Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في المختبر و في فيفو التقييم تي وب وخلايا النقوي النشاط القمعية واستجابات خلطيه من المتلقين زرع

Published: August 12, 2017 doi: 10.3791/55510
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للحث على التسامح في زرع الأعضاء، وتقييم في المختبر و في فيفو القدرة القمعية لمجموعات فرعية خلية متميزة من المتلقي وحالة المتلقي تجاه الجهات المانحة أو المستضدات خارجية المنشأ المناعي.

Abstract

مصدر القلق الرئيسي في زرع لتحقيق التسامح محددة من خلال تنظيم دورات تعريفية للخلايا التنظيمية. فهم آليات التسامح يتطلب نماذج موثوقة. وهنا يصف لنا نماذج التسامح إلى allograft القلب في الفئران، التي يسببها حصار إشارات كوستيموليشن أو upregulation من جزيئات إيمونوريجولاتوري من خلال نقل الجينات. كل من هذه النماذج يسمح في فيفو جيل من الخلايا التنظيمية مثل خلايا تي التنظيمية (تريجس)، والتنظيمية ب خلايا (برجس) أو خلايا النقوي التنظيمية (ريجمكس). في هذه المخطوطة، يمكننا وصف هذين البروتوكولين التكميلية التي استخدمت لتحديد وتعريف نشاط الخلية التنظيمية في المختبر و في فيفو لتحديد مسؤوليتهم في الحث على التسامح وصيانة. أولاً، في المختبر قمعية مقايسة يسمح التعرف السريع على الخلايا مع القدرات القمعية في الاستجابات المناعية المستجيب بطريقة تعتمد جرعة، ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل مثل قياس سيتوكين أو سيتوتوكسيسيتي. ثانيا، التبني نقل الخلايا من مستلم تعامل متسامح إلى مستلم المطعمة حديثا المشع، أبرز خصائص هذه الخلايا في السيطرة على الاستجابات المناعية الاختلاس الموجهة و/أو تحويل (خلايا تنظيمية جديدة توليروجينيك وصف التسامح المعدية). هذه الأساليب لا تقتصر على الخلايا التي تحتوي على علامات المظهرية المعروفة، ويمكن تمديدها لأي سكان الخلية. وعلاوة على ذلك، توجه المانحين اللوسبيسيفيسيتي الخلايا التنظيمية (هدفا هاما في الميدان) يمكن تقييمها باستخدام خلايا المانحين طرف ثالث أو graft سواء في المختبر أو في الجسم الحي. وأخيراً، لتحديد قدرة توليروجينيك محددة من هذه الخلايا التنظيمية، نقدم بروتوكولات لتقييم استجابات خلطيه المانحة المضادة الأجسام المضادة وقدرة المتلقي على تطوير استجابات خلطيه ضد المستضدات المعروفة الجديدة أو السابقة. نماذج التسامح ووصف يمكن استخدامها لزيادة تميز الخلايا التنظيمية، وتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، وجزيئات إيمونوريجولاتوري، وهي قابلة للتكيف لزرع نماذج أخرى أو أمراض المناعة الذاتية في مكافحة القوارض أو البشرية.

Introduction

Allograft القلب في الفئران هو نموذج زرع جهاز يمكن الاعتماد عليها لتقييم العلاجات التعريفي التسامح، فك آليات التسامح التعريفي، والصيانة، ولديه القدرة على حمل الخلايا التنظيمية المختصة وظيفيا والمهيمنة. البروتوكولات التالية تصف تماما عدم تطابق هيتيروتوبيك القلب طعم من الفئران مانحة 1 وات لويس (LEW.1W، RT1u) في الفئران المستفيدة 1A لويس (LEW.1A، RT1). في هذا الجمع الاختلاس، الرفض الحاد يحدث سريعاً (في حوالي 7 أيام) ويمكن تقييمها بسهولة بالاختلاس الضرب القياس من خلال جس البطن. ونقترح هنا ثلاثة بروتوكولات للحث على التسامح إلى allograft القلب في الفئران. في هذه النماذج، التسامح هو فعل و/أو تحتفظ بها أنواع مختلفة من الخلايا التنظيمية. أولاً، بحظر CD40-CD40L التفاعلات مع إتش ترميز CD40Ig (AdCD40Ig) الناجمة عن توليد CD8+ تريجس قادرة على استحثاث التسامح عند أدوبتيفيلي ونقل إلى المستلمين المطعمة الثانوي1. وعلاوة على ذلك، نضوب CD8 الخلايا+ (مع الأجسام المضادة-CD8α) في AdCD40Ig تعامل المستلمين التي تم إنشاؤها برجس وريجمكس2. تحليل عميق ل CD8+ تريجس خصائص الضوء على الدور الرئيسي للعديد من الجزيئات immunoregulatory يعرف انترلوكين-34 (إيل-34) وفيبروليوكين-2 (فجل-2)3،،من45،6 . بينما overexpression إيل-34 (مع ناقل إف) الناجم عن تريجس من خلال جيل ريجمكس، overexpression فجل-2 التي يسببها برجس، التي تقوم عليها الشبكة المعقدة من الخلايا التنظيمية.

سبب الرفض المزمن يتطور ببطء وطويلة الأجل، مطلوب تحليلاً متعمقا للتمييز بين التسامح مقابل الرفض المزمن. عادة ما يتم تقييم الفساد لتسلل خلية، التليف، وسماكة الأوعية ترسب C4d الجدار وتكملة إيمونوهيستولوجي7. بينما تتطلب التضحية الحيوانية أساليب علم الأنسجة أو graft خزعة، هنا نحن تصف طريقة بسيطة لتقييم ميزات مختلفة من allograft التحمل: ظهور ووظيفة الخلايا التنظيمية واستجابات المانحين لمكافحة جسم معين من الدم عينة من التدفق الخلوي (هنا، استخدمنا خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)).

الحفاظ على التسامح allograft بعد إلقاء القبض على المعاملة يرتبط عموما بتحريض الخلايا التنظيمية8. في العقود الماضية، ركزت الدراسات على CD4+تريجس تتميز الإجماع عليها بعلامات رئيسية Foxp3+CD25عاليةو CD127–9،،من1011. وبالمثل، وعلامات عدة نسبت إلى CD8+ تريجس، مثل CD122+، CD28-، CD45RCمنخفضة، PD1+، و Helios+ 1،12،،من1314 , 15 , 16 , 17-على مدى سنوات، تعبيراً عن جيتر و CTLA4 والسيتوكينات (إيل-10، 34 TGFβ، إيل، إيل-35، فجل-2) ارتبطت بالإضافة إلى ذلك أن تريغ الشخصية3،،من46،13، 18،19،،من2021. بيد أن السكان الخلية التنظيمية الناشئة، مثل برجس، أو ريجمكس، أو نكتريجس، تفتقر إلى علامات محددة ذات الصلة. والواقع أن معظمها سجلت بريجس ك CD24 غير ناضجة+ الخلايا، مع التعبير CD27 غامضة وأحيانا إنتاج إيل-10، TGFβ، أو جرانزيمي ب22،،من2324. تعقد سلالة خلية النقوي يتطلب مزيجاً من عدة علامات لتحديد التشكيل الجانبي التنظيمية أو proinflammatory مثل CD14، CD16، CD80، CD86، CD40، CD209a، أو CD163،من2526. وأخيراً، أبلغ بعض علامات التعرف على نكتريجس مثل CD11b+، CD27+, TGFβ+، ولكن المزيد من الدراسات ضرورية لزيادة وصف لهم فينوتيبيكالي27،28،29 ،30،،من3132. وهكذا، أدلة على نشاط القمعية مطلوبة لإضفاء الشرعية على مزيد من الوصف المظهرية لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، جديدة immunoregulatory الوسطاء، وتوسيع النطاق إلى علاجات جديدة في الخلية.

ونحن نقترح طريقتين مكملة لتقييم نشاط الخلايا القمعية. أولاً، الأسلوب في المختبر يتكون من استزراع الخلايا القمعية مع خلايا المستجيب المسمى تي تحفزها مستضد متمكنة من المانحين تقديم الخلايا (Apc) في نسب مختلفة على مدى 6 أيام، وتحليل المستجيب T الخلية الانتشار التي ويعكس قمع المناعة الموجه من الجهات المانحة. ويمكن مقارنة الخلايا من الفئران المعالجة مباشرة إلى الخلايا من السذاجة الجرذان والفئران المطعمة غير المعالجة لنشاط القمعية (أو لأي سكان الخلية التنظيمية الأخرى)، في طائفة من نسب القامع: المستجيب. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب لا يتطلب أي الزرع، ويتم الحصول على النتائج خلال 6 أيام. ثانيا، الأسلوب في فيفو يتكون من نقل الخلايا التنظيمية المقصود من الفئران معالجة إلى مستلم المطعمة حديثا المشع. بينما الخلايا أو الخلايا النقوي تي ب الخلايا من الفئران غير المعالجة من السذاجة عادة غير قادر على تمنع الرفض الحاد وإطالة أمد بقاء الفساد عند نقل التبني، والخلايا ذات النشاط القمعية potentiated من متلقي العلاج هذه السمات 1،،من23،،من433. ينصح ليمفوبينيا الناجمة عن الإشعاع المتلقي للسماح للخلايا المنقولة أدوبتيفيلي لتظل غير متأثرة بالتوازن الدم وإتقان أكثر سهولة من الاستجابات المناعية المضادة الجهات المانحة. لكلتا الطريقتين، الاستخدام في المختبر لأنه طرف ثالث ناقلات الجنود المدرعة أو في فيفو المتبنيين نقل القمعية الخلايا إلى المستلمين المطعمة بقلب الطرف الثالث يسمح بتحليل لخصوصية المانحين المضادة. بينما الأسلوب في فيفو يتطلب عدد كبير من الخلايا، وسوء تمثيل يمكن تقييم الفئات السكانية الفرعية الخلية بسهولة أكبر لنشاط القمعية في المختبر33.

ويمكن أيضا قياس استجابات خلطيه لتقييم حالة التسامح والسيطرة على استجابات الأجسام المضادة الموجهة إلى الجهات المانحة المستضدات. وفي الواقع، يمكن وصف التسامح بعدم استجابة خلطيه تجاه المانحين ولكن المحافظة على قدرة للمستلمين لتطوير استجابة خلطيه لمولدات جديدة والحفاظ على الذاكرة الردود. أولاً، مبدأ الكشف اللوانتيبودي يستند على الاعتراف بالخلايا المانحة المستفيدة الأجسام المضادة بعد الحضانة لنوع الخلية المانحة مع المصل من مستلم المطعمة. الثاني، خلطيه والاستجابات الموجهة إلى المستضدات خارجية المنشأ يمكن تحفيز التالية المقررة المستلمين متسامح طويلة الأجل مع ثقب المفتاح مفج هيموسيانين (كله) مستحلب مع adjuvant الشعبية فروند كاملة. وجود الأجسام المضادة IgM و IgG محددة ضد المستضدات يمكن الكشف عن 4 و 13 يوما، على التوالي، عقب التمنيع، بمقايسة الممتز الإنزيم المرتبط (أليسا)34. ثالثا، يمكن تقييم الحفاظ على الذاكرة المناعية الردود عن طريق الحقن إكسينوجينيك خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) في أيام-7 و + 3 للزرع وكرات الدم الحمراء تلطيخ مع المصل المتلقية التي تم جمعها في أيام + 8 و + 17 بعد زرع الأعضاء. كل هذه الأساليب تسمح للتعرف على أنواع فرعية الغلوبولين المناعي باستخدام أجسام مضادة ثانوية محددة، وسرعة الحصول على النتائج في أقل من 1.5 ح بنظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ أو بضع ساعات قبل أليسا.

وأخيراً، هذه البروتوكولات المصممة من أجل توصيف لزرع نماذج، ويمكن أن تكون، إلى حد ما، تنطبق على نماذج أمراض المناعة الذاتية. يمكن أن تنقل مبادئ الأسلوب لجميع الأنواع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: جميع البروتوكولات هنا أقرتها لجنة أخلاقية دولية، وينبغي أن يجري بطريقة عقيمة.

1. جيل التسامح في نموذج Allograft القلب في الفئران

  1. LEW.1W إلى LEW.1A allograft الداخلي
    1. تخدير الذكور مانحة LEW.1W الفئران استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين لأداء ثوراكوتومي (أي، شق في مساحة الجنبي للصدر).
      1. المشبك أجوفان وريدان السفلي والعليا وإبطاله لهم، وقطع منها. ثم قطع الشريان الاورطي والشريان الرئوي وحفظها الاختلاس في البرد 0.9% كلوريد الصوديوم.
    2. تخدير 250 غرام ذكور LEW.1A مستلم فأر (من 8-12 أسبوعا) استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين للقيام فتح البطن إكسيفوبوبيك (أي، شق كبير من عملية الرهابه إلى الارتفاق العانة).
      1. تخريج الأمعاء، المشبك في الأوعية الدموية في البطن، وتؤدي ملامسة تيرمينو الجانبية (أي اتصال بين نهاية قناة واحدة والجدار الآخر) بين الاختلاس الشريان الاورطي والشريان الاورطي البطني وفي الرئة الشريان والبطن الوريد الأجوف، وإزالة المشابك.
    3. خياطة الطائرة العضلات والجلد، وتطهير مع تدين.
    4. حقن نالبوفيني (مسكن) 6 مغ/كغ تحت الجلد (الليبي) ومادة أوكسي تتراسايكلين (المضادات الحيوية) عضليا (الدردشة)، ووضع الحيوان تحت مصباح حرارة حتى يوقظ الحيوان. حقن البوبرينورفين (شبائه الأفيون) الدردشة (50 ميكروغرام/كغ) وميلوكسيكام (العقاقير المضادة للالتهابات المسكنة) (0.3 مغ/كغ) الليبي اليوم من زرع وبعد يوم واحد.
  2. التعريفي للتسامح بحصار تفاعلات كوستيمولاتوري
    1. اتبع الخطوات 1.1.1. إلى 1.1.2.
    2. في منطقة مصنفة A2 مرفق الحيوانية، تمييع الجسيمات المعدية 2 × 1010 من AdCD40Ig (إتش ترميز CD40Ig، جزيء تشيميريك الذي يمنع التفاعلات CD40-CD40L) في محلول لاكتات في المسابقة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر وحقن في 3 نقاط (3 × 50 ميليلتر) في جدار البطين ذروة الفساد.
    3. اتبع الخطوات من 1.1.3 إلى 1.1.4.
      ملاحظة: يمكن علاج AdCD40Ig المرتبطة بمكافحة CD8α أو نظام ايكوس مكافحة مكافحة CD28 جسم حقن2،،من3536.
  3. التعريفي للتسامح من جانب overexpression بروتين المؤتلف
    1. تمييع 1 × 1012 الجينوم الفيروسي من الفئران إف IL34-المؤتلف في محلول لاكتات في المسابقة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر. تخدير الفئران LEW.1A ز 150 مع استنشاق isoflurane-س2 وحقن الوريد (رابعا) في هذا السياق القضيب.
    2. شهر واحد بعد حقن إف-IL34، إجراء طعم LEW.1W على المستلم LEW.1A وفقا للبروتوكول 1.1.

2. في المختبر تقييم نشاط الخلايا القمعية بردود فعل مختلطة من الخلايا الليمفاوية (نظام قاذفة صواريخ متعددة)

ملاحظة: ينبغي مقارنة النشاط القمعية من الخلايا في الفئران المعالجة تسامحا مع السكان ما يعادل من المستلمين المطعمة سينجينيك أو السذاجة الفئران.

  1. عزل من ناقلات الجنود المدرعة متمكنة: الخلايا الجذعية بلاسماسيتويد (pDCs)
    1. تخدير ذكور LEW.1W السذاجة مانحة الفئران استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين القيام استئصال. إزالة الطحال بواسطة ترانسيكتينج السفن وحفظ الطحال في البرد 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وخياطة الحيوان.
    2. نقل الطحال في طبق وإزالة 1 X PBS ونتخلل مع 5 مل من 0.2% D. كولاجيناز تحسين هضم إنزيم، قطع الطحال إلى قطع صغيرة واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 500 ميليلتر من 0.1 م الإيثيلين حمض (يدتا)، ونقل القطع الطحال في غربال وسحق الطحال مع مكبس لحقنه فصل الخلايا. نقل في أنبوب وغسل الخلايا مع 15 مل من 1 X PBS. أجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
    4. للقضاء على كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية، ريسوسبيند بيليه سبلينوسيتي في 10 مل من محلول ناقص التوتر واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يغسل مع 1 X PBS والطرد المركزي 10 دقيقة في 190 x زاي تجاهل المادة طافية.
    5. إزالة ألياف الكولاجين بالتصفية على مرشح أنسجة 100 ميكرومتر. عد الخلايا لضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في مصل العجل الجنين PBS/2% س 1 (FCS)/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون عدد سبلينوسيتيس بين 4 × 108 و 7 × 108 خلايا.
    6. إثراء للخلايا ذات الاهتمام بالانتقاء السلبي قبل فرز الخلايا. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية أجسام مضادة محددة لخلايا تي (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3، ومكافحة--TCRγδ، استنساخ V65) وخلايا ب (مكافحة CD45RA، واستنساخ OX33) والخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x ز . تجاهل المادة طافية.
    7. يغسل مع الخرز المغناطيسي 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا. استخدم الخرز/10 ميليلتر 3.56 سبلينوسيتيس وتغسل بإضافة 30 مل 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا، مكان لمدة 1 دقيقة على المغناطيس، وتجاهل المادة طافية. كرر مرتين. ريسوسبيند الخرز في 10 مجلدات 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا (على سبيل المثال، 35 ميليلتر الخرز المخفف في 350 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا).
    8. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط في سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت التحريض ووضع الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: يجب أن تتراوح عدد سبلينوسيتيس المخصب بين 5 × 107 و 9 × 107.
    9. وصمة عار في الخلايا باستخدام أجسام مضادة مسماة لفرز المزيد من pDCs: استبعاد الخلايا تي المتبقية (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3) أو خلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، ونوع CD4+ (مكافحة CD4، استنساخ OX35) CD45R+ الخلايا (مكافحة--CD45R، His24 استنساخ). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
    10. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا التي تحتوي أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر، حسب النابضة في CD45RA تكر–DAPI––CD4+CD45R+ كما هو مبين في الشكل 1.
  2. عزل خلايا المستجيب تي المستجيب (CD4 + CD25 الخلايا T – )
    1. حصاد الطحال من الفئران غير المعالجة ساذجة غير المطعمة LEW.1A وحفظه في البرد 1 X برنامج تلفزيوني.
    2. نقل الطحال في غربال توضع في صحن وأضف 10 مل من 1 X PBS. سحق الطحال مع مكبس لحقنه فصل الخلايا. نقل الخلايا في أنبوب 50 مل وتغسل مع 1 X PBS والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
    3. للقضاء على كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية، ريسوسبيند بيليه سبلينوسيتي في 10 مل محلول ناقص التوتر لمدة 5 دقائق في الرايت، تجاهل ثم يغسل في 1 X برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 190 x غ. المادة طافية.
    4. إزالة ألياف الكولاجين بالتصفية على مرشح أنسجة 100 ميكرومتر. عد الخلايا لضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون عدد سبلينوسيتيس بين 3 × 108 و 5 × 108 خلايا.
    5. إثراء خلايا الفائدة قبل الفرز. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية الأجسام المضادة المحددة للخلايا CD8 (مكافحة--CD8α، OX8 استنساخ)، خلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، ناغورني كاراباخ الخلايا (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/c، OX42 استنساخ)، وغاما دلتا تي الخلايا (TCRγδ المضادة، استنساخ V65). ثم يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: لفرز CD8 الطبيعية الجرذان+ تريجس من السذاجة في الوقت نفسه كخلايا CD4+ خلايا المستجيب T، لا تقم بإضافة CD8α المضادة Ab خلال استنزاف.
    6. أغسل حبات مغناطيسية 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
    7. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: يجب أن تتراوح عدد سبلينوسيتيس بين 5 × 107 و 8 × 107 الخلايا.
    8. إضافة أجسام مضادة مسماة لنوع CD4+CD25 الخلايا T– : مكافحة--TCRαβ (استنساخ R7/3)، المضادة لخلايا CD4 (OX35 استنساخ)، مكافحة-CD25 (استنساخ OX39) واحتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. للفرز في وقت واحد CD8+CD45RCمنخفض تريجس، إضافة CD45RC المضادة Ab (استنساخ OX22). قم بتسمية الخرز مع كل آب إعداد مصفوفة تعويض لمزيد من المعالجة في التدفق الخلوي. تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
    9. ريسوسبيند الخلايا إلى 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر حسب النابضة في تكر DAPI –+CD4+CD25– الخلايا كخلايا المستجيب (وإذا لزم الأمر تكر DAPI –+CD4–CD45RCمنخفضة ك CD8+ الخلايا القمعية تريجس) كما هو مبين في الشكل 2.
  3. عزل الخلايا القمعية
    ملاحظة: تقسم الطحال في مختبرين اثنين: فرز واحد في الخلايا ب، النقوي الخلايا والخلايا ناغورني كاراباخ، وأخرى في خلايا CD4+ و CD8+ CD45RCمنخفضة تي الخلايا، لتقييم وظيفتها القمعية.
    ملاحظة: لنقل خلية التبني، وحفظ 1 × 108 سبلينوسيتيس لتكون بمثابة عنصر التحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني، إذا لزم الأمر.
    1. فرز ب الخلايا والخلايا النقوي، وخلايا ناغورني كاراباخ
      1. اتبع البروتوكول 2.1.1 إلى 2.1.5.
      2. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تي خلية محددة غير مسمى الأجسام المضادة (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3، ومكافحة--TCRγδ،، V65 استنساخ)، يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      3. يغسل مع الخرز المغناطيسي 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
      4. مزيج سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسي لإزالة الخلايا غير المرغوب فيها واحتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      5. إضافة أجسام مضادة مسماة إلى سبلينوسيتيس لفرز الخلايا مع المشتبه فيهم نشاط القمعية مثل خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/ج، واستنساخ OX42) أو الخلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ) أو الخلايا ناغورني كاراباخ (مكافحة--CD161، 3.2.3 استنساخ). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      6. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر حسب النابضة في DAPI–CD11b/ج+ للخلايا النقوي، CD45RA+ ب الخلايا و CD161+ للخلايا ناغورني كاراباخ كما هو مبين في الشكل 3.
    2. الفرز من خلايا CD4 + و CD8 + CD45RC الخلايا منخفض T
      1. اتبع البروتوكول 2.2.1 إلى 2.2.4.
      2. للانتقاء السلبي على عمود مغناطيسي، احتضان الخلايا 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية الأجسام المضادة المحددة للخلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، والخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/c، OX42 استنساخ)، وغاما دلتا تي الخلايا ( مكافحة--TCRγδ، استنساخ V65)، غسلها مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      3. أغسل حبات مغناطيسية 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
      4. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط في سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      5. إضافة أجسام مضادة مسماة في الخلايا لفرز تريجس: مكافحة--TCRαβ (استنساخ R7/3)، ومكافحة-CD4 (استنساخ OX35)، ومكافحة--CD45RC (النسخة OX22). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      6. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، عامل التصفية على أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر واسطة النابضة في DAPI–تكر+CD4+CD45RCمنخفضة كخلايا CD4+تريجس و DAPI–+CD4 تكر–CD45RC منخفضة ك CD8+تريجس ( الشكل 4).
        ملاحظة: Ab مكافحة--CD8α (النسخة OX8) يمكن استخدامها بدلاً من Ab CD4 المضادة إذا يتعرضون للتمييز من خلايا CD4 خلايا تي+الخلايا غير-T بوسم تكر المضادة. وجود فائض من خلايا CD4+تريجس ينبغي فرزها تحسبا لموت الخلايا بسبب العلامات صبغ انتشار الخلايا (وثيقة).
  4. كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر (CFSE) في وضع العلامات لخلايا المستجيب لقياس الانتشار
    1. بعد فرز الخلايا المستجيب، تغسل مرتين في الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني X 1.
    2. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني X 1 واحتضان مع 0.5 ميكرومتر كفسي لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. وتوقف عند رد فعل إضافة FCS 1.5 X الحجم الطرد المركزي 10 دقيقة في ز 430 x في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    3. تغسل مرتين الخلايا مع المتوسطة كاملة، وحساب الخلايا.
      ملاحظة: توقع 30% موت الخلايا في هذه الخطوة.
  5. وصف وثيقة البرنامج القطري لخلايا CD4 + تريجس للمقايسة القمعية في خلايا CD4 + خلايا المستجيب
    ملاحظة: مطلوب هذه الخطوة لتميز CD4 كفسي–+تريجس من المستجيب المتكاثرة كفسي– CD4+خلايا تي في اليوم السادس من كوكولتوري طريق النابضة في وثيقة البرنامج القطري– الخلايا.
    1. بعد CD4+ تريجس الخلية الفرز، تغسل مرتين في الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني X 1.
    2. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني X 1 واحتضان مع 10 ميكرون من V450 وثيقة البرنامج القطري لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام.
    3. تغسل مرتين الخلايا مع المتوسطة كاملة، وحساب الخلايا.
      ملاحظة: توقع 30% موت الخلايا في هذه الخطوة.
  6. تقديم المشورة كوكولتوري
    1. استخدام الثقافة في المتوسط تضم: المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع البنسلين (5 × 10-5 م)، بيتا-mercaptoethanol (100 U/mL)، ستربتوميسين (0.1 مغ/مل)، بيروفات صوديوم (1 ملم)، الجلوتامين (2 مم)، حبيس المخزن المؤقت (1 ملم)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1 X)، FCS ( 10 في المائة).
    2. خلايا الثقافة في يو 96-جيدا أسفل لوحات.
    3. إضافة خلايا بالترتيب التالي: الخلايا القمعية، وخلايا المستجيب، وخلايا متمكنة.
    4. تبقى ثابتة في عدد خلايا المستجيب T وناقلات الجنود المدرعة متمكنة واختبار عدد مجموعة من تريجس. على سبيل المثال، نسبة 4:4:1، 5 × 104 خلايا القمعية، 5 × 104 خلايا المستجيب، و 1.25 × 104 خلايا متمكنة، ونسبة 2:4:1، 2، 5 × 104 خلايا القمعية، 5 × 104 خلايا المستجيب، و 1.25 × 104 متمكنة الخلايا.
    5. المحافظة على نسبة 5 × 104 خلايا المستجيب ل 200 ميليلتر المتوسطة/جيدا.
    6. لعناصر تحكم، تشمل آبار قليلة مع خلايا المستجيب تي دون متمكنة ناقلات الجنود المدرعة (المراقبة السلبية) وخلايا المستجيب تي مع ناقلات الجنود المدرعة متمكنة دون الخلايا التنظيمية (مراقبة إيجابية) كفسي النابضة في يوم 6 (راجع الخطوة 2.7.6.).
  7. تلوين نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليل بعد 6 أيام كوكولتوري
    ملاحظة: يمكن تقييم انتشار خلايا المستجيب في عدة نقاط زمنية. لاحظ بأن الانتشار المتسارع: كما يزيد من انقسام الخلية، يمكن ملاحظة الاختلافات أكثر بين الظروف القمعية والمراقبة السلبية.
    1. نقل الخلايا من ش 96-جيدا أسفل لوحات إلى 96، حسنا الخامس أسفل لوحات والطرد المركزي 1 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية.
    2. حفظ المادة طافية في لوحة جديدة في-20 درجة مئوية لقياس مستويات سيتوكين، إذا لزم الأمر.
    3. تغسل الخلايا مع 200 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كل بئر والطرد المركزي 1 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية.
    4. إضافة الأجسام المضادة للخلايا للبوابة كذلك على خلايا المستجيب T: مكافحة--تكراب (استنساخ R7/3) ومكافحة-CD4 (استنساخ OX35). احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية ويغسل مرتين مع 200 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كل بئر. تجاهل المادة طافية.
    5. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني X 1 وقراءة اللوحة مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    6. تحليل الشخصية كفسي طريق النابضة على DAPI سلبي (الخلايا الحية) السلبية وثيقة البرنامج القطري (غير CD4+تريجس) تكر+CD4+ الخلايا. تحتوي الخلايا المستجيب unstimulated القصوى كفسي السطوع كما هو موضح في الشكل 5 أسفل الرسم البياني الأيسر. حضور متمكنة ناقلات الجنود المدرعة، وخلايا المستجيب قد الانتشار القصوى والدنيا كفسي السطوع (أسفل، وسط). حضور متمكنة من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا التنظيمية، يكون خلايا المستجيب انتشار متوسطة الحجم والسطوع كفسي (أسفل اليمين).

3. في فيفو التقييم لنشاط الخلايا القمعية بنقل الخلية التبني في قلب المطعمة المستلم

ملاحظة: مطلوب تشعيع للقضاء على الخلايا المضيفة وصالح engraftment الخلية المانحة وانتشارها.

  1. تشعيع المستلمين الاختلاس مبكرا في اليوم السابق على الفساد مسبق المستلم. تخدير الفئران بحقن إيم. من إكسيلازيني (8 ملغ/كغ)-الكيتامين (80 ملغ/كغ) ويتهددها لهم بجرعة قدرها 4.5 غراي بالأشعة السينية.
  2. اتبع البروتوكول 2.3 عزل خلايا فائدة.
    ملاحظة: حفظ 1 × 108 سبلينوسيتيس لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني، إذا لزم الأمر.
  3. تخدير الفئران باستنشاق 4% إيسوفلوراني-س2 ح 12 بعد التشعيع (في اليوم السابق الاختلاس، وفي المساء،) وغرس الخلايا (5.0 × 107 ر الخلايا أو 3.0 × 107 ب الخلايا، 3.0 × 107 النقوي الخلايا أو 1.50 × 108 رابعا سبلينوسيتيس كعنصر تحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني) في هذا السياق القضيب.
    ملاحظة: يعتمد عدد الخلايا المطلوبة للتسامح بنقل التبني على نشاط الخلايا القمعية.
  4. في اليوم التالي، اتبع البروتوكول 1.1 لأداء في allograft. متابعة تطور الاختلاس بالجس عن طريق البطن.

4-الجهات المانحة كشف الأجسام المضادة المحددة

ملاحظة: مفتش يتم قياس الاستجابات الموجهة نحو الجهة المانحة الاختلاس التي تفرخ الخلايا من الجهة المانحة بالمصل للمستلم. قم بطرح الخلفية الناجم عن تلطيخ مباشرة ب LEW.1W الخلايا التي تفرخ الخلايا مع سينجينيك LEW.1W المصل.

  1. حصاد الدم من الفئران والطرد المركزي 15 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية. حفظ المصل. يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية المصل أو استخدامها على الفور. إلغاء تنشيط مكمل في الأمصال التي تفرخ لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية.
  2. حصاد الطحال من الفئران LEW.1W مانحة وحفظه في البرد 1 X برنامج تلفزيوني. اتبع الخطوات 2.2.1. ل 2.2.4. إضافة 2 × 105 خلايا/بئر في صفيحة أسفل الخامس 96-جيدا. الطرد المركزي 1 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
  3. تمييع الأمصال تسلسلياً من 1/10 لبرنامج تلفزيوني في 1/270 1 X (4 تخفيف في عينة). احتضان الخلايا ح 1 في 4 درجات مئوية مع 25 ميليلتر من المصل المخفف/جيدا. توقع عدد الاستجابات المناعية الأنواع الفرعية (مفتش، IgG1، IgG2a، IgG2b) مفتش الخاصة بالجهات المانحة لتحليل كل عينة (1 مصل x 4 تخفيف x 4 مفتش الأنواع الفرعية). تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
  4. احتضان الخلايا مع فرعي كل مفتش مكافحة الفئران الماوس Ab المسمى فلوروتشرومي لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، نوع فرعي/بئر واحدة.
    ملاحظة: إذا كانت غير متوفرة المسمى فلوروتشرومي لمكافحة الفئران Ig Ab، من الممكن استخدام الماوس غير مسمى المنقي لمكافحة الفئران مفتش فرعي Ab وماوس المضادة ثانوية اعتماداً ab. المسمى فلوروتشرومي على فلوروتشروميس المتاحة وتكوين سيتوميتير، ويمكن اختبار عدة أنواع فرعية مفتش مكافحة الفئران في بئر واحدة مع الإعدادات المناسبة.
  5. تغسل الخلايا مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا مرتين وتجاهل المادة طافية.
  6. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني وقراءة اللوحة مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  7. قراءة الأسفار متوسط الكثافة (MFI) لمكافحة الفئران مفتش فرعي المسمى Ab مع فلوروتشرومي على كافة الخلايا DAPI– . طرح مؤسسة مونتانيار الحصول عليها مع السذاجة LEW.1A المصل على الخلايا LEW.1W (تلوين الخلفية، أسفل اليسار) من مؤسسة مونتانيار الحصول عليها مع الأمصال من كل مستلم على الخلايا LEW.1W في تمييع المقابلة (السفلي الأوسط للمستلمين رفض غير المعالجة التي عرض مؤسسة مونتانيار القصوى والدنيا الحق للمستلمين متسامح المعالجة التي تعرض مؤسسة مونتانيار المتوسطة) (الشكل 6).

5-تقييم استجابات خلطيه إلى المستضدات خارجية المنشأ (ساذج والذاكرة)

ملاحظة: يجب استخدام مصل من الفئران قبل زرع الأعضاء، والعلاج، والتحصين كعناصر سلبية لاستجابات خلطيه. وبخلاف ذلك، يمكن استخدام الفئران ساذجة غير المحصنين. المصل من الأشخاص المتلقين، أي، زرع تحصين اكسوانتيجين ورفض المستفيدين، تستخدم كعناصر إيجابية من استجابات خلطيه.

  1. القدرة على تطوير استجابة خلطيه مستضد جديدة (الشكل 7)
    ملاحظة: هذا الأسلوب التحديد كمي نسبي لاستجابات خلطيه كما أنها لا تتضمن معياراً. القياس الكمي Ig مطلق سيكون من الممكن عن طريق إضافة مجموعة من تخفيف للفئران IgG أو IgM كله المضادة Ab مع تركيز معلوم في خطوة 5.1.6.
    1. استحلاب 50 ميكروغرام من كله في 200 ميليلتر من adjuvant الشعبية فروند كاملة وحقن في ذيل المتلقين طويلة الباقين على قيد الحياة/متسامح، التحكم المستلمين رفض غير المعالجة، أو الفئران ساذجة كالتحكم الإيجابي لاستجابات خلطيه.
    2. حصاد عينات الدم في 4 و 13 يوما بعد التحصين، والطرد المركزي 15 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية. حفظ المرحلة العليا من المصل. حصاد المصل من الفئران غير المحصنين لعنصر تحكم سلبية. يمكن أن تجمد المصل في-20 درجة مئوية حتى الإنزيم ELISA.
    3. معطف لوحات إليزا (القاع المسطح) مع 50 ميليلتر/البئر كله تضعف في 10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من أن الحل الطلاء يغطي جميع الآبار.
    4. إزالة كله غير المصقول الزائدة بالغسيل. ليغسل، إضافة 150 ميليلتر/جيدا من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (PBS X 1 يحتوي على 0.1% توين) ونفض الغبار.
    5. كتلة غير محدد ملزم للمفتش العام الخاص بالمستلم بحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية من غسل مخزن يحتوي على السفح 10% 100 ميليلتر/جيدا. أغسل مرة واحدة.
    6. متسلسل تمييع الأمصال المتلقية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بدءاً من 1/40 إلى 1/512، إضافة 50 ميليلتر/بئر في التكرارات لتمييع التسلسلي للوحة المغلفة، واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ ببعض الآبار خالية من المصل لعنصر تحكم سلبية. تغسل مرتين.
    7. إضافة 50 ميليلتر 1 ميكروغرام/مل من البيوتين مترافق مكافحة الفئران IgM Ab في الآبار التي تحتوي على المصل تحصد في يوم 4 في المستلمين، أو 50 ميليلتر من البيوتين مترافق مكافحة الفئران مفتش في الآبار التي تحتوي على المصل تحصد في يوم 13، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية. تغسل مرتين.
    8. إضافة 50 ميليلتر/بئر streptavidin مترافق HRP في 1 ميكروغرام/مل لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أغسل 3 مرات.
    9. إضافة 50 ميليلتر من 3، 3، 5، 5 '--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة < 30 دقيقة في الرايت والتوقف عن رد فعل مع 25 ميليلتر من حامض الكبريتيك 2 متر عند المشبعة عناصر إيجابية.
    10. قراءة امتصاص في 405 نانومتر. مقارنة الكثافة البصرية الحصول على مصل للمستلم الذي حصل مع المصل مكافحة الفئران ساذجة.
  2. تقييم قدرة استجابة خلطيه الذاكرة (رقم 8)
    1. 7 أيام قبل الزرع، حقن رابعا 109 من كرات الدم الحمراء إكسينوجينيك المخفف في 800 ميليلتر من 1 X برنامج تلفزيوني في الفئران ساذجة. يمكن أن تكون كرات الدم الحمراء من الأغنام أو الحصان أو أي أنواع أخرى.
    2. القيام بزرع الأعضاء وإدارة العلاج توليروجينيك.
    3. 3 أيام بعد الاختلاس، حقن مرة أخرى i.v.109 ربك المخفف في 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني X 1 في المستلمين الاختلاس والفئران غير المطعمة.
    4. حصاد الدم عينات 5 و 14 يوما بعد التحصين الثاني والطرد المركزي 15 دقيقة في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية لاسترداد في المرحلة العليا المصل. يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية المصل أو استخدامها على الفور. إلغاء تنشيط المتممة في الأمصال الفئران التي تفرخ 30 دقيقة في 56 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    5. إضافة 2 × 105 ربك/جيدا صفيحة أسفل الخامس 96-جيدا. الطرد المركزي 1 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية بعناية بالطموح.
    6. متسلسل تمييع سيرا 2-fold من 1/10 إلى 1/1280 في 1 X برنامج تلفزيوني (8 تخفيف في عينة). احتضان الخلايا ح 1 في 4 درجات مئوية مع 25 ميليلتر من المصل المخفف/جيدا. تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
    7. احتضان الخلايا مع ربك تمتز الأنواع المضادة الفئران IgG أو IgM الأنواع الفرعية المسماة مع فلوروتشرومي لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، نوع فرعي/بئر واحدة. تقييم الفئران ربك المضادة IgM و IgG في مصل الدم تحصد بعد التحصين، أيام 5 و 14 على التوالي. تغسل الخلايا مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا مرتين وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: إذا كانت غير متوفرة المسمى فلوروتشرومي لمكافحة الفئران Ig Ab، من الممكن استخدام الماوس غير مسمى المنقي لمكافحة الفئران مفتش فرعي Ab وماوس المضادة ثانوية Ab المسمى فلوروتشرومي.
    8. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني X 1 وتحليل الخلايا مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    9. وتمثل مؤسسة مونتانيار كدالة لتمييع لكل مجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم نشاط القمعية بعد فرز ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1)، وخلايا المستجيب وتريجس في أن واحد (الشكل 2)، أو بشكل فردي (الشكل 4)، ويمكن أن يكون أي المفترضة التنظيمية الخلايا الأخرى (الشكل 3)، القيام به في فيفو بالحقن المباشر للخلايا التنظيمية و في المختبر بقياس كفسي السطوع (الشكل 5). كما يمكن وضع استجابة خلطيه المتلقي تجاه الجهات المانحة (الشكل 6) أو المستضدات خارجية المنشأ (الأرقام 7 و 8) المقررة في المختبر بعد التحصين في فيفو كما يصور.

Figure 1
الشكل 1 . النابضة استراتيجية لفرز pDCs.
تم تحديد خلايا في حجم مورفولوجيا وتقسيمات (SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A) واستبعدت doublets بمنتدى التعاون الأمني-ث/منتدى التعاون الأمني-ح ومعلمات SSC-ث/SSC-ح، اختارهم الخلايا الحية النابضة في DAPI– الخلايا، واختيرت pDCs في CD45RA تكر––CD4 + CD45R+ التعبير. وقيمت النقاء بإضافة DAPI إلى فرز الخلايا ويعمل على فارز الخلية مع معايير الفرز. ينبغي أن يكون النقاء للسكان تم فرزها نادرة (أقل من 2 في المائة) أكثر من 95%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 . النابضة استراتيجية لنوع CD4+CD25– CD8 وخلايا المستجيب تي+CD45RCمنخفض تريجس.
تم تحديد خلايا في أي حجم ومورفولوجيا وتقسيمات (SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A) واستبعدت doublets بمنتدى التعاون الأمني-ث/منتدى التعاون الأمني-ح ومعلمات SSC-ث/SSC-ح، اختارهم الخلايا الحية النابضة في DAPI– الخلايا، وتم تحديد خلايا المستجيب في تكر + خلايا CD4+CD25 التعبير– . CD8+تريجس وقد تم فرزها على حسب النابضة في تكر+CD4 الخلايامنخفض CD45RC–في وقت واحد. وقيمت النقاء بإضافة DAPI إلى فرز الخلايا ويعمل على فارز الخلية مع معايير الفرز. ينبغي أن يكون نقاء أكثر من 95%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : استراتيجية لفرز ب الخلايا والخلايا النقوي ناغورني كاراباخ الخلايا النابضة.
تم تحديد خلايا في حجم مورفولوجيا وتقسيمات (SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A) واستبعدت doublets بمنتدى التعاون الأمني-ث/منتدى التعاون الأمني-ح ومعلمات SSC-ث/SSC-ح وقد اختارها الخلايا الحية النابضة في DAPI– الخلايا، وتم تحديد خلايا ب في CD45RA+ التعبير، خلايا النقوي في التعبير CD11b/ج+ ، والخلايا ناغورني كاراباخ على CD45RA CD161 CD11b/ج––التعبيرعالية . وقيمت النقاء بإضافة DAPI إلى فرز الخلايا ويعمل على فارز الخلية مع معايير الفرز. ينبغي أن يكون نقاء أكثر من 95%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . النابضة استراتيجية لنوع CD8+CD45RCمنخفض وخلايا CD4+CD45RCمنخفض تريجس.
تم تحديد خلايا في حجم مورفولوجيا وتقسيمات (SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A)، واستبعدت doublets بمنتدى التعاون الأمني-ث/منتدى التعاون الأمني-ح ومعلمات SSC-ث/SSC-ح، اختارهم عاش الخلايا النابضة في الخلايا DAPI– ، وخلايا CD4+تريجس وتم اختيار على تكر + خلايا CD4+CD45RC التعبيرمنخفضة و CD8+تريجس في+CD4 تكر–CD45RC التعبيرمنخفضة . وقيمت النقاء بإضافة DAPI إلى فرز الخلايا ويعمل على فارز الخلية مع معايير الفرز. ينبغي أن يكون نقاء أكثر من 95%. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 . تحليل الممثل في المختبر القمعية المقايسة.
وقد تم تحليل انتشار الخلايا المستجيب باختيار حجم مورفولوجيا وتقسيمات (SSC-A/منتدى التعاون الأمني-A)، استبعاد doublets بمعلمات منتدى التعاون الأمني-ث/منتدى التعاون الأمني-ح وال SSC-ث/SSC-ح، واستبعاد الخلايا الميتة وخلايا CD4+ تريجس طريق النابضة في CPDV450 DAPI– الخلايا – ، واختيار تكر+CD4+ الخلايا، وتحليل كفسي الشخصية. بوابة كفسي تستند إلى خلايا المستجيب كفسي المسمى أونستيمولاتيد. كفسيارتفاع الخلايا خلايا غير المنتشرة وكفسيمنخفضة هي الخلايا مع ≥ 1 شعبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 . الممثل تحليل استجابة المانحين اللوانتيبودي محددة.
كانت سبلينوسيتيس من الفئران المانحة المحتضنة مع طائفة من المصل المخفف إبطال الحرارة من المستلمين المعالجة أو غير المعالجة أو من السذاجة الفئران، ومن ثم مع مفتش مكافحة الفئران-فيتك. يتم الكشف عن اللوانتيبوديس من خلال تحليل مؤسسة مونتانيار فيتك على DAPI– ض الخلايا بعد استبعاد doublets SSC ومنتدى التعاون الأمني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 . مبدأ طريقة الكشف مكافحة كله.
المستلمين تم تحصينهم 120 يوما بعد زرع مع كله وتستكمل مع فرنكات الجماعة المالية الأفريقية، وعينات الدم كانت تحصد 4 و 13 يوما بعد التحصين. كله البروتينات المغلفة في أسفل شقة 96 بئرا لوحات، والمحتضنة مع عينات مصلية من الفئران المحصنين. بيوتينيلاتيد الماعز لمكافحة الفئران IgG أو IgM يسمح بالكشف عن آب كله المضادة موجودة في المصل تحصد 4 أو 13 يوما من التحصين. ستريبتافيدين إلى جانب برنامج الصحة الإنجابية تحول الركيزة TMB منتج لون أزرق يتحول إلى اللون الأصفر عندما أوقف التفاعل مع حمض الكبريتيك. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8 . مخطط لطريقة الكشف مكافحة ربك.
المستلمين تم تحصينهم قبل 7 أيام وبعد كانت تحصد الزرع مع إكسينوجينيك خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء)، وعينات دم من 3 أيام تحصين المستلمين 5 و 14 يوما من التحصين الأخير. كانت المحتضنة كرات الدم الحمراء مع عينات مصلية من الفئران المحصنين. تم الكشف عن وجود الأجسام المضادة-كرات الدم الحمراء على كرات الدم الحمراء تلطيخ مع الماعز المسمى لمكافحة الفئران مفتش أو الأجسام المضادة IgM وكانتو نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقل التبني من مجموع سبلينوسيتيس إلى مستلم المطعمة حديثا طريقة فعالة للكشف عن وجود خلايا تنظيمية المستحث أو بوتينتياتيد بعلاج. المضيف التي يسببها الإشعاع ليمفوبينيا عابرة يعزز بقاء الخلية بعد نقل وإقامة للتسامح. وعلاوة على ذلك، يترك تشعيع الفتاكة دون وقت للخلايا مع خصائص توليروجينيك لتحويل خلايا تنظيمية جديدة أثناء إعادة تشكيل المناعة، ظاهرة تسمى التسامح المعدية34. عادة، خلايا CD4 جيدا وصف+CD25عاليةFoxp3+CD127منخفضة هي أول درس تريجس عندما لوحظ التسامح. ومع ذلك، نقل الكسر السلبية (سبلينوسيتيس المنضب في خلايا CD4+تريجس) يسمح في بعض الأحيان التمديد بعد معروفة بالفعل الخلايا التنظيمية وتحديد الهوية من جديد خلية السكان1،2، 3،4. في AdCD40Ig-الناجم عن التسامح، نقل خلايا CD4+سبلينوسيتيس استنزاف خلايا تي كشفت عن اكتشاف CD8+CD45RCمنخفض تريجس1. وعلاوة على ذلك، نقل المتعاقبة من مجموع CD8+ تي الخلايا، ومن ثم يقتصر على الخلايا CD45RCمنخفضة ، وأظهر إمكانات هذا الأسلوب لتحديد عدد سكانها خلايا تنظيمية جديدة تدريجيا. وعلاوة على ذلك، تتيح هذه الاستراتيجية تحليل لجميع السكان. وفي الواقع، وقد أظهرنا أن العديد من الخلايا التنظيمية يمكن أن تتعايش وحتى المحتملة، ووجود آليات تعويضية2،4. في الفئران التي تعامل مع CD40Ig، استنفاد CD8+ الخلايا يسمح بظهور خلايا ب وخلايا النقوي مع خصائص تنظيمية، ونقل التسامح إلى allograft القلب في الفئران وفقا للبروتوكول، المذكورة أعلاه2. في نموذج للتسامح الناجم عن أوفيريكسبريشن IL34، على حد سواء CD4+ و CD8+تريجس كانت قادرة على نقل4من التسامح.

ويمكن تقييم خصوصية التسامح التي يسببها العلاج الموجه من الجهات المانحة على المستويين الخلوي وخلطيه. نقل الخلايا التنظيمية الأولى، والتبني إلى المستفيدين طعم طرف ثالث لن ينجح في نقل التسامح إذا كانت الخلايا المحددة إلى الابتزاز المانحة الأولى33. الخلايا القمعية، والثانية ينبغي أن كفاءة تمنع انتشار الخلايا المستجيب استجابة للتحفيز قبل المصفحتين من المانح الأول للفساد لكن ليس من ثالث طرف المانحة2. أخيرا، يمكن التمييز بين استجابات خلطيه ضد الجهة المانحة الاختلاس من إجمالي الإنتاج Ig في المستلم باستخدام بروتوكول الموصوفة أعلاه. وعلاوة على ذلك، في حالة التسامح محددة إلى الجهة المانحة الاختلاس الأولى، ينبغي أن يكون المتلقي قادرة على تطوير استجابة خلطيه جديدة ضد طعم الطرف الثالث ثانوي، مستضد جديدة أو مستضد معروفة سابقا16.

كولاجيناز د علاج الطحال المفضل والمستحسن لاستخراج كل خلية السكان من الجهاز. وأخيراً، عندما النمط الظاهري للخلايا التنظيمية ذلك ضيق أن الخلايا تمثيل ضعيف (< 1% من سبلينوسيتيس)، ونقل الكسر سلبية مقارنة بنقل مجموع السكان يمكن أن تساعد في التمييز بين نشاط القمعية الصغيرة هذه السكان. CD8 الناجمة عن CD40Ig على سبيل المثال،+تريجس محددة ببتيد متمكنة يمكن أن يكون نظام مراقبة الأصول الميدانية الملون باستخدام تيتراميرس، لكنها لم تسمح انخفاض عدد نقل التبني إيجابية33،38. ومع ذلك، نقل التبني من CD8 المستنفد تيترامير+CD45RC الخلايامنخفض T لم ينقل التسامح مقارنة بإجمالي تريجس، تسليط الضوء على إمكانات هذا يتدنى. وأكد هذه النتيجة تجربة قمعية في المختبر . والواقع أن التجربة القمعية كان أيضا بطريقة مقنعة لإظهار قدرة تريجس Du51 على حدة لقمع الاستجابات المناعية33.

البروتوكول القمعية الموصوفة أعلاه يقتصر على المتلقي المستجيب CD4+ردود الخلية T إلى pDCs من الجهة المانحة. هذا البروتوكول يمكن تكييفها باستبدال pDCs المؤلفان أو مجموع ناقلات الجنود المدرعة، ولكن ضمان أن النسب المستجيب: مشجعا، حيث تشكل مناسبة لتحقيق انتشار معتدلة يمكن التحكم بالخلايا القمعية. في الواقع، أي بنسبة CD4+CD25–تي الخلايا: pDCs ينبغي أن يكون 4:1، بينما نسبة CD4+CD25 ينبغي أن يكون– تي الخلايا: المؤلفان 8:1، وخلايا CD4+CD25– تي الخلايا: ناقلات الجنود المدرعة، 1:1 أو 1:2. النسب تعتمد على اللوريكتيفيتي بين البلدان المانحة والمتلقية؛ النسب المذكورة أعلاه مناسبة للجمع بين LEW.1W:LEW.1A مع رفض حادة التي تحدث في اليوم السابع، ولكن ينبغي اختبار مجموعة نسب المستجيب: مشجعا قبل التضحية بالحيوانات. وأخيراً، كفسي المفضل ل thymidine لتحليل نشاط القمعية، للشواغل المتعلقة بالسلامة والموثوقية. ومع ذلك، ضمان تمييز ممكن بين الخلايا القمعية والمستجيب الخلايا لتحليل كفسي في يوم 6 إذا المستجيب CD4+CD25 يتم استبدال الخلايا T– من إجمالي سبلينوسيتيس. وبالمثل، التأكد من أن الخلايا تي المتبقية بين الخلايا مشجعا لا يمكن أن ينتشر بعد 35 غراي التشعيع.

تصميم نظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ يستند إلى توافر الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 3. بروتوكولات مماثلة يمكن تكييفها لنماذج الفئران، ضمان الطائفة المستهدفة (على سبيل المثال الخلايا النقوي موصوفة متفاوتاً في الماوس وفار).

Allograft القلب هيتيروتوبيك في الفئران نموذج زرع جهاز متين مع فرص كبيرة لرصد نتائج الفساد. بينما طراز allograft الكلي تتسم بوفاة المفاجئة للمستلم، يبلغ جس قوة ضرب الفساد القلب من خلال جدار البطن من39،تطور الاختلاس40. طعم الجلد مصاحبة أو طعم القلب ثاني يمكن أن تتحقق على المستلم allograft القلب لدراسة الذاكرة الردود41. وعلاوة على ذلك، الأدوات الهندسية والبيولوجية أو الكيميائية الجزيئية البيولوجية لاستنفاد أنواع خلايا معينة مثل خلايا ب (IgM كو)، خلايا CD8 (الأجسام المضادة-CD8α)، أو خلايا النقوي (كلودروناتي الدهنية)، أدوات مفيدة لقياس أهمية هذه الخلية ترحيل السكان في تحريض أو الحفاظ على التسامح اعتماداً على الوقت زرع المستنفدة للعلاج حيث تدار ل المستلم1،2،،من34.

حتى الآن، والفئران برجس وخلايا النقوي CD8+تريجس ليست وصفاً جيدا. ويقترح بروتوكولات التسامح التعريفي أعلاه كمرجع لتوصيف الفئران الخلايا التنظيمية1،2،،من34. كذلك يمكن أن يساعد وصف المظهرية لهذه الخلايا ومقارنة بنماذج أخرى من اللوترانسبلانتيشن وغيرها من الأنواع تميز علامات ذات أهمية كبيرة. وفي الواقع، مقارنة برجس من نماذج الماوس للتسامح والمرضى عمليا متسامح تسليط الضوء على غلبة التعبير علامة CD5 أو CD24 كالمؤشرات الحيوية من، برجس3،،من2324 42 , 43 , 44 , 45 . هي overexpressed CD24 في نموذجنا للتسامح الناجم عن AdCD40Ig جنبا إلى جنب مع نضوب CD8α، مقارنة ب الخلايا التي تفتقر إلى النشاط القمعية2. تسلسل الحمض النووي الريبي تعبير الجينات رقمية عالية الإنتاجية برزت مؤخرا كأداة مبتكرة لزيادة تميز الخلايا التنظيمية46.

وأخيراً، يمكن تكييفها مع بروتوكولات للكشف عن وجود خلايا تنظيمية الناجمة عن علاج توليروجينيك نماذج أخرى. هنا استخدمنا LEW.1W في مجموعة LEW.1A ل allograft، تتميز برفض الابتزاز في حوالي 7 أيام. يمكن استخدام تركيبة المقلوب، التي وصفت بأنها أكثر صرامة، وحيث يحدث الرفض الحاد أسرع وأقوى. أمراض المناعة الذاتية نماذج يمكن أيضا الاستفادة من تجربتنا في زرع لفك رموز آليات التعريفي التسامح مع العلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وقد أدركت هذا العمل في سياق المشروع مكتب المفتش العام لابيكس (جوان ANR-11-لابكس-0016-01) الذي يعد جزءا من برنامج الحكومة الفرنسية "يشرف دعفينير" الذي يديره ANR (ANR-11-لابكس-0016-01) ومشروع رامي سيستي تمول أيضا من خلال " يشرف دعفينير "برنامج" الحكومة الفرنسية "، تتم إدارته من قبل الفرنسية الوطنية أبحاث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
animals
LEW.1W and LEW.1A rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
BN third party donor rats Janvier Labs, France 8 weeks old, 
name company catalogue number comments
reagents
AdCD40Ig Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
IL34-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
FGL2-AAV Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France home made plasmids
anti-TCRab Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K R7/3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX39 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX8 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RA Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX33 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K 3.2.3 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/c Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX42 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgd Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K V65 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RC Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX22 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4 Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K OX35 clone Home made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45R BD Biosciences, Mountain View, CA #554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #112-096-071
anti-rat IgG1 Serotec #MCA 194
anti-rat IgG2a Serotec #MCA 278
anti-rat IgG2b Serotec #MCA 195
anti-rat IgM-FITC Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA #115-095-164
streptavidin HRP BD Biosciences, Mountain View, CA #554066
KLH Sigma Aldrich, St. Louis, USA #9013-72-3
PBS 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20 Sigma, Saint-Louis, USA #9005-64-5
TMB substrate reagent kit BD Biosciences, Mountain View, CA #555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit Thermo Fisher Scientific Inc, USA #C34554
RPMI 1640 medium 1X Thermo Fisher Scientific Inc, USA #31870-025
penicilline streptomycine Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15140-122
Hepes Buffer Thermo Fisher Scientific Inc, USA #15630-056
non essential amino acids Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11140-035
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific Inc, USA #11360-039
2 beta mercaptoethanol Sigma, Saint-Louis, USA #M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Thermo Fisher Scientific Inc, USA #65-0842-85
Glutamine Sigma, Saint-Louis, USA #G3126
DAPI Thermo Fisher Scientific Inc, USA #D1306
Collagenase D Roche Diagnostics, Germany #11088882001
EDTA Sigma, Saint-Louis, USA #E5134
NaCl 0.9% Fresenius Kabi #B230561
Magnetic dynabeads Dynal, Invitrogen #11033 Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeads Ebiosciences, San Diego, USA #01-1111-42
Betadine Refer to the institutional guidelines
Isoflurane Refer to the institutional guidelines
Naplbuphine Refer to the institutional guidelines
Terramycine Refer to the institutional guidelines
Buprenorphine Refer to the institutional guidelines
Meloxicam Refer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
Rompun Refer to the institutional guidelines
Ringer lactate Refer to the institutional guidelines
Ketamine Refer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solution Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase D Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
name company catalog number comments
equipments
falcon 50ml BD Biosciences, Mountain View, CA #227261
falcon 15ml BD Biosciences, Mountain View, CA #188271
sieve
Corning plastic culture dishes VWR, Pessac #391-0439
100µm and 60µm tissue filters Sefar NITEX, Heiden, Switzerland #03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning #353077
96 wells V bottom plates for FACS staining ThermoScientifique, Danemark #249570
96 wells flat bottom ELISA plates Nunc Maxisorb
seringue for spleen crush BD Biosciences, Mountain View, CA #309649
ELISA reader SPARK 10M, Tecan, Switzerland SPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiator Lincolshire, England Faxitron CP160
solar agitator
FACS Canto II BD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria II BD Biosciences, Mountain View, CA
magnet Thermo Fisher Scientific Inc, USA 12302D

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Tags

علم المناعة، مسألة 126، فرز الخلايا، والخلايا التنظيمية، تريجس، برجس، ريجمكس، زرع، العلاج الجيني، والمقايسة القمعية، allograft القلب، اللوانتيبودي، ونقل الخلية التبني، الفئران
<em>في المختبر</em> و <em>في فيفو</em> التقييم تي وب وخلايا النقوي النشاط القمعية واستجابات خلطيه من المتلقين زرع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bézie, S., Usal, C.,… More

Bézie, S., Usal, C., Guillonneau, C. In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients. J. Vis. Exp. (126), e55510, doi:10.3791/55510 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter