Introduction
Dans l' ingénierie tissulaire et les biocapteurs, la capacité de contrôler l'organisation spatiale des protéines et des cellules sur une échelle de um, est devenue de plus en plus importante au cours des quatre dernières décennies 1, 2, 3. Organisation spatiale précise des protéines et des cellules a permis aux chercheurs d'étudier les interactions entre les cellules et les substrats contenant des types de cellules semblables ou différentes, afin de guider la croissance cellulaire, et pour immobiliser des biomolécules pour la fabrication de biocapteurs 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Les méthodes actuelles de protéines de motifs comprennent photopatterning et l'impression par microcontact. Photopatterning utilise un matériau sensible à la lumière qui est réticulée par exposition à ultrun violet (UV). La lumière UV dirigée sur un masque photographique (composé de régions transparentes avec des zones sombres pour empêcher la transmission de la lumière UV) provoque la réticulation dans des régions spécifiques qui peuvent ensuite être utilisées pour la fixation ultérieure des matières biologiques ou des cellules 10, 11. Tandis que ce schéma est très précis et permet un contrôle précis de la topographie de la surface de culture, elle est limitée aux biomolécules sensibles aux UV qui peuvent être modelées par un rayonnement UV 12. L' impression microcontact est une autre méthode populaire de structuration des protéines spécifiques 13, 14. Dans ce procédé, un siloxane (PDMS) tampon poly-diméthyl est traité avec une variété de réactifs de modification de surface avant d'être trempé dans une solution du substrat choisi biomoléculaire. Il est ensuite doucement pressé sur une lamelle de verre ou une autre surface ainsi "estampage" la biomolécule sur la surface de culture. HoWever, l' estampage est limité au type de matériau qui peut être transféré, ainsi que la mouillabilité de biomolécules à la surface du PDMS timbre 15.
Structuration directe des cellules peut être plus difficile et repose sur des méthodes complexes tels que des substrats commutables, les méthodes de pochoir sur la base, ou un motif avec des molécules spécifiques d'adhésion cellulaire 16, 17. Ces procédés sont limités dans leur capacité à des cellules de motif en raison de l'absence de substrats d'adhérence cellulaire compatible, l'incompatibilité du processus de travailler avec des cellules sensibles et des contraintes biologiques, des incohérences dans la reproduction du motif et de la complexité de la procédure. Par exemple, avec des substrats commutables, personnalisés substrats doivent être conçus pour chaque type de cellule, pour passer leur adhésion à des types cellulaires spécifiques sans dégradation lors de l' exposition à la lumière UV et la chaleur utilisée dans le processus 17, < classe sup = "xref"> 18, 19, 20. les méthodes de mise en forme à base de pochoirs sont polyvalents dans leur capacité à cellules de motif; cependant, il est difficile de fabriquer des stencils en PDMS les épaisseurs appropriées pour une utilisation 16, 21. L'injection directe de cellules dans des canaux microfluidiques PDMS ont certains avantages tels que: 1) faciliter dans la fabrication de canaux microfluidiques et 2) aptitude pour de nombreuses cellules et substrats différents. Cependant, la question courante de capture de bulles d'air pendant le processus d'injection en raison de l'hydrophobie de PDMS sans l'utilisation de nettoyage au plasma, ou d' autres méthodes pour réduire les bulles d'air, il est difficile de créer systématiquement des cellules à motifs sur les surfaces en verre ou en plastique 21.
Ce travail se développe sur capillaire micromoulage 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 et signale une méthode pour injecter de protéines et de cellules suspensions dans des microcanaux. La méthode utilisée ici démontre la structuration de substrats et à la fois un motif direct et indirect des types cellulaires spécifiques. Cette technique permet de surmonter la forte hydrophobicité du PDMS et élimine la présence de bulles lors de l' injection , soit des substrats ou des cellules en tirant profit de la perméabilité aux gaz de PDMS 27. Ce document illustre l'utilisation de la technique avec plusieurs substrats différents et des types de cellules. L'article souligne également la fabrication de moules pour la lithographie douce utilisant la photolithographie classique ainsi qu'une méthode simple et adhésif à faible coût bande utile dans des ressources limitées paramètres 28, 29.
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Protocol
NOTE: S'il vous plaît consulter toutes les fiches de données de sécurité des matériaux pertinents (MSDS) avant utilisation. Certains des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et cancérigènes. S'il vous plaît utiliser toutes les pratiques de sécurité appropriées (hottes, glovebox) et l'équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons pleine longueur, des chaussures fermées) lors de l'utilisation de matériaux toxiques ou de l'acide / base.
1. Fabrication de maître moules pour la lithographie douce en utilisant la photolithographie
- Dessinez la disposition des microcanaux en utilisant un outil de dessin de conception assistée par ordinateur (CAO).
- Imprimer la mise en page sur une plaque de masque blanc en utilisant un masque laser écrivain.
- Rinçage d'une plaque de silicium de 4 pouces avec de l'acétone suivi par de l'isopropanol et séché avec un pistolet à air d'azote pour s'assurer qu'aucun solvant ne soit laissée sur la plaquette.
- Déshydrater la plaque par cuisson sur une plaque chauffante à 200 ° C pendant 5 min.
- Choisir une résine photosensible négative destiné à la hauteur désirée des microcanaux. Fou par exemple, utiliser photorésist négatif SU-8 50 pour obtenir des microcanaux avec une hauteur de 50 um.
- Laisser la plaquette refroidir à la température ambiante, puis aligner la plaquette sur le mandrin d'une tournette.
- Distribuer 4 ml (1 ml diamètre / pouce) de la plaque de résine photosensible négative sur le centre de la plaquette.
- Spin revêtir la plaquette avec un cycle d'essorage en deux étapes en utilisant un spinner. Tout d'abord, appliquer un cycle de propagation de 500 tours par minute avec une accélération de 100 tr / s pendant 10 s. Appliquer ensuite un cycle de rotation de 2000 tours par minute avec une accélération de 300 tours par minute / s 2 pendant 30 secondes pour obtenir un revêtement de 50 um de résine photosensible sur une plaquette.
- cuisson douce la plaquette en deux étapes sur une plaque chaude selon les instructions du fabricant. Pour un revêtement de 50 um de résine photosensible, d'abord pré-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 6 min, puis la rampe immédiatement la température de la plaque chaude post-bake la plaquette à 95 ° C pendant 20 min.
- Laisser la plaquette refroidir à température ambiante, puis charger lewafer sur la scène de la lithographie.
- Alignez le masque sur la tranche en utilisant un masque d' alignement et d' exposer la plaquette à la lumière UV (selon les instructions du fabricant) à une intensité de 1,5 mW / cm 2 pour 146 s pour appliquer la dose totale d'UV de 220 mJ / cm 2 requise pour un 50 um d'épaisseur couche de résine photosensible.
- Appliquer post-cuisson de l'exposition à la tranche en deux étapes sur une plaque chauffante. Pour un revêtement de 50 um de résine photosensible, d'abord pré-cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min et immédiatement rampe jusqu'à la température de la plaque chaude post-bake il à 95 ° C pendant 5 min.
- Développer la plaquette en immergeant la plaquette dans SU-8 développeur et en secouant doucement jusqu'à ce que les caractéristiques deviennent claires sur la plaquette. Développer la plaquette pour ~ 6 min pour les 50 um d'épaisseur photoresist.
- Rincer l'excès développeur avec de l'isopropanol et de l'éthanol, puis sécher la tranche avec un pistolet à air d'azote.
- Dur cuire au four la plaquette de silicium sur une plaque chaude à 150 ° C pendant 15 min.
- Placer lela plaquette dans un dessicateur avec 25 uL de l'agent de silanisation tridécafluoro-1,1,2,2-tétrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
NOTE: L'agent de silanisation est corrosif, devrait donc être utilisé dans une hotte acide / base, avec des équipements de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse, pantalon de longueur, fermé orteils chaussures). - Appliquer le vide pendant 5 min et exposer la plaquette aux vapeurs de silane pendant 30 minutes sans relâcher le vide.
- Transférer la tranche dans une boîte de Pétri de taille appropriée.
2. Fabrication de maître moules pour la lithographie douce avec du ruban adhésif
- Dessinez la disposition des microcanaux en utilisant un outil de dessin CAO et imprimer le dessin sur papier blanc.
- Nettoyer une lame de verre assez grand pour accueillir la conception avec de l'isopropanol, puis sécher la lame avec un pistolet à air.
- Attacher du ruban adhésif sur la lame de verre nettoyé. Veillez à ne pas piéger les bulles d'air.
- Collez les côtés de la glass glisser sur le papier avec la conception, avec la bande vers le haut.
- Utiliser un scalpel pour couper le ruban sur la lame de verre en utilisant la conception de papier comme une référence, puis décoller la bande dans les zones non désirées de la lame de verre.
- Rincer la lame de verre avec de l'isopropanol, puis sécher avec un pistolet à air. Cuire la lame de verre dans un four à 65 ° C pendant 30 min.
- Roulez doucement sur la bande avec un rouleau en caoutchouc pour éliminer les bulles d'air et permettre à la diapositive à refroidir à la température ambiante.
3. lithographie douce Fabrication des dispositifs PDMS
- Mélanger PDMS élastomère et son agent de durcissement dans un rapport de 10: 1 (p: p), agiter vigoureusement le mélange, puis dégazer le mélange en le plaçant dans une chambre à vide jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air apparaissent dans le mélange.
- Verser le mélange sur un moule de silicium silanisé ou moule de ruban adhésif dans une boîte de Pétri pour obtenir un ~ 2 mm d'épaisseur de couche de PDMS et dégazer jusqu'à ce que tout l'air des bulles disparaissent.
- Cure les PDMS dans un fourà 65 ° C pendant 2 h.
- Utilisez un scalpel pour couper la couche PDMS au moins 5 mm des caractéristiques puis peler les PDMS durcis hors du moule en utilisant pincette.
- Poinçonner un trou d' entrée avec un poinçon de 1 mm biopsie n'importe où sur le micro - canal, de préférence à l'extrémité d'un réseau de micro - canaux comme on le voit sur la figure 2a et 4b.
- Nettoyez les PDMS exprimés avec du ruban adhésif pour éliminer les particules de poussière adsorbées sur le dispositif. Stériliser le dispositif à microcanaux PDMS (PDMS coulée) par un rinçage avec une solution d'éthanol à 70% suivie d'une déminéralisée stérile (DI), et d'exposer aux rayons UV pendant 30 min.
- Gardez le dispositif de PDMS stérile dans une boîte de Pétri stérile jusqu'à utilisation.
4. Substrat Patterning
- Placez les PDMS stériles exprimés en utilisant des pinces sur une lamelle de verre stérile ou boîte de Pétri et appliquer une légère pression à l'aide de la pointe de la pince à épiler.
NOTE: Le casting de PDMS fait un conformationnelle mais joint réversible avec le gllamelle de cul ou de boîte de Pétri formant des microcanaux sans utilisation de tout adhésif. - Placer une goutte (20 - 40 pi) de la solution de substrat à l'entrée recouvrant complètement l'orifice d'entrée. Motif poly-D-lysine (PDL) en plaçant une goutte de 20 pi de PDL dans un tampon de tetraborate de sodium à l'entrée des microcanaux.
- Mettez la boîte de Pétri dans un vide de ~ 254 mmHgA (équivalent à la maison vide dans les laboratoires biologiques) pendant 10 min, et observer l'air sortant du canal sous la forme de bulles.
- Libérer le vide et à observer la solution de substrat circulant dans le microcanal.
- Incuber le plat dans les conditions appropriées pour le substrat adhérence. Voir les tableaux 1 et 2 pour des conditions d'incubation (ceux - ci varient en fonction du substrat). Pour PDL patterning, incuber pendant 1 h à 37 ° C.
- Décollez délicatement le timbre PDMS en utilisant des pinces stériles et laver le motif sur lamelle de verre trois fois avec de l'eau DI. Ajouter 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) à une solution à la boîte de Petri pour couvrir la cuvette ou de la lamelle couvre-objet en verre et on incube pendant une nuit à 37 ° C.
NOTE: Cela permettra de réduire l'adhérence non spécifique dans les régions non revêtues. - Aspirer la solution de BSA à 1%, et le substrat à motifs est maintenant prêt à utiliser.
5. Modélisation indirecte des cellules
- Préparer la suspension cellulaire dans un milieu de culture sans sérum. Le type de cellule et la densité cellulaire sont énumérées dans le tableau 1.
- Ajouter la suspension cellulaire à la boîte de Pétri à motifs et submerger complètement la région à motifs en suspension cellulaire.
- Incuber la boîte de Pétri à 37 ° C dans un incubateur pendant 15 minutes pour permettre aux cellules de se fixer sur le substrat à motifs.
- Aspirer la suspension cellulaire en excès de la boîte de Pétri et laver les cellules à motifs à trois reprises avec un tampon phosphate salin (PBS) en agitant doucement pendant 10 s pour éliminer les cellules seules.
- Ajouter l'unppropriate milieu de culture pour les cultures de cellules modelées et incuber les cellules modelés à 37 ° C dans un incubateur à CO2.
6. La structuration directe des cellules
Remarque: cette technique est une alternative à la formation de motifs de cellule indirecte décrite à l'étape 5. Cependant, contrairement à l'étape 5, dans cette technique, les cellules sont modelés sur des surfaces de culture de tissu avec ou sans revêtement de substrat.
- Stériliser le dispositif microfluidique par rinçage avec une solution de 70% d'éthanol puis de l'eau déminéralisée.
- Faire tremper l'appareil pendant une nuit dans une solution de 1% de BSA pour empêcher l'adhérence des cellules au PDMS.
- Sécher le dispositif à la température ambiante et l'attacher au fond de la boîte de Pétri de culture de tissu traité.
- Préparer la suspension de cellules dans un milieu de culture sans sérum. Le type de cellule et la densité cellulaire sont répertoriés dans le tableau 2.
- Placez une goutte (4-8 pi) de la suspension cellulaire, assez pour remplir lamicrocanaux, à l'entrée recouvrant complètement l'orifice d'entrée.
- Mettez la boîte de Pétri dans un vide pendant 10 min et observer l'air sortant du canal sous la forme de bulles. Relâchez le vide et observer la suspension de cellules circulant dans le microcanal.
- Incuber la boîte de Petri dans un incubateur pour favoriser l' adhésion cellulaire selon les conditions d'incubation ( en fonction du type de cellule à motifs) mentionnés dans le tableau 2. Ajouter PBS à la boîte de Pétri submergeant le dispositif PDMS.
- Peler le PDMS avec précaution la boîte de Pétri avec des pincettes et laver le modèle avec du PBS. Ajouter un milieu de culture cellulaire pour la boîte de Petri et placer la culture de cellules dans l'incubateur.
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Representative Results
Cette méthode permet la structuration des protéines et des motifs indirecte des cellules en utilisant des impasses canaux microfluidiques avec des dimensions aussi petites que 10 um et de l'équipement disponible dans presque tous les laboratoires biologiques une fois que le moule maître est faite. Cette technique peut être utilisée avec des canaux microfluidiques PDMS créés en utilisant la photolithographie traditionnelle douce, ou avec des canaux microfluidiques PDMS créés avec du ruban adhésif de fabrication (figure 1) 28, 29. Nous avons précédemment démontré que l'utilisation de cette procédure dans la structuration indirecte des cellules neuronales pour l' évaluation de guidage axonal dans les photorécepteurs 4, 30, et nous avons maintenant mis en évidence son utilisation dans plusieurs types de cellules supplémentaires d'origines diverses. rat embryonnaire neurones corticaux calqué sur le poly-D-lysine (PDL) et des surfaces de laminine démontrent adherenc généralee dans les zones à motifs et la croissance le long du PDL et des bandes de laminine (Figure 3A). C2C12 des lignées de cellules de myoblastes adhèrent également à la zone à motifs et démontrent en myotubes multinucléés fusion (figure 3B). Nous avons également adapté cette technique pour la formation de motifs directe de la cellule comme on le voit avec des fibroblastes de la figure 4. Comme indiqué précédemment, cette méthode de mise en forme directe de la cellule n'a montré aucun effet néfaste sur la survie des cellules 30. Les variables qui mènent à la réussite de la structuration directe ou indirecte des types cellulaires indiqués sont énumérés dans le tableau 1 et 2. Ainsi, dans l'avenir, les chercheurs peuvent utiliser cette technique à des cellules de motif et de découvrir les phénomènes liés à la formation de motifs précis.
Figure 1: Fabrication de moules par lithographie douce. Gauche: Photolithographieprocessus y. SU-8 est appliquée par centrifugation sur une tranche de silicium, exposée à un rayonnement UV, et développé pour éliminer l'excès de SU-8. Droit: Adhésif procédé de fabrication de bande. Ruban adhésif est fixé sur une lame de verre propre, couper avec un scalpel, et la bande en excès est éliminé avec précaution. PDMS cast est ensuite fabriqué à partir de chaque moule en utilisant la lithographie douce. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Exemple d'un dispositif de PDMS pour Substrat Patterning. (A) PDMS fonte microfluidique avec entrée utilisée pour la structuration microfluidique de substrats. Inlet a été percé à une extrémité de microcanaux. (B) du canal microfluidique comme on le voit sous un microscope à contraste de phase. des canaux microfluidiques sont de 15 mm de longueur, 20 m de large, unD séparés par 200 um. Figure 2 est reproduit avec la permission de IOP Publishing. Tous droits réservés 30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Indirect cellulaire Modélisation. (A) le processus de formation de motif de la protéine par le vide. dispositif de canal microfluidique PDMS est attaché à une boîte de Pétri, solution de substrat est chargé dans l'entrée, le vide est brièvement appliquée à la chambre et libéré, le dispositif PDMS est retiré, le motif est lavé, et prêt à utiliser. (B) des neurones de rat corticales embryonnaires ensemencées sur une lamelle couvre -objet avec un substrat de PDL et de la laminine à motifs. Lignes (c) C2C12 de cellules myoblastes cultivés sur un motif PDL et la laminine. Les figures 3a et 3c sont reproduits avec permission de IOP Publishing. Tous droits réservés 30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Direct Mobile Patterning. (A - c) Fibroblastes motifs via un motif cellulaire direct. (A) dispositif de canal microfluidique fabriqué en utilisant du ruban adhésif lithographie. (B) des canaux microfluidiques après le remplissage avec la suspension de cellules de fibroblastes en utilisant un vide assisté par la technique de formation de motifs. (C) FIBROBLASTES après le retrait du dispositif microfluidique. (D) de la calcéine-AM après coloration des fibroblastes patterning microfluidique. image de contraste (e) de la phase de fibroblastes après motif microfluidique. (F - g 30. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Indirect Cellule Modélisation | Substrat | Protein Conditions d' incubation | Densité cellulaire | Cell Adhesion Durée |
| PC12 | Le collagène 1 | 1 h à 50 ° C, | 5 x 10 6 / ml | 1 h à 37 ° C, |
| Fibroblast | Le collagène 1 | 1 h à 50 ° C, | 5 x 10 6 / ml | 1 h à 37 ° C, |
| C2C12 | PDL + laminine | 1 h à 37 ° C, lavent du PBS pendant une nuit à 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min à 37 ° C, |
| Embryonic Rat neurones corticaux | PDL + laminine | 1 h à 37 ° C, lavent du PBS pendant une nuit à 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min à 37 ° C, |
| Salamander Retinal Neurones | Sal-1 | pendant une nuit à 10 ° C, | N / A | 1 h à 10 ° C, |
Tableau 1: indirects Cellule patterning Conditions. Liste des conditions d'incubation, tels que le type de substrat, le temps, la température et la densité cellulaire pour des types cellulaires typiques. Les chercheurs devraient optimiser les conditions d'incubation pour leurs propres substrats modèles et le type de cellule. Sal-1 est le substrat de l'anticorps utilisé pour la culture Salamandre neurones de la rétine.
| Direct Mobile Patterning | Substrat | Densité cellulaire | Temps Cell Adhesion |
| PC12 | Le collagène 1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h à 37 ° C, |
| Fibroblast | Le collagène 1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h à 37 ° C, |
| C2C12 | PDL + laminine | 2 x 10 6 / ml | 15 min à 37 ° C, |
| Embryonic Rat neurones corticaux | PDL + laminine | 2 x 10 6 / ml | 15 min à 37 ° C, |
| Salamander Retinal Neurones | Sal-1 | N / A | 1 h à 10 ° C, |
Tableau 2: Cellule patterning directs Conditions. Liste des conditions d'incubation telles que la température, le temps et la densité cellulaire pour des types cellulaires typiques. Les chercheurs devraient optimiser les conditions d'incubation pour leur propre type de cellule du modèle.
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Discussion
Alors que la photolithographie classique est une technique bien établie pour la création de moules pour la lithographie douce, l'équipement, les matériaux et les compétences nécessaires pour utiliser la photolithographie classique ne sont pas facilement disponibles pour la plupart des laboratoires. Pour les laboratoires sans accès à ces ressources, nous avons présenté un ruban adhésif de fabrication comme une méthode de création de moules avec des caractéristiques relativement simples pour les dispositifs microfluidiques. Cette méthode permet à tout laboratoire de créer et d'utiliser des dispositifs microfluidiques à des fins de recherche avec des outils facilement disponibles. La méthode du ruban adhésif peut être améliorée avec un cutter bureau vinyle à faible coût 31. coupeurs de vinyle de bureau peuvent augmenter la reproductibilité, la résolution, ainsi que la complexité de la mise en page. Chacune de ces options, photolithographie classique, cutters de bureau, ou du ruban adhésif de fabrication ont différentes capacités et les limites et les chercheurs doivent examiner attentivement méthode qui serait suffisantepour leurs besoins.
Dans PDMS durcies, les longues chaînes polymères de diméthylsiloxane forment un réseau, la structure nanoporeuse qui crée des zones vides qui peuvent être remplis avec des molécules d'air 27. Cette propriété perméable au gaz est la clé de notre méthode de remplissage des canaux microfluidiques. Lorsqu'il est placé dans un environnement à basse pression, les molécules d'air sont éliminées de la matière en vrac PDMS ainsi que les microcanaux 25 eux - mêmes. Lorsque le PDMS est ensuite exposé à la pression atmosphérique, et le matériau en vrac microcanaux PDMS conservent une pression négative pendant un certain temps 25, 30. Cette pression négative tire liquide dans les microcanaux de remplissage automatique des canaux microfluidiques. Cette pression négative continue à aspirer le liquide dans le canal jusqu'à ce que les PDMS en vrac équilibre avec la pression atmosphérique.
Cette technique assistée par aspiration permet patterning de protéines et de substrats spécifiques sur un substrat de croissance. Dans cette étude, nous avons pu le modèle de plusieurs substrats différents et types de cellules à la fois directement et indirectement (tableau 1 et 2). Cependant, l'expérimentateur peut avoir besoin de tester différents temps d'incubation, les densités cellulaires, ou des milieux d'ensemencement pour leur type cellulaire particulier. Ces variables se rapportent probablement la capacité innée soit de la cellule ou d'un substrat d'adhérer à la surface sur laquelle il est placé sur. Par exemple, ici C2C12 cellules nécessaires à l'utilisation des milieux sans sérum pour les médias d'ensemencement avant la culture des cellules dans du DMEM avec du sérum de cheval à 2%. En outre, les conditions peuvent varier en fonction de savoir si une lamelle de verre ou de boîte de Pétri en plastique est en cours à motifs. Ici, les deux ont bien fonctionné pour permettre la structuration spécifique de différents types de cellules.
L'une des préoccupations initiales que nous avions tout en utilisant cette technique était comment l'exposition à vide pourrait affecter la viabilité cellulaire. Cette étude et pDes études revious devraient toutefois atténuer ces préoccupations que nous avons montré que le vide a peu d'effet sur une variété de cellules 30. Wang et al. utilisés précédemment dégazé irréversiblement scellé chambres microfluidiques pour charger les cellules HeLa 32. D' autres études ont utilisé des cellules ensemencement par aspiration pour une variété de types cellulaires , y compris les cellules humaines souches, les cellules adhérentes et non adhérentes, et lignée de cellules hybrides homme-hamster (A L) , des cellules à charger dans des canaux microfluidiques 33. En outre, d' autres chercheurs ont soumis les cellules à beaucoup plus des pressions de vide par rapport à cette étude avec peu ou pas d' effet discernable sur les cellules 33. Les bulles formées au cours de l'évacuation de l'air des micro-canaux ont tendance à se rassembler sur la surface de la gouttelette de la suspension à l'entrée. Souvent, ces bulles ne se rompent pas à cause de la tension superficielle de la suspension. Nous avons pas OBSERVed une diminution sensible de la viabilité cellulaire dus à des bulles. En outre, l'expérience avec la calcéine-AM ne suggère pas une diminution significative de la viabilité cellulaire. À cause de cela, on n'a pas examiné à fond la mort cellulaire spécifiquement due à des bulles.
Les tentatives précédentes sur des substrats de motifs ou de cellules étaient souvent en proie à des problèmes tels que la formation de bulles d'air dans les dispositifs microfluidiques. La formation de bulles d'air, il est difficile d'injecter facilement et efficacement des liquides sans l'utilisation de l'équipement ou des matériaux qui ne sont pas disponibles dans la plupart des laboratoires. Par exemple, les méthodes antérieures utilisées à l'utilisation d' un traitement par plasma ou un traitement par effet couronne pour diminuer l'hydrophobie de micro - canaux 15, 34 PDMS. Bien qu'efficace, le plasma et traitement corona ne sont pas facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Dans ce protocole, nous démontrons la capacité de cellules de motifs et de substrats utilisant simplement labora communaspirateurs tory. En utilisant la technique de fabrication de ruban adhésif, la méthode peut être utilisée pour créer des PDMS canaux microfluidiques à des substrats de motifs ou de cellules dans presque tous les laboratoires.
Pour des substrats de motifs ou de cellules avec le protocole de mise en forme sous vide, plusieurs étapes sont essentielles pour la structuration réussie. Tout d'abord, pour fabriquer le maître de ruban adhésif, ruban adhésif doit être complètement attaché à la lame de verre et exempt de bulles d'air. Les bulles d'air affaiblir le lien entre le ruban et la lame de verre et peut conduire à la bande étant décollée quand guéri PDMS est décollé du moule de ruban adhésif. En outre, les bulles vont déformer la géométrie du canal microfluidique provoquant la surface des canaux pour être non plane. Pour rendre les PDMS exprimés de SU-8 moule, le moule SU-8 doit être silanisé avant la coulée avec PDMS. Cette étape est essentielle dans la prévention de la liaison permanente de PDMS au moule SU-8 après le durcissement du PDMS. Avant le scellement conformationnelledu canal microfluidique PDMS à des lamelles en verre ou des boîtes de Petri en matière plastique, le PDMS doit être nettoyé de toutes les particules de poussière. Ces particules peuvent empêcher la formation d'un joint d'étanchéité entre conformationnelle PDMS et du verre et ainsi empêcher l'injection des cellules ou des substrats dans le canal microfluidique. Comme indiqué dans le protocole ci-dessus, le nettoyage des canaux de PDMS avec du ruban adhésif est essentiel avant d'adhérer microcanal à des lamelles de verre ou des boîtes de Petri en plastique. Enfin, après mise en place dans la chambre à vide de l'appareil, le vide doit être libéré lentement pour empêcher le déplacement de la goutte de solution de substrat ou d'une cellule à partir du trou d'entrée.
Si aucun fluide est observé circulant dans le canal microfluidique, il peut y avoir une fuite dans le canal microfluidique qui empêche le liquide de circuler dans le canal. Enlevez le tampon de PDMS, sec et nettoyer puis répétez l'étape 4, 5 ou 6 de la technique. Si la solution ne coule pas dans le microcanal après release de vide, assurez-vous que la solution couvre complètement l'entrée du microcanal. Cela peut être fait en pipetant une solution de haut en bas plusieurs fois en le mettant dans l'orifice d'entrée. Si le substrat, après l'injection dans le microcanal, ne se fixe pas sur le verre, d'évaluer et de déterminer les conditions d'incubation optimales nécessaires pour le substrat utilisé. Si le retrait des PDMS exprimés à la surface de verre ou de boîte de Pétri en plastique provoque des cellules ou des substrats à motifs à détruire, utiliser un diluant coulé PDMS, submerger les PDMS exprimés dans du PBS ou des médias, et lentement et retirez délicatement les PDMS exprimés à partir du verre ou surface en plastique avec des pincettes.
Enfin, la BSA peut être critique dans la diminution de l'adhérence non spécifique des cellules soit le verre sans motif ou surface en plastique. BSA est généralement utilisé en tant que réactif de blocage dans le buvardage de Western, une immunocoloration et d'autres techniques de biologie moléculaire. D'autres chercheurs ont également utilisé pour indirect ou directles protocoles de mise en forme pour diminuer l' adhérence des cellules non spécifiques 35, 36, 37. Nous avons trouvé que l'incubation du substrat avec de la BSA a été nécessaire pour la plupart des types cellulaires à l'exception des cellules de la rétine de salamandre. Cela peut être en raison de la nature plus spécialisée du substrat (un anticorps appelé Sal-1) qui a été utilisé, ainsi que le manque général d'adhérence cellulaire par ce type de cellule 38. Dans nos mains, BSA n'a pas non plus diminuer sensiblement l'adhérence des cellules dans les zones à motifs et principalement servi à diminuer l'adhérence non spécifique.
Bien que cette méthode est conçu pour être polyvalent et flexible dans son application à différents types de substrats et de cellules, il existe plusieurs limites à ce protocole et les cellules compatibles et substrat. En raison de la nature même de la formation de motifs sur une surface des cellules, les types que cette technique peut être appliquée à des cellules sont limitées à thosoi qui sont susceptibles à un protocole de mise en forme telles que des cellules qui sont capables de survivre avec plusieurs cellules limitées à un contact cellulaire ainsi que ceux qui peuvent survivre à des concentrations d'ensemencement de cellules inférieures. Par exemple, une application potentielle est la formation de motifs de cellules de levure pour la microscopie à force atomique (AFM) 39. Alors que nous avons testé de nombreux substrats cellulaires différents, d'autres substrats ne peuvent pas fonctionner avec cette technique particulière, comme ceux qui forment des gels tridimensionnels. A ce moment, on n'a pas examiné si les gels forment correctement et rester sur la surface de la lamelle de verre ou de boîte de Pétri plastique après motif. Cette technique est capable de modeler des formes complexes et de grandes surfaces. Cependant, il ne peut pas motif un éventail de formes séparées individuelles sans interconnexion microcanaux. En l'absence de microcanaux interconnectés, chaque forme individuelle nécessiterait sa propre entrée rendant la technique lourde. Bien que nous n'avons pas remarqué toute non-uniformité de patterning protéines, la distribution des cellules à motif à l'intérieur du microcanal peut être non uniforme. Cette non-uniformité peut être due à la distribution aléatoire des cellules dans la cellule de suspensions, la géométrie et les dimensions des micro-canaux, et la viscosité de la suspension cellulaire.
Dans l'avenir, cette technique peut être appliquée à d'autres types de substrats et de cellules. Par exemple, des gels tridimensionnels tels que la matrice de membrane basale ou échafaudages de collagène peuvent éventuellement être modelés et formés à l'aide PDMS canaux microfluidiques. Par injection d'un hydrogel dans le dispositif microfluidique, l'hydrogel peut prendre la forme du dispositif microfluidique et être capable de former des motifs complexes, sans l'utilisation d'imprimantes 3-D ou d'autres technologies. Ceux-ci permettraient de créer rapidement des échafaudages structurés avec des outils facilement disponibles et des dispositifs microfluidiques.
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Acknowledgments
Le financement de cette recherche a été assuré par la Commission New Jersey sur la moelle épinière de recherche (NJCSCR) (à FHK), accorder CSCR14IRG005 (à BLF), NIH accorde R15NS087501 (à CHC), et la Fondation Kirby FM (ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
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