Introduction
בהנדסת רקמות biosensing, את היכולת לשלוט בארגון המרחבי של חלבונים בתאים בסולם מיקרומטר, הפך חשוב יותר ויותר במהלך ארבעת העשורים האחרונים 1, 2, 3. ארגון המרחבי מדויק של חלבונים בתאים אפשר לחוקרים לבחון את יחסי הגומלין בין תאי מצעים המכילים סוגים דומים או שונים של תאים, כדי להדריך את גדילת תאים, וכדי לשתק ביומולקולות עבור הייצור של חיישנים ביולוגיים 4, 5, 6, 7, 8, 9.
השיטות הקיימות כיום של חלבונים דפוסים כוללים photopatterning והדפסה microcontact. Photopatterning מנצל חומר רגיש לאור אשר crosslinked בחשיפה ultrאור סגול (UV). אור UV מכוון photomask (מורכב האזורים שקופים עם אזורים כהים כדי למנוע העברת אור UV) גורם crosslinking באזורים ספציפיים אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ההתקשרות הבאה של חומרים ביולוגיים או תאים 10, 11. בעוד תכנית זו היא מאוד מדויקת ומאפשרת שליטה מדויקת של הטופוגרפיה של שטח התרבות, היא מוגבלת ביומולקולות UV הרגיש שניתן בדוגמת ידי קרינת UV 12. הדפסת Microcontact היא עוד שיטה פופולרית של דפוסי חלבונים ספציפיים 13, 14. בשיטה זו, siloxane פולי-דימתיל (PDMS) חותמת מטופל עם מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי פני השטח בטרם ספוג בתמיסה של המצע וביומולקולרית הנבחר. הוא הקיש בעדינות על coverslip זכוכית או משטח אחר כך "הטבעה" את biomolecule על גבי משטח תרבות. הוwever, ביול מוגבל לסוג החומר שניתן להעביר כמו גם יכולת רטיבות של ביומולקולות אל פני השטח של PDMS להחתים 15.
דפוסים ישירים של תאים יכולים להיות יותר קשים ומסתמכים על שיטות מורכבות כגון מצעים להחלפה, שיטות המבוסס סטנסיל, או דפוסים עם מולקולות הדבקת תא ספציפיות 16, 17. שיטות אלו מוגבלים ביכולתם תאי דפוס בשל חוסר מצעי הידבקות תא תואמים, אי התאמה של התהליך לעבוד עם תאים ואילוצים ביולוגיים רגישים, חוסר עקביות לשחזר את הדפוסים, ומורכבות ההליך. לדוגמא, עם מצעים להחלפה, מצעים מותאמים אישית צריכים להיות מתוכננים עבור כל סוג תא, לעבור דבקותם סוגי תאים מסוימים ללא שפלה בחשיפה לאור UV והחום המשמש בתהליך 17, < sup class = "Xref"> 18, 19, 20. שיטות דפוסים סטנסיל מבוססות הם צדדים ביכולתם תאי דפוס; עם זאת, קשה לייצר שבלונות PDMS על עוביים המתאים לשימוש 16, 21. הזרקה ישירה של תאים לתוך ערוצי microfluidic PDMS יש כמה יתרונות כגון: 1) להקל על ייצור של ערוצי microfluidic ו -2) והתאמתו תאי מצעים שונים. עם זאת, הנושא הרווחת ללכוד בועות אוויר במהלך תהליך ההזרקה בשל הידרופוביות של PDMS ללא שימוש ניקוי פלזמה, או בשיטות אחרות כדי להקטין בועות אוויר, מקשה ליצור תאים בדוגמת בעקביות על משטחי זכוכית או פלסטיק 21.
עבודה זו מרחיבה נימי micromolding 22, 23,= ילדה "Xref"> 24, 25, 26 ו מדווח שיטה להזריק השעיות חלבון התא לתוך microchannels. השיטה כאן מדגימה את הדפוסים של מצעים ושניהם דפוסים ישירים ועקיפים של סוגי תאים מסוימים. טכניקה זו מתגברת על הידרופוביות הגבוהה של PDMS ומונעת את הנוכחות של בועות במהלך ההזרקה של או מצעים או תאים על ידי ניצול של חדירות הגז של 27 PDMS. מסמך זה מדגים את השימוש בטכניקה עם כמה מצעים שונים סוגי תאים. המאמר מדגיש גם הייצור של תבניות עבור ליתוגרפיה רכה באמצעות photolithography קונבנציונלי וכן פשוטה ושיטת דבק בעלות הנמוכה שימושית משאבי הגדרות מוגבלות 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. חלק מהכימיקלים המשמשים פרוטוקול זה הוא רעיל ומסרטן. השתמש כל נוהלי הבטיחות המתאים (במנדף, שבתא הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות) בעת השימוש בחומרים רעילים או חומצה / בסיס.
ייצור 1. של תבניות אב ליתוגרפיה באמצעות ליתוגרפיה Soft
- צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור תכנון בעזרת מחשב (CAD).
- הדפס את הפריסה על צלחת מסיכה אטומה באמצעות סופר מסכת ליזר.
- לשטוף פרוסות סיליקון 4 אינץ 'עם אצטון ואחריו isopropanol ויבש עם אקדח אוויר חנקן, כדי לוודא ששום ממס נותר על פרוסות סיליקון.
- מייבש את הפרוסות על ידי אפייה זה על צלחת חמה ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- בחר photoresist שלילית המיועד לגובה הרצוי של microchannels. Fאו למשל, להשתמש photoresist השלילי SU-8 50 להשיג microchannels עם גובה של 50 מיקרומטר.
- אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ליישר את רקיק על צ'אק של coater ספין.
- לוותר 4 מ"ל (1 מ"ל / אינץ בקוטר של פרוסות סיליקון) של photoresist שלילית על מרכז של פרוסות סיליקון.
- ספין המעיל רקיק עם הסחיטה שני שלבים באמצעות הצנטריפוגה. ראשית, להחיל מחזור התפשטות 500 סל"ד עם תאוצה של 100 סל"ד / s עבור 10 שניות. ואז להחיל מחזור סחיטה של 2,000 סל"ד עם תאוצה של 300 סל"ד / s 2 למשך 30 שניות כדי לקבל ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist על פרוסות סיליקון.
- לאפות Soft רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית על פי הנחיות היצרן. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, הראשון מראש לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ולאחר מכן מיד תעלי את הטמפרטורה פלטה חשמלית כדי לפרסם לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לטעון אתוופל לבמה ליתוגרפיה.
- יישר את המסכה על פרוסות סיליקון באמצעות aligner מסכה ולחשוף את רקיק לאור UV (על פי הוראות היצרן) בעצימות של 1.5 mW / 2 ס"מ על 146 s ליישם את המינון UV כולל של 220 mJ / 2 ס"מ הנדרשים 50 מיקרומטר שכבת photoresist עבה.
- החל לאפות חשיפה לפרסם רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, ראשון מראש לאפות את הפרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ומייד תעלה את טמפרטורת הפלטה החשמלית כדי לפרסם לאפות אותו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לפתח את רקיק על ידי השריית רקיק מפתח SU-8 ורועדת בעדינות עד תכונות להתבהר על פרוסות סיליקון. פיתוח רקיק עבור ~ 6 דקות עבור photoresist עבה 50 מיקרומטר.
- לשטוף מפתח עודף עם isopropanol ואתנול, ולאחר מכן לייבש את הפרוסות עם אקדח אוויר חנקן.
- קשה לאפות את פרוסות סיליקון על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- מניחים אתרקיק ייבוש עם 25 μL של סוכן silanizing tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane.
הערה: סוכן silanizing הוא מאכל, ולכן יש להשתמש בתוך במנדף חומצה / בסיס, עם ציוד מגן אישי מתאים (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלאים, סגורות נעליים). - החל את ואקום במשך 5 דקות ולחשוף את רקיק האדים של silane במשך 30 דקות מבלי לשחרר את הוואקום.
- מעבירים את פרוסות לתוך צלחת כראוי בגודל פטרי.
ייצור 2. מגיסטר תבניות ליתוגרפיה Soft באמצעות דבק
- צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור CAD ולהדפיס את הציור על נייר לבן.
- נקה שקופיות זכוכית גדולות מספיק כדי להכיל את העיצוב עם isopropanol ולאחר מכן לייבש את השקופית עם רובה אוויר.
- צרף דבק לשקופית זכוכית לנקות. היזהר שלא מלכודת כל בועות אוויר.
- קלטת את הצדדים של GLAss להחליק על הנייר עם העיצוב, עם למעלה בצד הקלטת.
- השתמש אזמל לחתוך את הקלטת בשקופית הזכוכית באמצעות עיצוב נייר כהפניה ולאחר מכן לקלף קלטת מאזורים לא רצויים של שקופיות הזכוכית.
- יש לשטוף את השקופית זכוכית עם isopropanol ואז יבש עם רובה אוויר. אופה את שקופיות זכוכית בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- בעדינות לגלגל את הקלטת עם מכבש גומי כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר את השקופית להתקרר לטמפרטורת החדר.
3. ייצור ליתוגרפיה Soft של מכשירי PDMS
- מערבבי PDMS אלסטומר סוכן הריפוי שלה ביחס של 10: 1 (w: w), מערבב את התערובת במרץ, ולאחר מכן דג את התערובת על ידי צבת אותו לתוך תא ואקום עד שאין בועות אוויר מופיעות התערובת.
- יוצקים את התערובת על תבנית סיליקון silanized או עובש דבק בצלחת פטרי להשיג ~ 2 מ"מ שכבה עבה של PDMS דגה עד שכל האוויר בועות להיעלם.
- לרפא את PDMS בתנורעל 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- השתמש אזמל לחתוך את שכבת PDMS במרחק של לפחות 5 מ"מ מן התכונות ולאחר מכן לקלף את PDMS נרפא את התבנית באמצעות פינצטה.
- פאנץ חור כניסת יחיד עם ביופסיה 1 מ"מ אגרוף בכל מקום על microchannel, רצוי בסוף רשת של microchannels כפי שניתן לראות באיור 2a ו -4.
- נקו את PDMS יצוק עם סרט דביק על מנת להסיר חלקיקי אבק adsorbed על גבי המכשיר. לעקר את המכשיר microchannel PDMS (יצוק PDMS) על ידי שטיפה עם תמיסה של אתנול 70% ואחריו מים סטריליים deionized (DI), ולחשוף את UV למשך 30 דקות.
- השאר את המכשיר PDMS סטרילי בצלחת פטרי סטרילית עד השימוש.
4. תשתית דפוסים
- מניחים את PDMS סטרילי יצוק באמצעות פינצטה על coverslip כוס סטרילית או בצלחת פטרי להפעיל לחץ עדין באמצעות קצה של פינצטה.
הערה: צוות השחקנים PDMS עושה קונפורמי אבל חותם הפיך עם GLcoverslip התחת או בצלחת פטרי להרכיב microchannels ללא שימוש בכל דבק. - מניח טיפה (20 - 40 μL) של פתרון המצע על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. תבנית Poly-D- ליזין (PDL) על ידי הצבת אגל 20 μL של PDL חיץ נתרן tetraborate על מפרצון של microchannels.
- שים את צלחת פטרי בחלל ריק של ~ 254 mmHgA (שווה ערך ל לשכן ואקום במעבדות ביולוגיות) במשך 10 דקות, ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות.
- לשחרר את הוואקום ולבחון את פתרון המצע זורם לתוך microchannel.
- דגירת הצלחת על התנאים המתאימים דבקות מצע. ראה לוחות 1 ו -2 תנאי דגירה (אלה משתנות בהתאם למצע). לקבלת דפוסי PDL, דגירה של 1 ש 'על 37 מעלות צלזיוס.
- בזהירות לקלף את חותמת PDMS באמצעות פינצטה סטרילית לשטוף את התבנית על coverslip זכוכית שלוש פעמים עם מים די. הוספת אלבומין 1% שור פתרון (BSA) כדי בצלחת פטרי לכסות את התבשיל או coverslip הזכוכית דגירה לילה בשעה 37 ° C.
הערה: זה יקטין דבקות שאינן ספציפיות באזורים ללא ציפוי. - לשאוב את פתרון 1% BSA, ואת המצע בדוגמת עכשיו הוא מוכן לשימוש.
5. דפוסים עקיפים של תאים
- הכן את ההשעיה תא בינוני תרבות סרום ללא. סוג התא צפיפות התאים מפורטים בטבלה 1.
- מוסיפים את ההשעיה תא אל צלחת פטרי בדוגמת ובאופן מוחלט לצלול באזור בדוגמת ההשעיה הסלולרי.
- דגירת צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף מצע בדוגמת.
- לשאוב את השעית התא העודפת מצלחת פטרי לשטוף את התאים בדוגמת שלוש פעמים עם בופר פוספט (PBS) תוך רעד בעדינות במשך 10 שניות כדי להסיר תאים פנויים.
- להוסיף אמדיום תרבות ppropriate אל בתרביות תאים בדוגמת דגירת התאים בדוגמת ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור.
6. דפוסים ישירים של תאים
הערה: טכניקה זו היא חלופת דפוסי התא העקיף כמתוארים בשלב 5. עם זאת, שלא כמו בשלב 5, בטכניקה זו תאים הם בדוגמת על משטחים בתרבית רקמה עם או בלי ציפוי מצע.
- לעקר את המכשיר microfluidic על ידי שטיפה עם תמיסה של 70% אתנול ואחריו מים DI.
- משרים את המכשיר לילה בתמיסה של BSA 1% כדי למנוע את הידבקות התא אל PDMS.
- לייבש את המכשיר בטמפרטורת החדר וצרף אותו לחלק התחתון של צלחת פטרי שטופלו בתרבית רקמה.
- הכן את השעית תא תקשורת ותרבות סרום ללא. סוג תא צפיפות תאים מפורטים בטבלה 2.
- מניחים טיפה (4 - 8 μL) של ההשעיה תא, מספיק כדי למלא אתmicrochannels, על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון.
- שים את צלחת פטרי בחלל ריק במשך 10 דקות ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. לשחרר את הוואקום ולבחון את ההשעיה תא לזרום לתוך microchannel.
- דגירת צלחת פטרי באינקובטור כדי לקדם את הידבקות תא בהתאם לתנאי הדגירה (תלוי בסוג של תא בדוגמת) ציין בטבלה 2. להוסיף PBS על צלחת פטרי השריית מכשיר PDMS.
- מקלפים את PDMS בזהירות מעל צלחת פטרי עם פינצטה לשטוף את התבנית עם PBS. הוסף מדיה תרבית תאים כדי בצלחת פטרי ומקום תרבית התאים בחממה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטה זו מאפשרת יצירת הדפוסים של חלבוני דפוסים עקיפים של תאים באמצעות ערוצי microfluidic למבוי סתומים עם ממדים קטנים כמו 10 מיקרומטר וציוד זמין כמעט בכל מעבדות ביולוגיות פעם עובש האמן הוא עשה. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת עם ערוצי microfluidic PDMS נוצרו באמצעות photolithography הרך מסורתי, או עם ערוצי microfluidic PDMS שנוצרו עם ייצור סרט דביק (איור 1) 28, 29. אנחנו הוכחנו בעבר את השימוש בהליך זה ב דפוסים עקיפים של תאים עצביים להערכה של הדרכת האקסון קולטני אור 4, 30, ועכשיו הוכחנו את השימוש בו כמה סוגי תאים נוספים ממקורות שונים. נוירונים בקליפת המוח עכברוש עובריים בדוגמת על פולי- D- ליזין (PDL) ומשטחים laminin להפגין adherenc כללידואר לאזורים בדוגמת והצמיחה לאורך PDL ופסי laminin (איור 3 א). שורות תאים myoblast C2C12 גם לדבוק באזור בדוגמת ולהפגין היתוך לתוך myotubes multinucleated (איור 3 ב). כמו כן, אנו צריכים להתאים את הטכניקה הזו עבור דפוסי תא ישירים כפי שראיתי עם פיברובלסטים באיור 4. כפי שדווח בעבר, שיטת דפוסי תא ישירה זה לא הראתה כל השפעה שלילית על תא הישרדות 30. המשתנה להוביל דפוסים ישירים או עקיפים מוצלחים של סוגי תאים כאמורים מפורטים בטבלת 1 ו -2. כך בעתיד, חוקרים עשויים לנצל את הטכניקה הזו לתאי דפוס ולגלות תופעות הקשורות הדפוסים הספציפיים שלהם.
איור 1: ייצור של עובש על ידי רך ליתוגרפיה. משמאל: Photolithographתהליך y. SU-8 הוא ספין מצופה על גבי פרוסות סיליקון, חשוף לקרינת UV, ופתחתי להסיר SU-8 העודף. מימין: תהליך ייצור סקוטש. סקוטש מצורף לשקופית זכוכית נקיה, לחתוך עם סכין מנתחים, וכן קלטת עודפת מוסר בזהירות. יצוק PDMS הוא מפוברק ומכל אחד עובש באמצעות ליתוגרפיה רך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: דוגמה להתקן PDMS עבור דפוסים המצע. (א) PDMS יצוק microfluidic עם כניסה המשמשת דפוסי microfluidic של מצעים. מפרצון היה אגרוף החוצה בקצה אחד של microchannels. (ב) ערוץ Microfluidic כפי שניתן לראות תחת מיקרוסקופ לעומת שלב. ערוצי Microfluidic הם 15 מ"מ אורך, 20 מיקרומטר רחב,ד מופרד 200 מיקרומטר. איור 2 הוא לשכפל באישור מלפרסם IOP. כל הזכויות שמורות 30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דפוסי תא עקיפים. (א) תהליך דפוסי חלבון סייע אבק. מכשיר PDMS ערוץ microfluidic מצורף בצלחת פטרי, פתרון מצע הוא נטען לתוך מפרצון, ואקום מוחל בקצרה לתא ושוחרר, מכשיר PDMS מוסר, דפוס נשטף, ומוכן לשימוש. (ב) נוירונים בקליפת המוח עכברוש עובריים זורעים על coverslip עם מצע PDL ו laminin בדוגמת. (ג) C2C12 שורות תאי myoblast גדלו על PDL ו laminin בדוגמת. 3 א ו 3C הדמויים הם בתמונות עם permission מלפרסם IOP. כל הזכויות שמורות 30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: דפוסי תא ישירים. (א - ג) פיברובלסטים בדוגמת באמצעות דפוסי תא ישירים. (א) מכשיר ערוץ Microfluidic מפוברק באמצעות ליתוגרפיה דבק. (ב) ערוצי Microfluidic לאחר המילוי עם השעית תא פיברובלסטים באמצעות טכניקת דפוסים סייעו ואקום. (ג) Fibroblasts לאחר הסרת המכשיר microfluidic. (ד) Calcein-AM מכתים של פיברובלסטים אחרי דפוסים microfluidic. (ה) שלב תמונה בעלת ניגודיות של פיברובלסטים אחרי דפוסי microfluidic. (ו - g 30. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| דפוסי תא עקיפים | מצע | תנאי דגירה חלבון | צפיפות התאים | Cell הדבקה משך |
| PC12 | קולגן-1 | 1 שעות ב 50 ° C | 5 x 10 6 / מ"ל | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס |
| פיברובלסטים | קולגן-1 | 1 שעות ב 50 ° C | 5 x 10 6 / מ"ל | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף PBS, הלילה ב 37 מעלות צלזיוס | 2 x 10 6 / מ"ל | 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס |
| נוירונים עובריים עכברוש קורטיקלי | PDL + Laminin | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף PBS, הלילה ב 37 מעלות צלזיוס | 2 x 10 6 / מ"ל | 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס |
| נוירונים רשתית סלמנדרה | סאל-1 | הלילה ב 10 ° C | N / A | 1 שעות ב 10 ° C |
טבלת 1: תנאי דפוסי תא עקיפים. רשימה של תנאי דגירה כגון סוג מצע, זמן, טמפרטורה, צפיפות תאים עבור סוגי תא טיפוסיים. חוקרים צריכים לייעל את תנאי הדגירה של מצעי הדגם וסוג התא שלהם. סאל-1 הוא המצע הנוגדן משמש לגדול נוירונים הסלמנדרה רשתית.
| דפוסי תא ישירים | מצע | צפיפות התאים | זמן הידבקות התא |
| PC12 | קולגן-1 | 6 x 10 6 / מ"ל | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס |
| פיברובלסטים | קולגן-1 | 6 x 10 6 / מ"ל | 1 ש 'ב 37 מעלות צלזיוס |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / מ"ל | 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס |
| נוירונים עובריים עכברוש קורטיקלי | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / מ"ל | 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס |
| נוירונים רשתית סלמנדרה | סאל-1 | N / A | 1 שעות ב 10 ° C |
= "1"> טבלה 2: תנאי דפוסי תא ישירים. רשימה של תנאי דגירה כגון טמפרטורה, זמן, ואת צפיפות תאים עבור סוגי תא טיפוסיים. חוקרים צריכים לייעל את תנאי הדגירה של סוג תא מודל שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעוד photolithography הקונבנציונלי היא טכניקה מבוססת היטב ליצירת תבניות עבור ליתוגרפיה רכה, הציוד, חומרים, ואת כישורים דרושים כדי להשתמש photolithography הקונבנציונלי אינם זמינים ברוב המעבדות. למעבדות ללא גישה למשאבים אלה, והצגנו ייצור סרט דביק כשיטה של יצירת תבניות עם תכונות פשוטות יחסית למכשירי microfluidic. שיטה זו מאפשרת לכל מעבדה ליצור ולנצל מכשירי microfluidic למטרות מחקר עם כלים זמינים. השיטה הדבקה ניתן לשפר עם חותך ויניל שולחן העבודה בעלות נמוכה 31. חותכים ויניל השולחן עשויים להגדיל שחזור, רזולוציה, וכן מורכבות פריסה. לכל אחת מהאפשרויות האלו, photolithography הקונבנציונלי, חותכי שולחן עבודה, או ייצור סרט דביק יש יכולות שונות ומגבלות וחוקר לשקול בזהירות איזו שיטה יספיקלצרכיהם.
בשנת PDMS נרפא, שרשרות פולימריות הארוכות של siloxane דימתיל יוצרות סריג, מבנה nanoporous היוצרת אזורים ריקים שניתן למלא עם מולקולות אוויר 27. רכוש חדיר גז זה הוא המפתח לשיטה שלנו של מילוי ערוצי microfluidic. כאשר מכניסים בסביבה בלחץ נמוך, מולקולות אוויר יוסרו עיקר החומר PDMS כמו גם microchannels עצמם 25. כאשר PDMS חשוף ואז הלחץ האטמוספרי, עיקר החומר PDMS ו microchannels לשמור על לחץ שלילי במשך זמן מה 25, 30. הלחץ השלילי הזה שואב נוזל לתוך microchannels אוטומטי מילוי ערוצי microfluidic. הלחץ השלילי הזה ממשיך לצייר נוזלי לתוך התעלה עד PDMS בתפזורת equilibrates עם הלחץ האטמוספרי.
טכניקת ואקום בסיוע זה מאפשרת patterning של חלבוני מצעים ספציפיים על מצע גידול. במחקר זה, הצלחנו דפוס כמה מצעים שונים סוגי תאים הן במישרין והן בעקיפין (טבלה 1 ו -2). עם זאת, הניסוי ייתכן שיהיה הצורך לבדוק פעמי דגירה שונות, צפיפות תא, או בתקשורת זריעת התאים מהסוג המסוים שלהם. משתנה אלה מתייחסים צפויים היכולת המולדת של מי מבני התא או המצע לדבוק פני השטח הוא שיוצב על. לדוגמא, כאן C2C12 תאים נדרשו השימוש בסרום ללא מדיה עבור מדיה הזריעה לפני culturing תאי DMEM עם סרום סוס 2%. בנוסף, תנאים עשויים להשתנות בהתאם אם coverslip כוס או צלחת פטרי פלסטיק מתבצע בדוגמת. כאן, הן עבדו היטב כדי לאפשר דפוסים ספציפיים של תאים מסוגים שונים.
אחד החששות הראשוניים שהיו לנו תוך שימוש בטכניקה זו היה איך החשיפה ואקום עשוי להשפיע על כדאיות התא. לימוד p זהמחקרים revious, לעומת זאת, צריך להקל על חששות אלה כפי שהראינו כי יש ואקום לא מעט על מנת להשפיע על מגוון של תאים 30. וואנג et al. בעבר נוצל degassed אטום באופן בלתי הפיך לתאי microfluidic לטעון תאי הלה 32. מחקרים אחרים השתמשו זריעת תאים בסיוע ואקום עבור מגוון רחב של סוגי תאים כולל תאי גזע אנושיים, תאים חסידים ולא חסידים, וקו תא כלאיים האוגר (א L) תאים לטעון לתוך ערוצי microfluidic 33. בנוסף, חוקרים אחרים החילו תאים ללחצי ואקום גדולים בהרבה בהשוואת המחקר הנוכחי עם מעט שום השפעה ניכרת על התאים 33. הבועות הנוצרות במהלך הסרת האוויר מן microchannel נוטים להתאסף על פני השטח של אגל של השעיה על כניסת. לעתים קרובות אלה בועות לא להתפקע עקב מתח הפנים של ההשעיה. אנחנו לא observאד ירידה ניכרת כדאיות התא עקב בועות. בנוסף, הניסוי עם Calcein-AM אינו מציע ירידה משמעותית כדאיות התא. בגלל זה, יש לנו לא בדק ביסודיות מוות של תאים במיוחד בשל בועות.
ניסיונות קודמים מצעי דפוס או תאים היו מנוגע לעתים קרובות על ידי בעיות כגון ההיווצרות של בועות אוויר בתוך מכשירי microfluidic. היווצרות של בועות אוויר הקשתה להזריק נוזלים בקלות וביעילות ללא שימוש בציוד או חומרים שאינם זמינים ברוב המעבדות. לדוגמה, השיטות הקודמות ניצלו את השימוש בטיפול פלזמה או טיפול קורונה כדי להקטין את הידרופוביות של microchannels PDMS 15, 34. בעוד יעיל, פלזמה כישוף קורונה אינם זמינים ברוב המעבדות. בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים את יכולת תאי דפוס מצעים פשוט באמצעות labora המשותףחללים טורי. באמצעות טכניקת ייצור סרט דביק, המתודולוגיה יכול להיות מנוצל כדי ליצור ערוצי microfluidic PDMS מצעים או תאים דפוס בכל מעבדה כמעט.
על מנת מצעי דפוס או תאים עם פרוטוקול דפוסי הוואקום, כמה צעדים חיוניים עבור דפוסים מוצלחים. ראשית, לפברק המאסטר קלטת דבק, דבק יש לצרף לחלוטין לשקופית זכוכית ללא בועות אוויר. בועות האוויר להחליש את הקשר בין הסרט לבין שקופיות זכוכית ועלול להוביל את הקלטת להיות קילף כאשר נרפא PDMS הוא קילף את התבנית בנייר דבק. בנוסף, בועות תעוותנה את הגיאומטריה של ערוץ microfluidic גרימת פני השטח של הערוצים להיות מישורים שאינם. כדי להפוך את PDMS שנוצקו עובש SU-8, עובש SU-8 חייב להיות silanized לפני הליהוק עם PDMS. שלב זה הוא קריטי במניעת הזוגיות הקבועה של PDMS אל עובש SU-8 לאחר הריפוי של PDMS. לפני איטום קונפורמישל ערוץ microfluidic PDMS כדי coverslips זכוכית או צלחות פטרי פלסטיק, יש לנקות את PDMS של כל חלקיקי האבק. חלקיקים אלה עשויים למנוע היווצרות של חותם קונפורמי בין PDMS וזכוכית ובכך למנוע הזרקה של תאים או מצעים לתוך הערוץ microfluidic. כאמור בפרוטוקול לעיל, ניקוי ערוצי PDMS עם דבק הוא קריטי לפני דבקות microchannel כדי coverslips זכוכית או צלחות פטרי פלסטיק. לבסוף, לאחר צבת המכשיר לתוך תא הוואקום, הוואקום חייב להשתחרר בעדינות כדי למנוע תזוזה של רביב של פתרון מצע או תא מחור המפרצון.
אם לא נוזל הוא ציין זורם לתוך תעלת microfluidic, ייתכנו דליפת ערוץ microfluidic שימנע נוזל לזרום לתוך התעלה. הסר את חותמת PDMS, יבשים לנקות אותו ולאחר מכן חזור על שלב 4, 5, או 6 של הטכניקה. אם הפתרון אינו זורם לתוך microchannel לאחר releASE של ואקום, להבטיח כי הפתרון מכסה את הפתח כליל של microchannel. ניתן לעשות זאת על ידי pipetting הפתרון מעלה ומטה מספר פעמים תוך שימת אותו בבור מפרצון. אם המצע, לאחר הזרקת לתוך microchannel, לא לצרף את הכוס, להעריך ולקבוע את תנאי הדגירה אופטימלית הכרחי המצע בשימוש. אם הסרת PDMS יצוק מפני השטח כוס או צלחת פטרי פלסטיק גורם לתאי או מצעים בדוגמת להיהרס, להשתמש בגבס PDMS רזה, להטביע את PDMS נוצקו PBS או מדיה, ולאט לאט ובעדינות לקלף את PDMS יצוק מן הכוס או משטח פלסטיק עם פינצטה.
לבסוף, BSA עשוי להיות קריטי בהפחתת הידבקות ספציפית של תאים משתי זכוכית unpatterned או משטח פלסטיק. BSA משמש בדרך כלל בתור הגיב חסימה מערבי סופג, immunostaining, וטכניקות ביולוגיה מולקולריות אחרות. חוקרים אחרים גם ניצלו את זה עקיף או ישירפרוטוקולי דפוסים כדי להקטין הידבקות תא ספציפי 35, 36, 37. מצאנו דגירה של המצע עם BSA הייתה הכרחית סוגי התאים ביותר למעט בתאי רשתית סלמנדרה. זה עשוי להיות בשל אופיו מיוחדים יותר של המצע (נוגדן בשם סאל-1) ששימש גם היעדר כללי של הידבקות התא על ידי תאים מסוג 38. בידיים שלנו, BSA גם לא ניכרת להקטין את הדבקות של תאים לאזורים בדוגמת ובעיקר הקטינו דבקות ספציפי.
אמנם שיטה זו נועדה להיות תכליתי וגמיש בבקשתה סוגי מצע תאים שונים, ישנם מספר מגבלות לפרוטוקול זה והתאים ואת המצע התואם. בגלל טבעו של דפוסי תאים על גבי משטח, סוגי התאים כי טכניקה זו ניתן ליישם מוגבלי those אשר ניתן לכל פרוטוקול דפוסים כגון אלה תאים מסוגלים לשרוד עם תא מוגבל יותר קשר תא, כמו גם אלה שיכולים לשרוד בריכוזי זריעת תא תחתונים. לדוגמא, אחד יישומים פוטנציאליים הם הדפוסים של תאי שמרים במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) 39. בעוד אנו בחנו רבי מצעי תאים שונים, מצעים אחרים לא יפעלו עם טכניקה מסוימת זה כמו אלה היוצרות ג'ל תלת ממדי. בשלב זה, יש לנו לא בדק אם ג'לים כראוי ליצור ולהישאר על פני השטח של coverslip כוס או צלחת פטרי פלסטיק אחרי דפוסים. טכניקה זו מסוגלת patterning צורות מורכבות שטחים גדולים. עם זאת, זה לא יכול דפוס מערך של צורות מופרדות בודדות ללא microchannels מקשרת. בהעדר microchannels ביניהם, כל צורה בודדת תדרוש כניסה משלה מה שהופכת את הטכניקה מסורבלת. למרות שאנו לא הבחנו בשום-אחידים אי patterning חלבון, חלוקת תאים בדוגמת בתוך microchannel עשויה להיות לא אחיד. הלא אחידות זה עשויה להיות בשל ההתפלגות האקראית של תאי המתלים תא, גיאומטריה וממדים של microchannels, וצמיגות של השעית התא.
בעתיד, טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על סוגים אחרים של מצעים ותאים. לדוגמה, תלת ממדי ג'ל כגון מטריקס קרום במרתף או פיגומים קולגן פוטנציאלי עלול להיות בדוגמת ויצרו באמצעות PDMS ערוצי microfluidic. על ידי הזרקת הידרוג'ל לתוך המכשיר microfluidic, הידרוג יכול לקחת על עצמו את הצורה של המכשיר microfluidic ולהיות מסוגלים ליצור תבניות מורכבות ללא שימוש מדפסות 3-D או טכנולוגיות אחרות. אלו ייאפשרו ליצירה מהירה של פיגומים מובנים עם כלים זמינים והתקני microfluidic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
מימון למחקר זה סופק על ידי ועדת ניו ג'רזי בחקר חוט השדרה (NJCSCR) (כדי FHK), להעניק CSCR14IRG005 (כדי BLF), NIH מענק R15NS087501 (כדי CHC), וקרן קירבי FM (כדי ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
