Introduction
In Tissue Engineering und der Biosensorik, die Fähigkeit , die räumliche Organisation von Proteinen und Zellen auf einer Skala um zu kontrollieren, hat sich in den letzten vier Jahrzehnten zunehmend an Bedeutung 1, 2, 3. Genaue räumliche Organisation von Proteinen und Zellen hat Forscher erlaubt die Wechselwirkung zwischen Zellen und Substrate mit ähnlichen oder verschiedenen Arten von Zellen zu untersuchen, das Zellwachstum zu führen, und Biomolekülen zur Herstellung von Biosensoren , 4, 5, 6, 7, 8, zu immobilisieren 9.
Aktuelle Methoden der Muster Proteine schließen Photopatterning und Mikrokontaktdruck. Photopatterning nutzt lichtempfindliche Material, das bei Bestrahlung mit ultr vernetzteine violette (UV) Licht. UV - Licht bei einer Photomaske ( die aus transparenten Bereichen mit dunkleren Bereichen UV Lichtdurchlässigkeit zu verhindern) gerichtet verursacht in bestimmten Regionen Vernetzungs die dann 10 für die nachfolgende Befestigung von Biomaterialien oder Zellen verwendet werden können, 11. Während dieses System sehr genau ist und ermöglicht eine präzise Steuerung der Topographie der Kulturoberfläche, ist es gegenüber UV-empfindlichen Biomolekülen begrenzt , die durch UV - Strahlung 12 gemustert werden kann. Mikrokontakt- Drucken ist eine weitere beliebte Methode zur Strukturierung spezifischer Proteine 13, 14. In diesem Verfahren wird ein poly-dimethylsiloxan (PDMS) Tempel ist mit einer Vielzahl von Oberflächenmodifikationsreagenzien behandelt, bevor sie in einer Lösung des gewählten biomolekularen Substrat getränkt wird. Es wird dann auf einem Deckglas oder einer anderen Oberfläche so "Stanzen" des Biomoleküls auf die Kulturoberfläche schonend gepresst. However wird Prägen auf die Art des Materials begrenzt , die ebenso wie die Benetzbarkeit von Biomolekülen an der Oberfläche übertragen werden kann , die von PDMS 15 stempeln.
Direkte Strukturierung von Zellen kann schwieriger sein , und stützt sich auf komplexe Verfahren wie schaltbare Substrate, stencil basierte Verfahren oder Strukturieren mit spezifischen Zelladhäsionsmoleküle 16, 17. Diese Verfahren sind begrenzt in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen aufgrund des Fehlens von kompatiblen Zelladhäsion Substraten Inkompatibilität des Verfahrens mit empfindlichen biologischen Zellen und Randbedingungen zu arbeiten, Inkonsistenz in der Strukturierungs Wiedergabe- und Komplexität des Verfahrens. Beispielsweise bei schaltbaren Substrate, müssen individuelle Substrate für jeden Zelltyp gestaltet werden, deren Einhaltung bestimmter Zelltypen ohne Abbau bei Einwirkung von UV - Licht und Wärme in Prozess 17 verwendet , um Schalter, < sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil Basis Strukturierungsverfahren sind vielseitig in ihrer Fähigkeit zur Musterzellen; jedoch ist es schwierig , PDMS Schablonen an den entsprechenden Dicken 16, 21 Verwendung herzustellen. Direkte Injektion von Zellen in PDMS mikrofluidischen Kanälen haben einige Vorteile wie: 1) erleichtern bei der Herstellung von mikrofluidischen Kanälen und 2) Eignung für viele verschiedene Zellen und Substraten. Das vorherrschende Problem der Luftblasenerfassung während des Injektionsvorgangs aufgrund der Hydrophobizität von PDMS ohne die Verwendung von Plasma - Reinigung oder andere Verfahren jedoch Luftblasen zu verringern, macht es schwierig , Oberflächen 21 konsequent gemusterten Zellen auf Glas- oder Kunststoff erstellen.
Diese Arbeit baut auf Kapillar - Mikroform 22, 23,lass = "Xref"> 24, 25, 26 und berichtet ein Verfahren Protein- und Zellsuspensionen in Mikrokanäle einzuspritzen. Das hier verwendete Verfahren zeigt die Strukturierung von Substraten und sowohl direkte als auch indirekte Strukturierung von spezifischen Zelltypen. Diese Technik überwindet die hohe Hydrophobizität von PDMS und eliminiert das Vorhandensein von Blasen während der Injektion von entweder Substrate oder Zellen durch Ausnutzung der Gasdurchlässigkeit von PDMS 27 nehmen. Dieses Papier zeigt die Verwendung der Technik mit verschiedenen Substraten und Zelltypen. Der Artikel zeigt auch die Herstellung von Formen für Weich - Lithographie herkömmliche Photolithographie sowie eine einfache und kostengünstige Klebeband Verfahren nützlich in ressourcenbeschränkten Einstellungen 28, 29 verwendet wird .
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Protocol
HINWEIS: Bitte wenden Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesem Protokoll verwendet werden, sind giftig und krebserregend. Bitte verwenden Sie alle geeigneten Sicherheitspraktiken (Dunstabzug, Glovebox) und persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn giftige oder Säure / Base-Materialien.
1. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Lithografie
- Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal ein Computer-Aided Design (CAD) Zeichenwerkzeug verwenden.
- Drucken Sie das Layout auf einer leeren Maskenplatte mit Lasermaskenschreiber.
- Spülen einen 4 Zoll Silicium-Wafer mit Aceton, gefolgt von Isopropanol und trockenem Stickstoff mit einem Luftgebläse, um sicherzustellen, daß kein Lösungsmittel auf dem Wafer verbleibt.
- Dehydratisieren des Wafers, indem es auf einer Heizplatte bei 200 ° C für 5 min Einbrennen.
- Wählen eines negativen Photoresist für die gewünschte Höhe der Mikrokanäle gestaltet. Foder verwenden beispielsweise negativer Photoresist SU-8 50 Mikro von 50 & mgr; m mit einer Höhe zu erhalten.
- Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen, und dann Ausrichten der Wafer auf dem Spannfutter einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung.
- Dispense 4 ml (1 ml / inch Durchmesser des Wafers) negativer Photoresist auf die Mitte des Wafers.
- Schleuderbeschichten des Wafers mit einem zweistufigen Schleudergang unter Verwendung eines Spinners. Zuerst wird ein Spread-Zyklus von 500 UpM mit einer Beschleunigung von 100 Upm / s für 10 s anwenden. Danach ist eine Schleuderzyklus von 2000 UpM mit einer Beschleunigung von 300 Upm / s 2 30 s 50 & mgr; m Beschichtung aus Photoresist auf einem Wafer zu erhalten.
- Soft bake der Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Für eine 50 & mgr; m Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 6 min und dann sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake dem Wafer bei 95 ° C für 20 min.
- Erlauben der Wafer auf Raumtemperatur abkühlen und dann laden dieWafer auf dem Lithographiestufe.
- Richten Sie die Maske auf dem Wafer Mask Aligner mit und um den Wafer mit UV - Licht ausgesetzt werden (gemäß den Anweisungen des Herstellers) bei einer Intensität von 1,5 mW / cm 2 für 146 s die gesamte UV - Dosis von 220 mJ / cm 2 erforderlich für eine anzuwenden 50 & mgr; m dicke Schicht aus Photolack.
- Bewerben Einbrennen nach der Belichtung auf den Wafer in zwei Schritten auf einer heißen Platte. Für eine 50-um-Beschichtung aus Photoresist, erste Pre-Bake-Wafer bei 65 ° C für 1 min und sofort die Heizplattentemperatur Rampe bis zu post-bake es bei 95 ° C für 5 min.
- Entwickeln des Wafers durch Eintauchen des Wafers in SU-8-Entwickler in und sanft schütteln, bis die Merkmale auf dem Wafer deutlich werden. Entwickeln des Wafers für ~ 6 min für die 50 & mgr; m dicken Photoresist.
- Spülen Sie überschüssige Entwickler mit Isopropanol und Ethanol, dann trocknen die Wafer mit einem Stickstoffluftpistole.
- Hartbacken des Silizium-Wafers auf einer Heizplatte bei 150 ° C für 15 min.
- Setze dasWafer in einem Exsikkator mit 25 & mgr; l des Silanisierungsmittel Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-Trichlorsilan.
HINWEIS: Das Silanisierungsmittel ist ätzend, also in einer Säure / Base-Abzugshaube verwendet werden soll, geeignete persönliche Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). - Setzen Sie das Vakuum für 5 Minuten und setzen den Wafer zu den Dämpfen von Silan für 30 Minuten, ohne das Vakuum freigibt.
- Übertragen Sie die Wafer in eine ausreichend große, Petrischale.
2. Herstellung von Urformen für Soft Lithography mit Klebeband
- Zeichnen Sie das Layout der Mikrokanal eine CAD-Zeichnung Werkzeug und die Zeichnung auf weißem Papier gedruckt.
- Reinigen Sie einen Objektträger aus Glas groß genug, um das Design mit Isopropanol aufzunehmen und dann trocknen Sie die Folie mit einer Luftpistole.
- Befestigen Klebeband auf die gereinigte Glasobjektträger. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu stoppen.
- Kleben Sie die Seiten des glass gleiten auf das Papier mit dem Design, mit der Bandseite nach oben.
- Verwenden Sie ein Skalpell, das Band auf dem Glasträger zu schneiden Sie das Papier Design als Referenz verwendet und dann abziehen Band von unerwünschten Bereichen der Glasträger.
- Spülen Sie die Glasobjektträger mit Isopropanol und dann trocken mit einer Luftpistole. Backen Sie die Objektträger aus Glas in einem Ofen bei 65 ° C für 30 min.
- rollen sanft über das Band mit einer Gummiwalze von Luftblasen und damit die Folie auf Raumtemperatur abkühlen zu entfernen.
3. Weiche Lithography Die Herstellung der PDMS-Geräte
- Mischungs PDMS-Elastomer und dessen Härtungsmittel in einem Verhältnis von 10: 1 (w: w), rühre die Mischung kräftig und dann entgast die Mischung, indem sie in einer Vakuumkammer platziert, bis keine Luftblasen in der Mischung auftreten.
- Gießen Sie die Mischung auf eine silanisierte Silikonform oder Klebeband Form in einer Petrischale ein ~ 2 mm dicke Schicht aus PDMS und Entgasen, bis alle Luftblasen verschwinden zu erhalten.
- Cure die PDMS in einem Ofenbei 65 ° C für 2 h.
- Verwenden Sie ein Skalpell die PDMS-Schicht zu schneiden mindestens 5 mm entfernt von den Eigenschaften und dann schälen die gehärteten PDMS aus der Form unter Verwendung von tweezer.
- Stanzen eine einzelne Einlassöffnung mit einer 1 mm - Biopsie überall auf dem Mikrokanal stanzen, vorzugsweise am Ende eines Netzes von Mikrokanälen , wie in 2a zu sehen und 4b.
- Reinigen Sie die mit Klebeband gegossen PDMS zu Staubpartikel zu entfernen auf das Gerät adsorbiert. Sterilisieren Sie die PDMS-Mikrokanal-Gerät (PDMS gegossen) mit einer Lösung von 70% Ethanol, gefolgt von sterilem deionisiertem (DI) Wasser gespült wird, und setzen für 30 min mit UV.
- Halten Sie die sterile PDMS-Gerät in eine sterile Petrischale bis zur Verwendung.
4. Substrat Patterning
- Legen Sie die sterile PDMS gegossen Pinzette auf eine sterile Deckglas oder Petrischale mit und anwenden sanften Druck mit der Spitze der Pinzette.
HINWEIS: Die PDMS Guss macht eine konforme, aber reversible Dichtung mit dem glass Deckglas oder Petrischale Mikro ohne Verwendung eines Klebstoffs zu bilden. - Setzen Sie einen Tropfen (20 bis 40 & mgr; l) der Substratlösung auf dem Einlass vollständig die Einlassöffnung abdeckt. Muster Poly-D-Lysine (PDL), indem ein 20 & mgr; l Tröpfchen der PDL in Natriumtetraboratpuffer auf den Einlass der Mikrokanäle platzieren.
- Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum von ~ 254 mmHgA (entspricht Vakuum in biologischen Laboratorien zu Haus) für 10 min, und beobachten Sie die Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen.
- Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Substratlösung in den Mikrokanal fließt.
- Inkubieren Sie die Schale an den geeigneten Bedingungen für die Substrathaftung. Siehe Tabellen 1 und 2 für Inkubationsbedingungen (diese auf dem Substrat variieren). Für PDL Strukturierung bei 37 ° C für 1 h inkubiert.
- abblättern vorsichtig die PDMS-Stempel sterile Pinzette und waschen Sie das Muster auf Deckglas dreimal mit VE-Wasser. Fügen Sie eine 1% Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung in die Petrischale die Schale oder das Deckglas zu bedecken und über Nacht bei 37 ° C inkubiert.
HINWEIS: Dies reduziert unspezifische Haftung in unbeschichteten Regionen. - Absaugen der 1% BSA-Lösung und dem strukturierten Substrat ist nun einsatzbereit.
5. Indirekte Patterning von Zellen
- Vorbereitung der Zellsuspension in einem serumfreien Kulturmedium. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Fügen Sie die Zellsuspension auf das strukturierte Petrischale und vollständig versenken die strukturierte Region in Zellsuspension.
- Inkubieren der Petrischale bei 37 ° C in einem Inkubator für 15 min Zellen zu ermöglichen, um das strukturierte Substrat zu befestigen.
- Aspirieren die überschüssige Zellsuspension aus der Petrischale und wasche die gemusterte Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) unter leichtem Schütteln für 10 s ungebundene Zellen zu entfernen.
- Fügen Sie die appropriate Kulturmedium auf die strukturierte Zellkulturen und inkubiere die gemusterte Zellen bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator.
6. Direct Patterning von Zellen
ANMERKUNG: Diese Technik ist eine Alternative zu der indirekten Zelle Strukturieren in Schritt 5 beschrieben jedoch, anders als in Schritt 5 in dieser Technik Zellen werden strukturiert auf Gewebekulturoberflächen mit oder ohne Substratbeschichtung.
- Sterilisieren der mikrofluidischen Vorrichtung, indem sie mit einer Lösung von 70% Ethanol mit DI-Wasser gespült wurde.
- Tränken das Gerät über Nacht in einer Lösung von 1% BSA, die Zelladhäsion zu den PDMS zu verhindern.
- Trocknen Sie die Vorrichtung bei Raumtemperatur und befestigen es an der Unterseite der Gewebekultur-behandelte Petrischale.
- Vorbereitung der Zellsuspension in serumfreien Kulturmedien. Der Zelltyp und der Zelldichte sind in Tabelle 2 aufgeführt.
- Legen Sie ein Tröpfchen (4 - 8 ul) der Zellsuspension, genug, um zu füllen dieMikrokanäle, vollständig auf den Einlass für den Einlassloch.
- Legen Sie die Petrischale in einem Vakuum für 10 min und beobachten Luft aus dem Kanal in Form von Blasen kommen. Lassen Sie die Vakuum und beobachten Sie die Zellsuspension in den Mikrokanal fließt.
- Die Petrischale in einem Inkubator inkubieren Zelladhäsion gemäß den Inkubationsbedingungen (abhängig von der Art der Zelle strukturiert) in Tabelle 2 erwähnt zu fördern. In PBS in die Petrischale Untertauchen des PDMS-Gerät.
- Ziehen Sie die PDMS vorsichtig von der Petrischale mit einer Pinzette und waschen Sie das Muster mit PBS. In Zellkulturmedien zu der Petrischale und legen Sie die Zellkultur in den Inkubator.
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Representative Results
Dieses Verfahren erlaubt die Strukturierung von Proteinen und indirekte Strukturierung von Zellen Sackgassen mikrofluidischen Kanäle mit Abmessungen so klein wie 10 & mgr; m und Anlagen in fast allen biologischen Laboratorien verwendet, sobald der Masterform hergestellt. Diese Technik kann mit PDMS mikrofluidischen Kanälen verwendet werden , unter Verwendung von herkömmlichen Weich photolithographischen erstellt oder mit PDMS mikrofluidischen Kanälen mit Klebeband Herstellungs erzeugt (Figur 1) 28, 29. Wir haben zuvor die Verwendung dieses Verfahrens der indirekten Strukturierung von neuronalen Zellen zur Bewertung der Axon Führung in Photorezeptoren 4 gezeigt, 30 und haben nun ihre Verwendung in mehreren zusätzlichen Zelltypen unterschiedlicher Herkunft nachgewiesen. Embryonale Rattenkortex gemusterten Neuronen auf der Poly-D-Lysine (PDL) und Laminin Oberflächen zeigen allgemeine adherence zu den gemusterten Bereichen und Wachstum entlang der PDL und Laminin Streifen (3A). C2C12 Myoblasten - Zelllinien , haften auch dem gemusterten Bereich und zeigen fusion in kernige Myotuben (3B). Wir haben diese Technik auch für die direkte Zellmusterungs angepasst als 4 mit Fibroblasten in zu sehen. Wie bereits berichtet, zeigte diese direkte Zellmusterungsverfahren keine nachteilige Wirkung auf das Überleben der Zelle 30. Die Variablen , die für eine erfolgreiche direkte oder indirekte Strukturierung genannten Zelltypen führen , sind in Tabelle 1 und 2 aufgeführt. Also in der Zukunft können Forscher, diese Technik zu verwenden Musterzellen und Phänomene auf ihre spezifischen Strukturierung bezogen entdecken.
Abbildung 1: Die Herstellung von Mold von Weich - Lithographie. Links: Photolithography-Prozess. SU-8 ist mittels Schleuderbeschichtung auf einen Siliciumwafer, mit UV-Strahlung, und entwickelt, um überschüssige SU-8 entfernen. Rechts: Klebeband Herstellungsprozess. Klebeband wird auf einem sauberen Objektträger aus Glas angebracht, mit einem Skalpell geschnitten und überschüssige Band wird vorsichtig entfernt. PDMS gegossen wird dann aus jeder Form hergestellt Softlithographie verwendet wird. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Beispiel eines PDMS Vorrichtung zum Substrat Patterning. (A) PDMS mikrofluidischen Guss mit Einlass für mikrofluidische Strukturierung von Substraten verwendet. Inlet wurde an einem Ende der Mikrokanäle ausgestanzt werden. (B) Mikrofluidik - Kanal als unter Phasenkontrastmikroskopie gesehen. Mikrofluidische Kanäle sind 15 mm lang, 20 um breit, einemd von 200 & mgr; m getrennt. Abbildung 2 ist mit freundlicher Genehmigung von IOP Publishing reproduziert. Alle Rechte vorbehalten 30. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Indirekte Zelle Patterning. (A) Vakuum unterstützte Proteinstrukturierungsprozess. PDMS mikrofluidischen Kanal-Gerät in eine Petrischale angebracht ist, wird Substratlösung in den Einlaß geladen ist, wird kurz Vakuum an die Kammer angelegt und freigegeben, PDMS Gerät entfernt wird, Muster gewaschen und sofort einsatzbereit. (B) Embryonale kortikalen Rattenneuronen ausgesät auf einem Deckglas mit einem gemusterten PDL und Laminin Substrat. (C) C2C12 Myoblasten - Zelllinien auf gemusterten PDL und Laminin gezüchtet. Figuren 3a und 3c sind mit p reproduziertenermission von IOP Publishing. Alle Rechte vorbehalten 30. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Direkte Handy Patterning. (A - c) Fibroblasten über eine direkte Zell Musterung gemustert. (A) Mikrofluidik - Kanal - Gerät hergestellt Klebeband Lithographie. (B) mikrofluidische Kanäle , nachdem sie mit der Fibroblasten - Zellsuspension Füllung Vakuum unterstützte Strukturierungstechnik. (C) Fibroblasten nach Entfernung der mikrofluidischen Vorrichtung. (D) Calcein-AM - Färbung von Fibroblasten nach mikrofluidischen Strukturierung. (E) Phasenkontrastbild von Fibroblasten nach Mikrofluidik-Strukturierung. (F - g 30. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Indirekte Zelle Patterning | Substrat | Protein Inkubationsbedingungen | Zelldichte | Cell Adhesion Dauer |
| PC12 | Collagen-1 | 1 h bei 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 h bei 37 ° C |
| Fibroblast | Collagen-1 | 1 h bei 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 h bei 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 h bei 37 ° C, waschen PBS, über Nacht bei 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min bei 37 ° C |
| Embryonale Ratte kortikalen Neuronen | PDL + Laminin | 1 h bei 37 ° C, waschen PBS, über Nacht bei 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min bei 37 ° C |
| Salamander Retinal Neurons | Sal-1 | über Nacht bei 10 ° C | N / A | 1 h bei 10 ° C |
Tabelle 1: Indirekte Zelle Patterning Bedingungen. Liste der Inkubationsbedingungen wie Substrattyps, Zeit, Temperatur, und die Zelldichte für typische Zelltypen. Die Forscher sollten die Inkubationsbedingungen für die eigene Modellsubstraten und Zelltyp zu optimieren. Sal-1 ist das Antikörpersubstrat verwendet Salamander retinalen Neuronen wachsen.
| Direkte Handy Patterning | Substrat | Zelldichte | Cell Adhesion Zeit |
| PC12 | Collagen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 h bei 37 ° C |
| Fibroblast | Collagen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 h bei 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / mL | 15 min bei 37 ° C |
| Embryonale Ratte kortikalen Neuronen | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / mL | 15 min bei 37 ° C |
| Salamander Retinal Neurons | Sal-1 | N / A | 1 h bei 10 ° C |
Tabelle 2: Direkte Zell Patterning Bedingungen. Liste der Inkubationsbedingungen wie beispielsweise Temperatur, Zeit, und die Zelldichte für typische Zelltypen. Die Forscher sollten die Inkubationsbedingungen für ihr eigenes Modell Zelltyp zu optimieren.
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Discussion
Während herkömmliche Photolithographie eine gut etablierte Technik für die Herstellung von Formen für Weich-Lithographie ist, die Ausrüstung, Materialien und Fähigkeiten erforderlich sind herkömmliche Photolithographie zu verwenden, nicht ohne weiteres auf den meisten Labors zur Verfügung. Für Laboratorien, ohne Zugang zu diesen Ressourcen haben wir Klebebandherstellung als Methode der dargestellten Formen mit relativ einfachen Funktionen für mikrofluidische Vorrichtungen zu schaffen. Diese Methode ermöglicht es jedem Labor zu schaffen und Mikrofluidik-Vorrichtungen für Forschungszwecke mit leicht verfügbaren Tools nutzen. Das Klebeband Verfahren kann mit einer kostengünstigen Desktop - vinyl cutter 31 verbessert werden. Desktop-Schneideplotter kann die Reproduzierbarkeit zu erhöhen, die Auflösung, sowie das Layout Komplexität. Jede dieser Optionen, herkömmliche Photolithographie, Desktop-schneider oder Klebeband Herstellung haben unterschiedliche Fähigkeiten und Grenzen und Forscher müssen sorgfältig prüfen, welche Methode ausreichen würde,für ihre Bedürfnisse.
In gehärteten PDMS, bilden die langen Polymerketten aus Dimethylsiloxan ein Gitter, nanoporösen Struktur , die Leerbereiche erzeugt , die mit Luftmolekülen 27 gefüllt werden kann. Diese gasdurchlässige Eigenschaft ist der Schlüssel zu unserer Methode von mikrofluidischen Kanälen zu füllen. Wenn sie in eine Niederdruckumgebung angeordnet ist , Luftmoleküle werden von dem PDMS Schüttguts sowie die Mikrokanäle sich 25 entfernt. Wenn das PDMS wird dann auf Atmosphärendruck ausgesetzt wird , behalten die PDMS Schüttgut und Mikrokanäle einen Unterdruck für einige Zeit 25, 30. Dieser Unterdruck saugt Flüssigkeit in die Mikrokanäle automatisch die mikrofluidische Kanäle zu füllen. Dieser Unterdruck weiterhin Flüssigkeit in den Kanal, bis die Masse PDMS ins Gleichgewicht mit dem atmosphärischen Druck zu ziehen.
Dieses vakuumunterstützten Technik erlaubt patterning bestimmter Proteine und Substrate auf ein Wachstumssubstrat. In dieser Studie waren wir beide verschiedene Substrate und Zelltypen direkt und indirekt (Tabelle 1 und 2) zu strukturieren können. Jedoch kann der Experimentator müssen verschiedenen Inkubationszeiten, Zelldichten oder Animpfen Medien für ihre bestimmten Zelltyp getestet werden. Diese Variablen beziehen sich wahrscheinlich auf die angeborene Fähigkeit von entweder der Zelle oder dem Substrat an der Oberfläche zu haften sie auf gebracht wird. Zum Beispiel benötigt hier C2C12 Zellen, die Verwendung von Serum-freien Medien für das Aussäen Medien, bevor die Zellen in DMEM mit 2% Pferdeserum kultiviert werden. Zusätzlich variieren kann Bedingungen basierend darauf, ob ein Deckglas oder Kunststoffpetrischale gemustert wird. Hier arbeitete beide gut für bestimmte Strukturierung verschiedener Zelltypen zu ermöglichen.
Einer der anfänglichen Bedenken hatten wir während Verwendung dieser Technik war, wie Exposition gegenüber Vakuum die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen könnten. Diese Studie und previous Studien sollten jedoch diese Bedenken mildern , wie wir das Vakuum wenig hat auf einer Vielzahl von Zellen 30 bis keine Wirkung gezeigt haben. Wang et al. zuvor entgastes irreversibel mikrofluidischen Kammern abgedichtet verwendet , um HeLa - Zellen 32 zu laden. Andere Studien haben vakuumunterstützten Zellaussaat für eine Vielzahl von Zelltypen , einschließlich humanen Stammzellen, adhärenten und nicht-adhärenten Zellen und Human-Hamster - Hybrid - Zellinie (A L) Zellen 33 in mikrofluidischen Kanälen zu laden. Darüber hinaus haben andere Forscher Zellen viel größer Vakuumdrücke im Vergleich zu dieser aktuellen Studie mit wenig bis keine erkennbare Wirkung auf die Zellen 33 unterzogen. Blasen während der Entfernung von Luft aus den Mikrokanal gebildet neigen dazu, auf der Oberfläche des Tropfens der Suspension am Einlass zu versammeln. Oft werden diese Blasen platzen nicht auf Grund der Oberflächenspannung der Suspension. Wir haben nicht OBSERVed Lebensfähigkeit einer spürbaren Abnahme der Zelle zu Blasen durch. Darüber hinaus ist das Experiment mit Calcein-AM nicht zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen vor. Aus diesem Grund haben wir nicht gründlich Zelltod speziell aufgrund von Blasen untersucht.
Frühere Versuche, um Mustersubstrate oder Zellen wurden oft von Problemen wie der Bildung von Luftblasen in den Mikrofluidik-Vorrichtungen geplagt. Die Bildung von Luftblasen war es schwierig, ohne die Verwendung von Geräten oder Materialien Flüssigkeiten einfach und effizient zu injizieren, die in den meisten Labors nicht verfügbar sind. Zum Beispiel verwendet früheren Verfahren die Verwendung von Plasmabehandlung oder Coronabehandlung , die Hydrophobizität von PDMS Mikrokanäle zu verringern , 15, 34. Während wirksame, Plasma- und Koronabehandler nicht ohne weiteres in den meisten Laboratorien verfügbar. In diesem Protokoll zeigen wir die Möglichkeit, Musterzellen und Substrate einfach gemeinsam labora mitTory Vakua. Verwendung des Klebebandes Herstellungstechnik kann die Methode genutzt werden PDMS mikrofluidischen Kanäle Mustersubstrate oder Zellen in nahezu jedem Labor zu schaffen.
Um Muster Substrate oder Zellen mit dem Vakuum-Musterprotokoll, sind mehrere Schritte entscheidend für eine erfolgreiche Strukturierung. Zuerst wird das Klebeband-Master herzustellen, muß das Klebeband vollständig auf dem Glasobjektträger und frei von Luftblasen angebracht werden. Luftblasen, die Bindung zwischen dem Band und dem Glasträger zu schwächen und zu dem Band führen kann abgezogen werden, wenn PDMS ausgehärtet wird abgezogen, das Klebeband Form. Außerdem werden Blasen, die Geometrie des mikrofluidischen Kanals verzerren die Oberfläche der Kanäle bewirkt nicht-planar sein. Um die PDMS gegossen aus SU-8-Form machen, die SU-8-Form muss vor dem Gießen mit PDMS silanisiert werden. Dieser Schritt ist wichtig, um die dauerhafte Bindung von PDMS auf die SU-8-Form bei der Verhinderung nach PDMS zu heilen. Vor konforme Dichtungsdes PDMS mikrofluidischen Kanal auf Glasplättchen oder Kunststoff-Petrischalen, müssen die PDMS aller Staubpartikel gereinigt werden. Diese Partikel können die Bildung einer konformen Dichtung zwischen PDMS und Glas zu verhindern und somit die Injektion von Zellen oder Substrate in den mikrofluidischen Kanal zu verhindern. Wie in dem obigen Protokoll angegeben, ist der PDMS-Kanäle mit Klebeband Reinigung kritisch, bevor der Mikrokanal auf Glasdeckplättchen oder Kunststoff-Petrischalen anhaften. Schließlich, nachdem das Gerät in die Vakuumkammer platziert, muss das Vakuum vorsichtig von der Einlassöffnung zu verhindern, Verschiebung des Tröpfchens Substrat oder Zelllösung gelöst werden.
Wenn keine Flüssigkeit beobachtet wird in den mikrofluidischen Kanal fließt, kann ein Leck in dem mikrofluidischen Kanal sein, der fließt, in den Kanal Flüssigkeit verhindern würde. Entfernen Sie die PDMS-Stempel, trocken und reinigen Sie ihn und wiederholen Sie dann Schritt 4, 5 oder 6 der Technik. Wenn die Lösung fließt nicht in den Mikrokanal nach release des Vakuums sicherzustellen, dass die Lösung den Eingang des Mikrokanals vollständig abdeckt. Dies kann durch Pipettieren Lösung nach oben und unten mehrmals durchgeführt werden, während es in das Einlassloch setzen. Wenn das Substrat, nachdem es in den Mikrokanal eingespritzt wird, legen sich nicht auf dem Glas, zu bewerten und zu bestimmen, um die optimalen Inkubationsbedingungen, die für das Substrat verwendet. Wenn die PDMS von der Glasoberfläche oder Kunststoff-Petrischale gegossen Entfernen bewirkt, dass die gemusterte Zellen oder Substrate zerstört zu werden, verwenden Sie einen dünneren PDMS gegossen, versenken die Guss PDMS in PBS oder Medien, und langsam und vorsichtig die PDMS abziehen aus dem Glas gegossen oder Kunststoffoberfläche mit einer Pinzette.
Schließlich entweder der unstrukturierten Glas oder Kunststoffoberfläche in abnehm unspezifische Adhäsion von Zellen kann BSA kritisch sein. BSA wird typischerweise als ein Blockierungsreagenz in Western-Blotting, Immunfärbung und andere molekularbiologische Techniken verwendet. Andere Forscher haben es auch für indirekte oder direkte genutztMusterungsprotokolle zu verringern unspezifische Zelladhäsion 35, 36, 37. Wir fanden, dass die Inkubation des Substrats mit BSA notwendig war für die meisten Zelltypen mit Ausnahme von Salamander Netzhautzellen. Dies , weil der sein kann , die mehr spezialisierte Art des Substrats (ein Antikörper namens Sal-1), sowie den allgemeinen Mangel an Zelladhäsion durch diesen Zelltyp 38 verwendet wurde. In unseren Händen war BSA auch nicht merklich die Anhaftung von Zellen an die gemusterten Bereiche verringern und diente hauptsächlich unspezifischen Anhaftung zu verringern.
Während dieses Verfahren ausgelegt ist, in seiner Anwendung auf verschiedenen Substrat und Zelltypen vielseitig und flexibel zu sein, gibt es mehrere Einschränkungen dieses Protokoll und den kompatiblen Zellen und dem Substrat. Aufgrund der Natur von Zellen auf einer Oberfläche des Strukturierens die Zelltypen, die diese Technik angewendet werden kann sind auf those, die an jeder Musterungsprotokoll, wie beispielsweise jene Zellen zugänglich sind, die in der Lage sind mit begrenzteren Zelle zu Zelle Kontakt sowie diejenigen zu überleben, die bei niedrigeren Zellaussaat Konzentrationen überleben können. Zum Beispiel ist eine mögliche Anwendung die Strukturierung von Hefezellen für die Atomkraftmikroskopie (AFM) 39. Während wir viele verschiedene Zellsubstrate getestet haben, können auch andere Substrate nicht mit dieser besonderen Technik arbeiten wie jene, die dreidimensionale Gele bilden. Zu diesem Zeitpunkt haben wir untersucht, ob Gelen richtig auf der Oberfläche des Glasdeckglas oder Kunststoffpetrischale nach dem Strukturieren bilden und zu bleiben. Diese Technik ist in der Lage Strukturieren komplexen Formen und große Flächen. Es kann jedoch nicht Muster eine Anordnung von einzelnen getrennten Formen ohne Verbindungsmikrokanäle. In Abwesenheit von miteinander verbundenen Mikrokanälen, wobei jede einzelne Form würde seinen eigenen Einlass machen die Technik umständlich erfordern. Während wir bemerkt haben keine Ungleichmäßigkeit in patterning Protein kann ungleichmäßig sein die Verteilung der Zellen innerhalb des Mikrokanals strukturiert. Diese Ungleichförmigkeit kann auf die statistische Verteilung von Zellen in Zellsuspensionen, die Geometrie und die Abmessungen der Mikrokanäle, und die Viskosität der Zellsuspension zurückzuführen sein.
In der Zukunft kann diese Technik auch auf andere Arten von Substraten und Zellen angewendet werden. Verwendung von PDMS mikrofluidischen Kanälen beispielsweise dreidimensionale Gele wie Basalmembran-Matrix oder Kollagen Gerüste potentiell strukturiert werden kann und ausgebildet ist. Durch Einspritzen ohne die Verwendung von 3-D-Drucker oder andere Technologien ein Hydrogel in die Mikrofluidik-Vorrichtung kann das Hydrogel nehmen die Form der Mikrofluidik-Vorrichtung und können komplexe Muster zu bilden. Dies würde es ermöglichen für die schnelle Erstellung von strukturierten Gerüste mit leicht verfügbaren Werkzeugen und Mikrofluidik-Vorrichtungen.
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Acknowledgments
Die Finanzierung für diese Forschung von der New Jersey Kommission auf Rückenmarksforschung (NJCSCR) (bis FHK) zur Verfügung gestellt wurde, gewähren CSCR14IRG005 (zu BLF), gewähren NIH R15NS087501 (zu CHC) und der FM Kirby Foundation (ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
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