Här presenterar vi ett protokoll för att inducera tolerans vid transplantation, och bedöma in vitro och i vivo immunstatus hos mottagaren mot givaren eller exogena antigen och distinkta cell delmängder av mottagaren suppressiv kapacitet.
Viktigaste vid transplantation är att uppnå specifika tolerans genom induktion av regulatoriska celler. Förståelsen av tolerans mekanismer kräver pålitliga modeller. Här beskriver vi modeller av tolerans mot hjärt transplantatavstötning hos råtta, inducerad av blockad av costimulation signaler eller av uppreglering av immunoregulatoriska molekyler genom genöverföring. Var och en av dessa modeller gjort i vivo generation av regulatoriska celler såsom regulatoriska T-celler (Tregs), regulatoriska B-celler (Bregs) eller reglerande myeloida celler (RegMCs). I detta manuskript beskriver vi två kompletterande protokoll som har använts för att identifiera och definiera in vitro- och in-vivo reglerande cellsaktivitet för att avgöra deras ansvar i toleransutveckling och underhåll. Först ett in vitro- suppressiv test får snabb identifiering av celler med suppressiv kapacitet på effektor immunsvar på ett dosberoende sätt, och kan användas för vidare analys såsom cytokin mätning eller cytotoxicitet. För det andra, adoptiv överföringen av celler från en tolerant behandlade mottagare till en nyligen bestrålade ympade mottagare, belyst tolerogena egenskaperna av dessa celler i kontroll av transplantat regisserad immunsvar och/eller konvertera ny regulatoriska celler ( kallas smittsamma tolerans). Dessa metoder är inte begränsad till celler med kända fenotypiska markörer och kan förlängas till någon cell befolkningen. Dessutom riktade givare allospecificity av regulatoriska celler (ett viktigt mål i fältet) kan bedömas med hjälp av tredje part donatorcellerna eller transplantat antingen in vitro eller in-vivo. Slutligen, för att fastställa specifika tolerogena kapaciteten av dessa reglerande celler, vi tillhandahåller protokoll för att bedöma de humorala antikroppssvar mot givaren och mottagaren förmåga att utveckla humorala svar mot nya eller tidigare kända antigener. Modeller av tolerans som beskrivs kan användas för att ytterligare karakterisera regulatoriska celler, för att identifiera nya biomarkörer och immunoregulatoriska molekyler, och kan anpassas till andra transplantation modeller eller autoimmuna sjukdomar i gnagare eller människa.
Hjärt transplantatavstötning hos råtta är en pålitlig organ transplantation modell att bedöma tolerans induktion behandlingar, för att dechiffrera mekanismerna av toleransutveckling och underhåll, och har potential att inducera funktionellt behöriga och dominerande regulatoriska celler. Protokollen nedan beskriver ett fullt mismatch heterotopisk hjärt transplantat från en Lewis 1W givare råtta (LEW.1W, RT1u) till en Lewis 1A mottagarens råtta (LEW.1A, RT1en). I denna transplantat kombination, akut avstötning sker snabbt (i ca 7 dagar) och lätt kan bedömas av transplantat slog mätning genom palpation av buken. Här föreslår vi tre protokollen för att inducera tolerans mot den kardiella transplantatavstötning hos råtta. I dessa modeller, tolerans inducerad eller underhålls av olika reglerande celltyper. Första, blockering av CD40-CD40L interaktioner med ett adenovirus som kodning CD40Ig (AdCD40Ig) inducerad generering av CD8+ Tregs kan inducera tolerans när adoptively överförs till sekundära ympade mottagare1. Dessutom utarmning av CD8+ celler (med anti-CD8α antikroppar) i AdCD40Ig-behandlade mottagare genererade Bregs och RegMCs2. Djupgående analys av CD8+ Tregs boenden belyste nyckelroll som flera immunoregulatoriska molekyler definieras som interleukin-34 (IL-34) och Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Medan överuttryck av IL-34 (med en AAV vektor) inducerad Tregs genom generering av RegMCs, inducerad överuttryck av FGL-2 Bregs, underliggande det komplexa nätverket av regulatoriska celler.
Eftersom kronisk avstötning utvecklas långsamt och är långsiktiga, krävs en fördjupad analys för att skilja tolerans mot kronisk avstötning. Transplantat bedöms vanligtvis för cell infiltration, fibros, förtjockning av vaskulära väggen och komplement C4d nedfall av immunohistology7. Medan histologi metoder kräver djuroffer eller ympa biopsi, här beskriver vi en enkel metod för att bedöma olika funktioner av tolererade transplantatavstötning: uppkomst och funktion av regulatoriska celler och anti givare specifika antikroppen svaren från blod urvalet av flödescytometri (här, vi använde fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS)).
Underhåll av tolerans till transplantatavstötning efter gripandet av behandling är allmänt associerade med induktion av regulatoriska celler8. I de sista årtiondena, studier fokuserat på CD4+Tregs enhälligt kännetecknas dem genom de viktiga markörerna Foxp3+, CD25högoch CD127–9,10,11. Likaså flera markörer tillskrevs CD8+ Tregs, som CD122+, CD28–, CD45RClåg, PD1+, och Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. under de åren, uttryck för GITR, CTLA4 och cytokiner (IL-10, TGFβ, IL-34, IL-35, FGL-2) var dessutom associerade till en Treg profil3,4,6,13, 18,19,20,21. Dock saknar framväxande reglerande cellpopulationer, såsom Bregs, RegMCs eller NKTregs, relevanta specifika markörer. Bregs redovisas faktiskt oftast omogna CD24+ celler, med tvetydiga CD27 uttryck och ibland produktion av IL-10, TGFβ eller granzym B22,23,24. Komplexiteten av myeloida cell härstamning kräver en kombination av flera markörer att definiera deras reglerande eller proinflammatoriska profil såsom CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a eller CD16325,26. Slutligen, vissa markörer har rapporterats att identifiera NKTregs såsom CD11b+, CD27+, TGFβ+, men fler studier behövs för att ytterligare fenotypiskt beskriva dem27,28,29 ,30,31,32. Således, bevis av suppressiv aktivitet krävs att legitimera ytterligare fenotypisk beskrivning för identifiering av nya biomarkörer, nya immunoregulatoriska medlare, och utvidga tillämpningsområdet till ny cellterapi.
Vi föreslår två kompletterande metoder för att utvärdera celler suppressiv aktivitet. Först in vitro- metoden består av odlingsskålar suppressiv celler med märkta effektor T-celler stimuleras av allogena givare antigenpresenterande celler (APC) vid olika förhållanden under 6 dagar och analysera effektor T cell spridning som återspeglar givare-riktat immunsystemet. Celler från behandlade råttor kan jämföras direkt till celler från naiva råttor och icke behandlat ympade råttor för suppressiv aktivitet (eller någon annan rättslig cell befolkningen), i en rad suppressor: effektor nyckeltal. Dessutom denna metod kräver inte någon transplantation och resultat inom 6 dagar. Det andra består metoden i vivo av överföring de avsedda regulatoriska cellerna från en behandlade råtta till en nyligen bestrålade ympade mottagare. Medan B-celler, myeloida celler eller T-celler från icke-behandlade naiva råttor är vanligtvis att hämma akut avstötning och förlänga Transplantatöverlevnaden vid överföring, celler med potentierade suppressiv aktivitet från behandlade-mottagare har attributen 1,2,3,4,33. Lymfopeni induceras av bestrålning av mottagaren rekommenderas att tillåta adoptively överförda celler att förbli opåverkad av blod homeostas och behärska lättare immunsvaret mot givaren. För båda metoderna, in vitro- utnyttjande av allogena tredje part trupptransportfordon eller i vivo överföring av suppressiv möjliggöra celler till mottagare som ympats med en tredje part hjärta analys av anti givare specificitet. Metoden i vivo kräver ett betydande antal celler, dåligt representerade kan cellen subpopulations bedömas mer enkelt för suppressiv aktivitet in vitro-33.
Humorala svar kan också mätas för att bedöma tillståndet för tolerans och kontroll av riktad antikroppssvaret mot givaren antigener. Tolerans kan faktiskt kännetecknas av avsaknad av humorala svar mot givaren men bevarande av kapacitet för mottagarna att utveckla humorala svar på nya antigener och bevarandet av minnet svaren. Första är principen om alloantikropp upptäckt baserad på erkännande av donatorcellerna av mottagarens antikroppar efter inkubering av givare celltyp med serum från en ympade mottagare. Andra, humorala svar riktas mot exogena antigen kan vara bedömda följande stimulering av långsiktiga tolerant mottagare med Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) emulgerade med komplett Freund’s adjuvans. Förekomst av specifika IgM och IgG antikroppar mot antigen kan påvisas 4 och 13 dagar, respektive, efter immunisering, med enzym länkade ImmunoSorbent Assay (ELISA)34. För det tredje, bevarandet av immunologiskt minne Svaren kan bedömas genom injektion av xenogena röda blodkroppar (RBC) dagar -7 och + 3 av transplantation och röda blodkropparna färgning med mottagarens serum insamlade dagar + 8 och + 17 efter transplantation. Alla dessa metoder möjligt för identifiering av immunglobulin subtyper med specifika sekundära antikroppar, och snabb förvärv av resultat i mindre än 1.5 h av FACS färgning eller ett par timmar med ELISA.
Slutligen, dessa protokoll är utformade för karaktärisering av transplantation modeller, och kan vara, delvis, tillämpas på autoimmun sjukdomsmodeller. Principerna för metoden kan överföras till alla arter.
Överföring av totala splenocytes till en nyligen ympade mottagare är ett effektivt sätt att upptäcka förekomsten av regulatoriska celler induceras eller förstärkte genom en behandling. Värd bestrålning-inducerad övergående lymfopeni främjar cellöverlevnad efter överföring och inrättandet av tolerans. Dessutom lämnar subletala bestrålning tid för celler med tolerogena egenskaper att konvertera till nya regulatoriska celler under immun beredning, ett fenomen som kallas smittsamma tolerans<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete genomfördes inom ramen för projektet Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) som ingår i programmet ”Investissements pris” franska regeringen förvaltas av ANR (ANR-11-LABX-0016-01) och av IHU-Cesti projektet finansieras också av den ” Investissements pris ”franska regeringen program, förvaltas av den franska nationella Research Agency (ANR) (ANR-10-IBHU-005). IHU-Cesti projektet stöds även av Nantes Métropole och Région Pays de la Loire.
animals | |||
LEW.1W and LEW.1A rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
BN third party donor rats | Janvier Labs, France | 8 weeks old, | |
name | company | catalogue number | comments |
reagents | |||
AdCD40Ig | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
IL34-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
FGL2-AAV | Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, France | home made plasmids | |
anti-TCR | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | R7/3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD25 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX39 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD8 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX8 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RA | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX33 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD161 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | 3.2.3 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD11b/c | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX42 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-TCRgd | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | V65 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45RC | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX22 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD4 | Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K | OX35 clone | Home made culture, purification and fluororophore coupling |
anti-CD45R | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554881, His24 clone | |
anti-rat IgG-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #112-096-071 | |
anti-rat IgG1 | Serotec | #MCA 194 | |
anti-rat IgG2a | Serotec | #MCA 278 | |
anti-rat IgG2b | Serotec | #MCA 195 | |
anti-rat IgM-FITC | Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA | #115-095-164 | |
streptavidin HRP | BD Biosciences, Mountain View, CA | #554066 | |
KLH | Sigma Aldrich, St. Louis, USA | #9013-72-3 | |
PBS 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | Phosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, | |
Tween 20 | Sigma, Saint-Louis, USA | #9005-64-5 | |
TMB substrate reagent kit | BD Biosciences, Mountain View, CA | #555214 | |
CellTraceTM CFSE cell proliferation kit | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #C34554 | |
RPMI 1640 medium 1X | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #31870-025 | |
penicilline streptomycine | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15140-122 | |
Hepes Buffer | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #15630-056 | |
non essential amino acids | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11140-035 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #11360-039 | |
2 beta mercaptoethanol | Sigma, Saint-Louis, USA | #M3148 | |
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #65-0842-85 | |
Glutamine | Sigma, Saint-Louis, USA | #G3126 | |
DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | #D1306 | |
Collagenase D | Roche Diagnostics, Germany | #11088882001 | |
EDTA | Sigma, Saint-Louis, USA | #E5134 | |
NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | #B230561 | |
Magnetic dynabeads | Dynal, Invitrogen | #11033 | Goat anti-mouse IgG |
One Comp eBeads | Ebiosciences, San Diego, USA | #01-1111-42 | |
Betadine | Refer to the institutional guidelines | ||
Isoflurane | Refer to the institutional guidelines | ||
Naplbuphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Terramycine | Refer to the institutional guidelines | ||
Buprenorphine | Refer to the institutional guidelines | ||
Meloxicam | Refer to the institutional guidelines | ||
Complete Freund's adjuvant | |||
Rompun | Refer to the institutional guidelines | ||
Ringer lactate | Refer to the institutional guidelines | ||
Ketamine | Refer to the institutional guidelines | ||
Red blood cell lysis solution | Dilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O. | ||
Collagenase D | Dilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS | ||
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%) | Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X | ||
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen) | Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution | ||
complete medium for coculture | 500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS | ||
name | company | catalog number | comments |
equipments | |||
falcon 50ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #227261 | |
falcon 15ml | BD Biosciences, Mountain View, CA | #188271 | |
sieve | |||
Corning plastic culture dishes | VWR, Pessac | #391-0439 | |
100µm and 60µm tissue filters | Sefar NITEX, Heiden, Switzerland | #03-100/44 and #03-60/35 | |
96 wells U bottom plates for coculture | Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning | #353077 | |
96 wells V bottom plates for FACS staining | ThermoScientifique, Danemark | #249570 | |
96 wells flat bottom ELISA plates | Nunc Maxisorb | ||
seringue for spleen crush | BD Biosciences, Mountain View, CA | #309649 | |
ELISA reader | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | SPARK 10M, Tecan, Switzerland | |
centrifuge | |||
bain marie | |||
X rays irradiator | Lincolshire, England | Faxitron CP160 | |
solar agitator | |||
FACS Canto II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
FACS Aria II | BD Biosciences, Mountain View, CA | ||
magnet | Thermo Fisher Scientific Inc, USA | 12302D |