induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

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Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

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