In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.
Abstract
A principal preocupação no transplante é alcançar tolerância específica através da indução de células reguladoras. A compreensão dos mecanismos de tolerância requer modelos confiáveis. Aqui, descrevemos modelos de tolerância ao enxerto cardíaco em ratos, induzido pelo bloqueio dos sinais costimulation ou upregulation das moléculas imunorreguladores, através da transferência de genes. Cada um desses modelos permitidos na vivo a geração de células reguladoras, tais como pilhas de T reguladoras (Tregs), células B regulamentares (Bregs) ou células mieloides regulamentares (RegMCs). Este manuscrito, descrevemos dois protocolos complementares que foram usados para identificar e definir a atividade das células reguladoras in vitro e in vivo para determinar a sua responsabilidade na indução de tolerância e manutenção. Primeiro, um ensaio supressiva em vitro permitiu a rápida identificação de células com capacidade supressiva sobre efetoras imune respostas de forma dose-dependente e pode ser usado para uma análise mais aprofundada como medição de citocinas ou citotoxicidade. Em segundo lugar, a transferência adotiva de células de um destinatário Tratado tolerante para um destinatário transplantado recentemente irradiado, destaque as propriedades de tolerogenic dessas células em respostas imunes de enxerto dirigido de controlo e/ou convertendo novas células reguladoras ( denominado tolerância infecciosa). Esses métodos não são restritos às células com marcadores fenotípicos conhecidos e podem ser estendidos para qualquer população celular. Além disso, o doador dirigido allospecificity de células reguladoras (uma meta importante no campo) podem ser avaliados usando células de doador de terceiros ou do enxerto em vitro ou na vivo. Finalmente, para determinar a capacidade de tolerogenic específicos destas células reguladoras, nós fornecemos protocolos para avaliar as respostas humoral anticorpo antidoador e a capacidade do destinatário para desenvolver respostas humorais contra antígenos conhecidos novos ou antigos. Os modelos de tolerância descrito podem ser usados para caracterizar mais células reguladoras, para identificar novos biomarcadores e imunorreguladores moléculas e são adaptáveis a outros modelos de transplante ou doenças auto-imunes em roedores ou humanos.
Introduction
Aloenxerto cardíaco em ratos é um modelo de transplante de órgão confiável para avaliar tratamentos de indução de tolerância, para decifrar os mecanismos de indução de tolerância e de manutenção e tem o potencial para induzir as células reguladoras funcionalmente competentes e dominantes. Os protocolos abaixo descrevem um totalmente incompatibilidade heterotópica cardíaca enxerto de um rato de doador de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) em um rato de destinatário Lewis 1A (LEW.1A, RT1um). Nesta combinação de enxerto, rejeição aguda ocorre rapidamente (em cerca de 7 dias) e pode ser facilmente avaliada pelo enxerto batendo medição através de palpação do abdômen. Aqui propomos três protocolos para induzir a tolerância para o aloenxerto cardíaca em ratos. Nestes modelos, tolerância é induzida e/ou mantida por tipos de diferentes células reguladoras. Primeiro, o bloqueio de CD40-CD40L interações com um adenovírus codificação CD40Ig (AdCD40Ig) induziu a geração de CD8+ Tregs capazes de induzir tolerância quando enviaram transferidos para destinatários secundários enxertados1. Além disso, a depleção de CD8 em destinatários AdCD40Ig-Tratado gerados Bregs e RegMCs2,+ células (com anticorpos anti-CD8α). Análise profunda de CD8+ Tregs Propriedades destacou o papel fundamental de várias moléculas de imunorreguladores definido como interleucina-34 (IL-34) e Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Considerando que a superexpressão de IL-34 (com um vetor de vírus adeno-associados) induzida por Tregs através de geração de RegMCs, superexpressão da FGL-2 induzida Bregs, subjacentes a complexa rede de células reguladoras.
Rejeição crônica se desenvolve lentamente e é a longo prazo, uma análise aprofundada é necessário para distinguir tolerância contra rejeição crônica. Enxerto é geralmente avaliado por infiltração celular, fibrose, espessamento da deposição de C4d vascular da parede e complemento por immunohistology7. Enquanto histologia métodos requerem o sacrifício de animais ou biópsia do enxerto, aqui nós descrevemos um método simples para avaliar diferentes características do aloenxerto tolerada: o surgimento e a função das células reguladoras e as respostas de anticorpos específicos antidoador de sangue amostra por citometria de fluxo (aqui, nós usamos a fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação).
Manutenção da tolerância para o enxerto após a detenção do tratamento é geralmente associada com a indução de células reguladoras8. Nas últimas décadas, os estudos enfocaram CD4+Tregs caracteriza-se por unanimidade-los por marcadores de chave Foxp3+, CD25altae CD127–9,10,11. Da mesma forma, vários marcadores foram atribuídos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28–, CD45RCbaixo, PD1+e Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre os anos, a expressão de GITR, CTLA4 e citocinas (IL-10, 34-TGFβ, IL, IL-35, FGL-2) foram adicionalmente associados a um Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. No entanto, populações de células reguladoras emergentes, tais como Bregs, RegMCs ou NKTregs, faltam de marcadores específicos relevantes. Com efeito, Bregs principalmente são relatados como imaturo CD24+ células, com expressão de CD27 ambígua e, por vezes, produção de IL-10, TGFβ ou granzime B22,23,24. A complexidade da linhagem mieloide célula requer uma combinação de vários marcadores para definir seu perfil de regulamentar ou proinflammatory como CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a ou CD16325,26. Finalmente, alguns marcadores têm sido relatados para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, mas mais estudos são necessários para fenotipicamente eles descrever27,28,29 ,30,31,32. Assim, evidências de atividade supressiva são necessários para legitimar ainda mais descrição fenotípica para a identificação de novos biomarcadores, novos mediadores imunorreguladores e alargar o âmbito de aplicação de novas terapias celulares.
Propomos dois métodos complementares para avaliar a atividade supressora de células. Primeiro, o método em vitro consiste de células supressivas com células efetoras rotulada T estimuladas pelo doador alogênico células apresentadoras (APCs) em diferentes proporções ao longo de 6 dias de cultivo, e analisando o efetor proliferação de células T que reflete a imunossupressão doador-dirigido. Células de ratos tratadas podem ser comparadas diretamente às células de ingênuo ratos e ratos enxertados não tratados para atividade supressora (ou para qualquer outra população de celular regulamentar), em uma variação da proporção de supressor: effector. Além disso, este método não requer qualquer transplante, e os resultados são obtidos dentro de 6 dias. Em segundo lugar, o método na vivo consiste em transferir as células reguladoras pretendidas de um rato Tratado para um destinatário transplantado recentemente irradiado. Enquanto as células B, células mieloides ou T células de ratos não tratados ingênua são geralmente incapazes para inibir a rejeição aguda e para prolongar a sobrevivência do enxerto após transferência adotiva, células com atividade supressora potentiated de destinatários tratados têm esses atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia induzida pela irradiação do destinatário é recomendada para permitir que as células enviaram transferidas para ser afectada pela homeostase do sangue e dominar mais facilmente as respostas imunes do anti doadores. Para ambos os métodos, a utilização em vitro de alogênico de terceiros APCs ou na vivo transferência adotiva de supressiva células em destinatários enxertados com um coração de terceiros permitem análise da especificidade antidoador. Considerando que o método na vivo requer um número substancial de células, mal representado subpopulações de células podem ser mais facilmente avaliadas para atividade supressiva em vitro33.
Respostas humorais também podem ser medidas para avaliar o estado de tolerância e o controle de respostas de anticorpos direcionados aos antígenos do doador. Com efeito, a tolerância pode ser caracterizada por ausência de resposta humoral em direção o doador mas a conservação da capacidade para os destinatários desenvolver a resposta humoral a antígenos novos e preservação da memória respostas. Em primeiro lugar, o princípio da deteção de Alo-anticorpo baseia-se no reconhecimento de células do doador por destinatários anticorpos após incubação do tipo de célula do doador com soro de um destinatário enxertado. Respostas humorais, segunda dirigidas aos antígenos exógenos podem ser avaliada seguir estimulação de destinatários tolerantes a longo prazo com Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulsionado com adjutor de Freund completo. A presença de anticorpos IgM e IgG específicos contra antígenos pode ser detectada dias 4 e 13, respectivamente, após a imunização, com o ensaio de imunoabsorção ligado enzima (ELISA)34. Em terceiro lugar, a preservação da memória imune respostas pode ser avaliada pela injeção de xenogénicas células vermelhas do sangue (hemácias) em dias -7 e + 3 de transplante e hemácias coloração com destinatário soro coletado em dias + 8 e + 17 após o transplante. Todos estes métodos permitem a identificação de subtipos de imunoglobulinas usando anticorpos específicos do secundários e aquisição rápida dos resultados em menos de 1,5 h por FACS coloração ou algumas horas por ELISA.
Finalmente, esses protocolos são projetados para a caracterização de modelos de transplante e podem ser, em certa medida, aplicada aos modelos de doença auto-imune. Os princípios do método podem ser transpostos para todas as espécies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transferência adotiva de splenocytes total para um destinatário recentemente transplantada é uma maneira eficiente para detectar a presença de células reguladoras induzido ou potencializadas por um tratamento. Linfopenia transitória induzida por irradiação de anfitrião promove a sobrevivência da pilha após a transferência e o estabelecimento da tolerância. Além disso, a irradiação sub-letais deixa tempo para células com propriedades tolerogenic para converter para novas células reguladoras durante recon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi realizado no contexto do projeto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que é parte do programa de governo francês “Investissements d’Avenir” gerenciado pela ANR (ANR-11-LABX-0016-01) e pelo projeto IHU-Cesti financiado também pelo ” Programa de governo francês investissements d’Avenir”, gerido pelo francês nacional investigação agência (ANR) (ANR-10-IBHU-005). O projeto IHU-Cesti também é suportado pelo Nantes Métropole e Région Pays de la Loire.
Materials
| animals | |||
| LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
| name | company | catalogue number | comments |
| reagents | |||
| AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
| anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
| anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
| anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
| anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
| anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
| anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
| streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
| KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
| PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
| Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
| TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
| CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
| RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
| penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
| Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
| non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
| 2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
| Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
| Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
| Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
| EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
| Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
| One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
| Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
| Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
| Complete Freund's adjuvant | |||
| Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
| Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
| Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
| Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
| PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
| CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
| complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
| name | company | catalog number | comments |
| equipments | |||
| falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
| falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
| sieve | |||
| Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
| 100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
| 96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
| 96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
| 96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
| seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
| ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
| centrifuge | |||
| bain marie | |||
| X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
| solar agitator | |||
| FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
| magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |
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