Introduction
I tissue engineering og biosensing, evnen til å kontrollere den romlige organiseringen av proteiner og celler på en skala um, er blitt mer og mer viktig i løpet av de siste fire tiår 1, 2, 3. Presis romlig organisering av proteiner og celler har tillatt forskere å undersøke interaksjonen mellom celler og substrater som inneholder samme eller forskjellige typer av celler, for å lede cellevekst, og for å immobilisere biomolekyler for fremstillingen av biosensorer, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Aktuelle metoder for mønster proteiner inkluderer photopatterning og mikro utskrift. Photopatterning anvender lysfølsomme materiale som er tverrbundet ved eksponering for Ultren fiolett (UV) lys. UV-lys rettet mot en fotomaske (bestående av gjennomsiktige områder med mørkere regioner for å hindre UV-lystransmisjon) forårsaker tverrbinding i bestemte regioner som deretter kan anvendes for etterfølgende festing av biomaterialer eller celler 10, 11. Mens denne ordningen er svært nøyaktig og gir mulighet for nøyaktig kontroll av topografien av kulturen overflaten, er det begrenset til UV-sensitive biomolekyler som kan mønstrede av UV-stråling 12. Mikro utskrift er en annen populær metode for mønstring spesifikke proteiner 13, 14. I denne fremgangsmåten blir et poly-dimetyl siloksan (PDMS) stempel ble behandlet med en rekke forskjellige overflatemodifiserende reagenser før de ble dyppet i en oppløsning av den valgte biomolekylære substratet. Den ble deretter forsiktig presset på et glass dekkglass eller en annen overflate dermed "stempling" av biomolekyler på kulturoverflaten. However, er stempling begrenset til den type materiale som kan overføres i tillegg til fukting av biomolekyler til overflaten av PDMS stempel 15.
Direkte fordelingen av cellene kan være mer vanskelig og er avhengig av kompliserte metoder som svitsjbare substrater, sjablong baserte metoder eller mønstre med spesifikke celleadhesjonsmolekyler 16, 17. Disse metodene er begrenset i deres evne til mønster-celler på grunn av mangel på kompatible celle adhesjon substrater, til uforlikelighet av fremgangsmåten arbeider med sensitive biologiske celler og begrensninger, inkonsistens i gjengi mønster, og kompleksiteten av prosedyren. For eksempel, med valgbar substrater, tilpasset underlag må være utformet for hver celletype, for å bytte sin tilslutning til spesifikke celletyper uten nedbrytning ved eksponering for UV-lys og varme som brukes i fremgangsmåten 17, < sup class = "xref"> 18, 19, 20. Sjablong basert mønstringsmetoder er allsidig i sin evne til mønster celler; Det er imidlertid vanskelig å fremstille PDMS sjablonger på de hensiktsmessige tykkelser for bruk 16, 21. Direkte injeksjon av celler i PDMS microfluidic kanaler har noen fordeler som for eksempel: 1) lette i fabrikasjon av microfluidic kanaler og 2) egnethet for mange ulike celler og underlag. Imidlertid er utbredt problemet med luftboble-fangst under sprøyteprosessen på grunn av hydrofobisiteten til PDMS uten bruk av plasma rengjøring, eller andre metoder for å redusere luftbobler, gjør det vanskelig å lage mønstret gående celler på glass- eller plastoverflater 21.
Dette arbeidet bygger videre kapillær micromolding 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 og rapporterer en metode for å injisere protein og cellesuspensjoner i mikro. Den brukes her metoden viser fordelingen av underlag og både direkte og indirekte fordelingen av spesifikke celletyper. Denne teknikk overvinner den høye hydrofobisitet av PDMS og eliminerer tilstedeværelsen av bobler under injeksjon av enten substrater eller celler ved å utnytte gass permeabiliteten av PDMS 27. Dette dokumentet viser bruken av teknikken med flere forskjellige substrater og celletyper. Artikkelen fremhever også ved fremstilling av støpeformer for myk litografi ved anvendelse av konvensjonell fotolitografi, samt en enkel og billig klebebånd metode som er nyttig i ressurs begrensede innstillinger 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Noen av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er giftige og kreftfremkallende. Vennligst bruk alle nødvendige sikkerhetsrutiner (avtrekkshette, hanskerom) og personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, lab frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko) ved bruk av giftige eller syre / base materialer.
1. Fabrikasjon av Master Former for Soft Litografi bruker Fotolitografi
- Tegn utformingen av microchannel ved hjelp av en dataassistert konstruksjon (DAK) tegneverktøy.
- Skriv ut oppsettet på en tom maske plate ved hjelp av laser maske skribent.
- Skyll en 4 tommers silisiumskive med aceton etterfulgt av isopropanol og tørk med en nitrogen luftkanon for å sikre at ikke noe oppløsningsmiddel er igjen på skiven.
- Dehydrere skiven ved å bake det på en varm plate ved 200 ° C i 5 minutter.
- Velge en negativ fotoresist konstruert for den ønskede høyde av mikrokanaler. Feller eksempel bruke negative fotoresist-SU-8 50 for å oppnå mikrokanaler med en høyde på 50 um.
- Tillate skiven å avkjøles til romtemperatur, og deretter justere den platen på chucken på et spinn belegger.
- Dispensere 4 ml (1 ml / inch diameter av skiven) av negativ fotoresist på midten av skiven.
- Spin frakk wafer med en to-trinns sentrifugering ved hjelp av en spinner. For det første gjelder en spredning syklus på 500 rpm med en akselerasjon på 100 rpm / s til 10 s. Deretter gjelder en sentrifuge av 2000 rpm med en akselerasjon på 300 rpm / s 2 for 30 s for å få et 50 um belegg av fotoresist på en wafer.
- Soft bake kjeks i to trinn på en varm plate i henhold til produsentens anvisninger. For en 50 um belegg av fotoresist, første pre-bake skiven ved 65 ° C i 6 minutter, og deretter umiddelbart rampe opp den varme platen temperatur for post-bake skiven ved 95 ° C i 20 min.
- La wafer avkjøles til romtemperatur, og deretter lastewafer på litografi scenen.
- Juster masken på wafer bruker maske aligner og utsett wafer for UV-lys (i henhold til produsentens anvisninger) med en intensitet på 1,5 mW / cm 2 for 146 s for å bruke den totale UV dose på 220 mJ / cm 2 kreves for en 50 um tykt lag av fotoresist.
- Påfør post eksponering bake til wafer i to trinn på en varm plate. For en 50-um belegg av fotoresist, første pre-bake skiven ved 65 ° C i 1 min og øyeblikkelig rampe opp den varme platen temperatur til post-bake det ved 95 ° C i 5 min.
- Utvikle wafer i ved å senke wafer i SU-8 utvikler og forsiktig risting før funksjonene blir klart på wafer. Utvikle wafer for ~ 6 min for 50 mikrometer tykk fotoresist.
- Skyll av overskytende utvikler med isopropanol og etanol, tørk wafer med nitrogen luftpistol.
- Hard bake silikonplaten på en varmeplate ved 150 ° C i 15 min.
- Plasserwafer i et tørke med 25 mL av silanizing agenten Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-en-triklorsilan.
MERK: silanizing middel er etsende, og dermed bør brukes i en syre / base avtrekkshette, med egnet personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko). - Anvende vakuum i 5 minutter og eksponere skiven for dampene av silan i 30 minutter uten å utløse vakuumet.
- Overfør skiven inn i en passende størrelse petriskål.
2. Fabrikasjon av Master Former for Soft litografi med tape
- Tegn utformingen av microchannel ved hjelp av et CAD tegneverktøy og skrive ut tegningen på hvitt papir.
- Rengjør et glass lysbilde stor nok til å romme design med isopropanol og tørk lysbildet med en luftkanon.
- Fest teip på den rengjorte glass lysbilde. Vær forsiktig med å felle noen luftbobler.
- Tape sidene av glass skyv på papiret med design, med tapesiden opp.
- Bruk en skalpell til å kutte tapen på glasset lysbildet bruker papir design som en referanse, og da løsner tapen fra uønskede områder av glass-slide.
- Skyll glass-slide med isopropanol og tørk med en luftkanon. Bake glass-slide i en ovn ved 65 ° C i 30 minutter.
- Forsiktig rulle over båndet med en gummivalsen for å fjerne luftbobler og tillate raset avkjøles til romtemperatur.
3. Soft Litografi Fabrikasjon av PDMS Devices
- Bland PDMS elastomer og dets herdemiddel i et forhold på 10: 1 (vekt: vekt), og blandingen rørt kraftig, og deretter avgassing av blandingen ved å plassere den i et vakuumkammer inntil ingen luftbobler vises i blandingen.
- Hell røren i en silanisert silisium mold eller teip mugg i en petriskål for å få en ~ 2 mm tykt lag av PDMS og Degas til all luft boblene forsvinner.
- Kurere PDMS i en ovnved 65 ° C i 2 timer.
- Bruk en skalpell til å kutte PDMS lag minst 5 mm unna funksjoner og deretter skrelle herdet PDMS utenfor mold ved hjelp av pinsetten.
- Slå et enkelt innløp hull med en 1 mm biopsi slag hvor som helst på microchannel, fortrinnsvis ved enden av et nettverk av mikrokanaler som vist i figur 2a og 4b.
- Rengjør PDMS støpt med teip for å fjerne støvpartikler adsorbert på enheten. Steriliser PDMS microchannel anordningen (PDMS støpt) ved skylling med en oppløsning av 70% etanol, etterfulgt av sterilt avionisert (DI) vann, og utsettes for UV i 30 minutter.
- Hold sterile PDMS-enheten i en steril petriskål inntil bruk.
4. Substrat Mønster
- Plasser sterile PDMS avgitte bruker pinsett på et sterilt glass dekkglass eller petriskål og trykk forsiktig med tuppen av pinsett.
MERK: PDMS cast gjør en konform, men reversibel tetning med glass dekk eller petriskål danner mikro uten bruk av lim. - Plassere en dråpe (20 - 40 ul) av substratet løsning på innløps helt dekker innløpshullet. Mønster Poly-D-lysin (PDL) ved å plassere en 20 ul dråpe av PDL i natriumtetraborat-buffer på innløpet av mikrokanaler.
- Sett petriskål i et vakuum på ~ 254 mmHgA (ekvivalent med husvakuum i biologiske laboratorier) i 10 minutter, og observere luft som kommer ut av kanalen i form av bobler.
- Frigjør vakuum og observere substratløsning som strømmer inn i microchannel.
- Inkuber fatet på de riktige forhold for underlaget tilslutning. Se tabellene 1 og 2 for inkuberingsbetingelser (disse varierer avhengig av substratet). For PDL mønstring, inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Nøye skrelle av PDMS stempel ved hjelp av sterile pinsetter og vaske mønster på dekkglass tre ganger med DI vann. Legg til en 1% bovint serumalbumin (BSA) løsning på petriskål for å dekke formen eller glass dekkglass og inkuberes over natten ved 37 ° C.
MERK: Dette vil redusere uspesifikk tilslutning i ubestrøket regioner. - Aspirer av 1% BSA-oppløsning, og det mønstrede substratet er nå klar til bruk.
5. Indirekte fordelingen av celler
- Fremstille cellesuspensjonen i serumfritt kulturmedium. Den celletype og celletettheten er oppført i tabell 1.
- Tilsett cellesuspensjon til det mønstrede petriskål og fullstendig neddykke den mønstrede område i cellesuspensjon.
- Inkuber petriskål ved 37 ° C i en inkubator i 15 min for å tillate cellene å feste til det mønstrede substratet.
- Aspirer skytende cellesuspensjonen fra petriskålen og vaske de mønstrede cellene tre ganger med fosfatbufret saltvann (PBS) under forsiktig risting i 10 s for å fjerne ufestede celler.
- Tilsett enppropriate kulturmedium til de mønstrede cellekulturer og inkuber mønstrede cellene ved 37 ° C i en CO2 inkubator.
6. Direkte fordelingen av celler
NB: Denne teknikken er et alternativ til den indirekte celle mønster som er beskrevet i trinn 5. Imidlertid, i motsetning til i trinn 5 i denne teknikken celler som er mønstret på vevskultur overflater med eller uten substrat belegg.
- Steriliser mikrofluid enheten ved å skylle med en oppløsning av 70% etanol, fulgt av avionisert vann.
- Sug anordningen over natten i en løsning av 1% BSA for å forhindre celleadhesjon til PDMS.
- Tørk enheten ved romtemperatur og fest den til bunnen av vevskultur behandlet petriskål.
- Forbered cellesuspensjonen i serumfrie kulturmedier. Den celletype og celletettheten er oppført i tabell 2.
- Plassere en dråpe (4 - 8 ul) av cellesuspensjonen, nok til å fyllemikrokanaler, på innløps helt dekker innløpshullet.
- Sett petriskål i et vakuum i 10 minutter og observer luft som kommer ut av kanalen i form av bobler. Frigjør vakuum og observere cellesuspensjonen strømmer inn i microchannel.
- Inkuber petriskål i en inkubator for å fremme celleadhesjon i henhold til inkuberingsbetingelser (avhenge av celletype mønstrede) som er nevnt i tabell 2. Legg PBS til petriskål nedsenke PDMS-enheten.
- Skrell PDMS nøye av petriskål med pinsett og vaske mønster med PBS. Legg cellekultur media til petriskålen og legg cellekultur i kuvøse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden gjør at fordelingen av proteiner og indirekte fordelingen av celler ved hjelp av dead-end microfluidic kanaler med dimensjoner så små som 10 mikrometer og utstyr tilgjengelig i nesten alle biologiske laboratorier gang master mold er gjort. Denne teknikken kan benyttes med PDMS microfluidic kanaler som er opprettet ved hjelp av tradisjonell myk fotolitografi, eller med PDMS microfluidic kanaler som er opprettet med teip fabrikasjon (figur 1) 28, 29. Vi har tidligere demonstrert ved bruk av denne fremgangsmåten i indirekte fordelingen av neuronale celler for vurdering av axon veiledning i fotoreseptorer 4, 30, og har nå demonstrert sin anvendelse i flere andre celletyper av varierende opprinnelse. Embryonale rotte kortikale nevroner mønstret på poly-D-lysin (PDL) og laminin overflater demonstrere generell adherence til de mønstrede områder og vekst langs PDL og laminin striper (figur 3A). C2C12 myoblast cellelinjer også følge den mønstrede området og demonstrere fusjon i multinucleated myotubes (Figur 3B). Vi har også tilpasset denne teknikken for direkte celle mønster som sees med fibroblaster i figur 4. Som tidligere rapportert, viste at dette direkte celle mønstring metode noen ugunstig effekt på celleoverlevelse 30. Variablene som fører til vellykket direkte eller indirekte fordelingen av angitte celletyper er oppført i tabell 1 og 2. Dermed i fremtiden kan forskerne bruke denne teknikken til mønster celler og oppdage fenomener knyttet til deres spesifikke mønster.
Figur 1: Fabrikasjon av Mold av Soft litografi. Venstre: Photolithography prosess. SU-8 er rotasjonsbelagt på en silisiumskive, eksponert for UV-stråling, og er utviklet for å fjerne overskudd av SU-8. Høyre: Limbånd fabrikasjon prosessen. Klebebånd er festet til et rent objektglass, kuttet med en skalpell, og overskudd tape er omhyggelig fjernet. PDMS cast deretter fabrikkert fra hver form ved hjelp av myke litografi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Eksempel på en PDMS Enhet for Substrat Mønster. (A) PDMS microfluidic støpt med innløp brukt for mikrofluid mønster av underlag. Innløp ble det stanset ut i den ene enden av mikrokanaler. (B) mikrofluidkanal som sees under fasekontrastmikroskopi. Mikrofluidkanalene er 15 mm i lengde, 20 um brede, and atskilt med 200 um. Figur 2 er gjengitt med tillatelse fra IOP Publishing. Alle rettigheter reservert 30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Indirekte Cell Mønster. (A) vakuum assistert protein mønstringsprosess. PDMS mikrofluidkanalanordning er festet til en petriskål, er substratoppløsning lastet inn i innløpet, blir vakuum kort pålagt til kammeret og frigjort, PDMS-enheten er fjernet, mønster blir vasket, og klar til bruk. (B) embryonale kortikale rotte nevroner sådd ut på et dekkglass med en mønstret PDL og laminin underlaget. (C) C2C12 myoblast cellelinjer dyrket på mønstret PDL og laminin. Figurene 3a og 3c er gjengitt med permission fra IOP Publishing. Alle rettigheter reservert 30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Direkte Cell Mønster. (A - c) Fibroblaster mønstrede via direkte celle mønster. (A) mikrofluidkanal enhet fabrikkert ved hjelp av teip litografi. (B) microfluidic kanaler etter fylling med fibroblast cellesuspensjonen med vakuum assistert mønster teknikk. (C) fibroblaster etter fjerning av mikrofluidenhet. (D) Calcein-AM farging av fibroblaster etter mikrofluid mønster. (E) Fase kontrast bilde av fibroblaster etter microfluidic mønster. (F - g 30. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Indirekte Cell Mønster | Underlag | Protein Inkuberingsbetingelsene | Cell Tetthet | Celle adhesjon Varighet |
| PC12 | Kollagen-en | 1 time ved 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 time ved 37 ° C |
| fibroblast | Kollagen-en | 1 time ved 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 time ved 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 time ved 37 ° C, vask PBS, over natten ved 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Embryonic Rat kortikale nevroner | PDL + Laminin | 1 time ved 37 ° C, vask PBS, over natten ved 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Salamander Retinal Neurons | Sal-en | over natten ved 10 ° C | N / A | 1 time ved 10 ° C |
Tabell 1: Indirekte Cell mønster betingelser. Liste over inkuberingsbetingelser som substrattype, tid, temperatur, og celletettheten for typiske celletyper. Forskere skal optimalisere inkubasjonsforhold for sine egne modell underlag og celletype. Sal-1 er antistoffet substrat som brukes til å dyrke Salamander retinale nerveceller.
| Direkte Cell Mønster | Underlag | Cell Tetthet | Celle adhesjon tid |
| PC12 | Kollagen-en | 6 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| fibroblast | Kollagen-en | 6 x 10 6 / ml | 1 time ved 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Embryonic Rat kortikale nevroner | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 minutter ved 37 ° C |
| Salamander Retinal Neurons | Sal-en | N / A | 1 time ved 10 ° C |
Tabell 2: Direkte Cell mønster betingelser. Liste over inkuberingsbetingelser som temperatur, tid, og celletettheten for typiske celletyper. Forskere skal optimalisere inkubasjonsforhold for sin egen modell celletype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens konvensjonell fotolitografi er en veletablert teknikk for etablering av støpeformer for myk litografi, utstyr, materialer og ferdigheter som er nødvendige for å bruke vanlig fotolitografi er ikke lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. For laboratorier uten tilgang til disse ressursene, har vi presentert teip fabrikasjon som en metode for å skape former med relativt enkle funksjoner for microfluidic enheter. Denne metoden lar enhver laboratorium for å skape og utnytte microfluidic enheter for forskningsformål med lett tilgjengelige verktøy. Adhesivbåndet Fremgangsmåten kan forbedres med en rimelig stasjonær vinyl cutter 31. Stasjonær vinyl kuttere kan øke reproduserbarheten, oppløsning, samt utformingen kompleksitet. Hver av disse alternativene, konvensjonell fotolitografi, stasjonære kappemaskiner, eller teip fabrikasjon har ulike muligheter og begrensninger og forskere må nøye vurdere hvilken metode som ville være tilstrekkeligfor deres behov.
I herdede PDMS, de lange polymere kjeder av dimetylsiloksan danner et gitter, nanoporøse struktur som skaper tomme områder som kan fylles med luftmolekyler 27. Denne gassen permeabilitet er nøkkelen til vår metode for å fylle microfluidic kanaler. Når den plasseres i et miljø med lavt trykk, blir luftmolekyler fjernet fra PDMS massegodset samt microchannels selv 25. Når PDMS blir deretter utsatt for atmosfæretrykk, PDMS massegodset og mikrokanaler beholde et negativt trykk i en tid 25, 30. Dette undertrykk trekker væske inn i microchannels automatisk fyller microfluidic kanaler. Dette negative trykk fortsetter å trekke væske inn i kanalen inntil bulk PDMS likevekt med atmosfærisk trykk.
Dette vakuum-assistert teknikken gjør det mulig for patterning av spesifikke proteiner og substrater på et vekstsubstrat. I denne studien kunne vi mønsteret flere ulike underlag og celletyper både direkte og indirekte (Tabell 1 og 2). Imidlertid kan eksperimentator må teste forskjellige inkubasjonstider, celletettheter, eller seeding media for deres bestemt celletype. Disse variablene sannsynlig forholde seg til medfødt evne til enten cellen eller substrat for å holde fast på overflaten den blir plassert på. For eksempel, her C2C12 celler kreves bruk av serum-frie medier for seeding media før dyrking av cellene i DMEM med 2% hesteserum. I tillegg kan forholdene variere basert på hvorvidt et glass dekkglass eller plastpetriskål blir mønstret. Her, begge fungerte bra for å tillate bestemte fordelingen av ulike celletyper.
En av de første bekymringene vi hadde mens utnytte denne teknikken var hvordan eksponering for vakuum kan påvirke cellenes levedyktighet. Denne studien og porrige studier har imidlertid bør lindre disse bekymringene som vi har vist at vakuum har liten eller ingen virkning på en rekke celler 30. Wang et al. tidligere benyttet avgasset irreversibelt forseglet microfluidic kamre for å laste HeLa celler 32. Andre undersøkelser har anvendt vakuum-assistert celle seeding for en rekke celletyper, inkludert humane stamceller, adherente og ikke-adherente celler og human-hamster hybridcellelinje (A L) celler for å laste inn i microfluidic kanaler 33. I tillegg har andre forskere kastet celler til mye større vakuumtrykk i forhold til denne studien med liten eller ingen merkbar effekt på cellene 33. Bobler som dannes under fjerning av luft fra microchannel tendens til å samles på overflaten av dråpene av suspensjonen ved innløpet. Ofte er disse boblene ikke briste på grunn av overflatespenningen av suspensjonen. Vi har ikke Observed en merkbar nedgang i celle levedyktighet grunn av bobler. I tillegg vil eksperimentere med Calcein-AM ikke foreslå en betydelig reduksjon i celle levedyktighet. På grunn av dette har vi ikke er grundig undersøkt celledød spesielt på grunn av bobler.
Tidligere forsøk på mønster substrater eller celler ble ofte plaget av problemer som for eksempel dannelse av luftbobler i microfluidic enheter. Dannelsen av luftbobler har gjort det vanskelig å injisere væsker enkelt og effektivt uten bruk av utstyr eller materialer som ikke er tilgjengelige i de fleste laboratorier. For eksempel, tidligere metoder benyttet ved bruk av plasma behandling eller koronabehandling for å redusere hydrofobisiteten av PDMS mikrokanaler 15, 34. Mens effektiv, plasma og korona behandlere ikke er lett tilgjengelig i de fleste laboratorier. I denne protokollen, viser vi muligheten til mønster celler og underlag bare å bruke vanlig laboraTory støvsugere. Ved hjelp av selvklebende tape fremstillingsteknikk kan metoden benyttes til å skape PDMS microfluidic kanaler til mønster substrater eller celler i nesten en hvilken som helst laboratorium.
For å mønster substrater eller celler med vakuum mønstring protokollen, flere trinn er kritisk for vellykket mønster. Først, for å fremstille klebebåndet master, klebebåndet må være fullstendig festet til glass-slide og fri for luftbobler. Luftbobler svekke bindingen mellom båndet og objektglasset, og kan føre til at båndet blir trukket av når herdet PDMS er skrellet av tapen formen. I tillegg vil boblene forvrenge geometrien av mikrofluidkanalen forårsaker overflate av kanalene for å være ikke-plan. For å gjøre PDMS kastet fra SU-8 mold, må SU-8 mold bli silanisert før støping med PDMS. Dette trinnet er kritisk for å hindre den permanente binding av PDMS til SU-8 formen etter herding av PDMS. Før konforme forseglingav PDMS mikrofluidkanalen til dekkglass eller plast-petriskåler, må PDMS renses for alle støvpartikler. Disse partiklene kan hindre dannelsen av en konform tetning mellom PDMS og glass, og dermed hindre injeksjon av celler eller substrater inn i mikrofluidkanalen. Som det fremgår av ovennevnte protokoll, rengjøring av PDMS-kanaler med teip er kritisk før man følger microchannel til dekkglass eller plastpetriskåler. Til slutt, etter å plassere enheten inn i vakuumkammeret, vakuumet må være forsiktig frigjort for å forhindre forskyvning av dråpen av substratet eller celleløsning fra innløpshullet.
Hvis ingen væske observeres strømmer inn i mikrofluidkanalen, kan det være en lekkasje i mikrofluidkanal som ville hindre væske fra å strømme inn i kanalen. Ta av PDMS stempel, tørr og rengjør den og deretter gjenta trinn 4, 5 eller 6 av teknikken. Dersom løsningen ikke strømmer inn i microchannel etter release av vakuum, sikre at løsningen er helt dekker inngangen til microchannel. Dette kan gjøres ved å pipettere løsningen opp og ned flere ganger mens sette den i innløpshullet. Dersom substratet, etter injisering inn i microchannel, ikke fester seg til glasset, evaluere og bestemme de optimale inkuberingsbetingelser som er nødvendig for substratet som brukes. Hvis du fjerner PDMS kastet fra glassflaten eller plast petriskål forårsaker mønstrede celler eller underlag for å bli ødelagt, må du bruke en tynnere PDMS cast, senk PDMS støpt i PBS eller media, og sakte og forsiktig skrelle av PDMS kastet fra glasset eller plastoverflaten med pinsett.
Endelig kan BSA være kritisk i å redusere ikke-spesifikk adhesjon av celler til enten umønstret glass eller plastoverflaten. BSA er vanligvis brukt som et blokkerende reagens i western blotting, immunfarging, og andre molekylærbiologiske teknikker. Andre forskere har også brukt det for indirekte eller direktemønstrings protokoller for å redusere ikke-spesifikk celle-adhesjon 35, 36, 37. Vi fant at inkubering av substratet med BSA som var nødvendig for de fleste celletyper unntatt for salamander netthinneceller. Dette kan være på grunn av den mer spesialiserte arten av substratet (et antistoff kalt Sal-1) som ble brukt i tillegg til den generelle mangel på celleadhesjon ved denne celletype 38. I våre hender, BSA heller ikke merkbart redusere etterlevelse av celler til de mønstrede områder og tjente hovedsakelig å redusere uspesifikk tilslutning.
Selv om denne metoden er konstruert for å være allsidig og fleksibel i sin anvendelse til forskjellige substrat og celletyper, er det flere begrensninger i denne protokollen, og de kompatible cellene og substrat. På grunn av selve innholdet av mønstring av celler på en overflate, celletypene som denne teknikken kan brukes til er begrenset til those som er mottagelig for en hvilken som helst mønster protokoll slik som de celler som er i stand til å overleve med mer begrenset celle til celle-kontakt, så vel som de som kan overleve i det nedre celle seeding konsentrasjoner. For eksempel, er en potensiell anvendelse mønstringen av gjærceller for atomkraftmikroskopi (AFM) 39. Mens vi har testet mange forskjellige celle substrater, kan andre substrater ikke virke med denne teknikk, slik som de som danner tredimensjonale geler. På denne tiden, har vi ikke undersøkt om gelene skal danne og holde seg på overflaten av glass dekkglass eller plast-petriskål etter mønstring. Denne teknikken er i stand til å mønstre komplekse former og store områder. Men det kan ikke mønsteret en rekke individuelle skilt figurer uten sammenhengende microchannels. I fravær av innbyrdes forbundne mikrokanaler, vil hver enkelt form krever sitt eget innløp gjør teknikken tungvint. Selv om vi ikke merke noen ikke-ensartethet i patterning protein, kan fordelingen av celler mønster inne i microchannel være ikke-uniform. Denne ikke-ensartethet kan være på grunn av den tilfeldige fordelingen av celler i cellesuspensjoner, geometri og dimensjoner av mikrokanaler, og viskositeten av cellesuspensjonen.
I fremtiden kan denne teknikken brukes på andre typer underlag og celler. For eksempel, kan tre-dimensjonale geler så som basalmembran matriks eller kollagenstillasene potensielt være mønstret og dannet ved hjelp av PDMS microfluidic kanaler. Ved å injisere en hydrogel inn i mikrofluid enhet, kan hydrogelen ta på formen av mikrofluidanordningen og være i stand til å danne komplekse mønstre uten bruk av 3-D-skrivere eller andre teknologier. Disse ville tillate for rask etablering av strukturerte stillas med lett tilgjengelige verktøy og microfluidic enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Midler til denne forskningen ble gitt av New Jersey Commission on Spinal Cord forskning (NJCSCR) (til FHK), gi CSCR14IRG005 (til BLF), NIH gi R15NS087501 (til CHC) og FM Kirby Foundation (til ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
