Introduction
Em engenharia de tecidos e biosensing, a capacidade de controlar a organização espacial de proteínas e células em uma escala um, tornou-se cada vez mais importante ao longo das últimas quatro décadas 1, 2, 3. Organização espacial precisa de proteínas e células tem permitido aos pesquisadores examinar a interação entre as células e os substratos que contêm tipos semelhantes ou diferentes de células, para orientar o crescimento celular, e para imobilizar biomoléculas para a fabricação de biossensores 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Os métodos atuais de proteínas padronização incluem photopatterning e impressão microcontact. Photopatterning utiliza material sensível à luz que é reticulado por exposição a ultruma violeta (UV). Luz UV dirigida a uma fotomáscara (consistindo em áreas transparentes com regiões mais escuras para evitar a transmissão de luz UV) provoca reticulação em regiões específicas que podem então ser utilizados para a subsequente ligação de biomateriais ou células 10, 11. Embora este esquema é muito preciso e permite o controle preciso da topografia da superfície da cultura, é limitada a biomoléculas sensíveis aos raios UV, que pode ser modelado por radiação UV 12. Impressão microcontact é outro método popular de padronização proteínas específicas 13, 14. Neste método, um siloxano (PDMS) selo poli-dimetil é tratada com uma variedade de reagentes de modificação da superfície antes de ser embebido numa solução de substrato escolhido biomolecular. Em seguida, é suavemente pressionado para uma lamela de vidro ou outra superfície assim "estampagem" a biomolécula sobre a superfície da cultura. HoWever, estampagem se limita ao tipo de material que pode ser transferido assim como a molhabilidade de biomoléculas à superfície do PDMS selo 15.
Padronização directa de células pode ser mais difícil e baseia-se em métodos de complexos, tais como substratos comutáveis, métodos com base estêncil, ou modelação com moléculas de adesão celular específicos 16, 17. Estes métodos estão limitados na sua capacidade de células de teste padrão, devido à falta de substratos de adesão celular compatíveis, a incompatibilidade do processo para o trabalho com células sensíveis biológicos e constrangimentos, inconsistência em reproduzir o padrão e a complexidade do processo. Por exemplo, substratos com comutáveis, substratos mercadorias necessitam de ser concebido para cada tipo de célula, para mudar a sua adesão a tipos específicos de células, sem a degradação por exposição à luz UV e calor usado no processo 17, < classe sup = "xref"> 18, 19, 20. Estêncil métodos de padronização com base são versáteis em sua capacidade de células padrão; No entanto, é difícil fabricar matrizes PDMS nas espessuras adequadas para utilização 16, 21. injeção direta de células em canais microfluídicos PDMS tem algumas vantagens, tais como: 1) facilidade na fabricação de canais microfluídicos e 2) adequação para muitas células e diferentes substratos. No entanto, o problema predominante de captura de bolhas de ar durante o processo de injecção devido à hidrofobicidade dos PDMS sem o uso de limpeza de plasma, ou outros métodos para diminuir as bolhas de ar, faz com que seja difícil criar consistentemente células modelado sobre superfícies de vidro ou de plástico 21.
Este trabalho expande micromolding capilar 22, 23,lass = "refex"> 24, 25, 26 e relata um método para injectar suspensões de células de proteína e em microcanais. O método utilizado aqui demonstra a padronização de substratos e ambos padronização direta e indireta de tipos específicos de células. Esta técnica ultrapassa a elevada hidrofobicidade de PDMS e elimina a presença de bolhas durante a injecção quer de substratos ou células, tirando proveito da permeabilidade aos gases de PDMS 27. Este documento revela a utilização da técnica com vários substratos diferentes e tipos de células. O artigo também destaca a fabricação de moldes para litografia macia usando fotolitografia convencional, bem como um método simples e adesivo de baixo custo tape útil em recursos configurações limitadas 28, 29.
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Protocol
NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Alguns dos produtos químicos utilizados no presente protocolo são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas (extractor de fumo, porta-luvas) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados) ao utilizar materiais tóxicos ou ácido / base.
1. Fabricação de Mestre Moldes para macio Litografia usando fotolitografia
- Desenhar o layout dos microcanais, utilizando uma ferramenta de desenho assistido por computador (CAD).
- Imprimir o layout em uma placa de máscara em branco usando escritor máscara laser.
- Lavar uma bolacha de silício de 4 polegadas com acetona seguido de isopropanol e seco com uma pistola de ar de azoto para assegurar que não solvente é deixado sobre a bolacha.
- Desidratar a bolacha cozendo-o sobre uma placa quente a 200 ° C durante 5 min.
- Selecione um fotorresiste negativo projetado para a altura desejada dos microcanais. Fou exemplo, usar fotorresistente negativo SU-8 50 para obter microcanais com uma altura de 50 mm.
- Permitir que a bolacha se arrefecer até à temperatura ambiente, e depois alinhar a bolacha sobre o mandril de uma máquina de revestimento de centrifugação.
- Dispensar 4 mL (um diâmetro / polegada mL da bolacha) de material fotosensitivo negativo para o centro da bolacha.
- Girar revestir o wafer com um ciclo de centrifugação de duas etapas usando um spinner. Em primeiro lugar, aplicam-se um ciclo de propagação de 500 rpm, com uma aceleração de 100 rotações / s para 10 s. Em seguida, aplicar um ciclo de centrifugação de 2000 rpm, com uma aceleração de 300 rotações / s para 30 s 2 para se obter um revestimento de 50 um de material fotosensitivo sobre uma bolacha.
- coza macia do wafer em duas etapas em uma placa quente de acordo com as instruções do fabricante. Para um revestimento de 50 um de foto-resistente, em primeiro lugar pré-cozem a bolacha a 65 ° C durante 6 minutos e depois rampa imediatamente acima da temperatura da placa quente para o pós-coza a bolacha a 95 ° C durante 20 min.
- Permitir que a bolacha se arrefecer até à temperatura ambiente e, em seguida, carregar owafer para o palco litografia.
- Alinhar a máscara sobre a bolacha usando alinhador máscara e expõe a bolacha à luz UV (de acordo com as instruções do fabricante), a uma intensidade de 1,5 mW / cm2 durante 146 s de aplicar a dose total de UV de 220 mJ / cm 2 necessária para uma 50 um espessa camada de fotorresiste.
- Aplicar coza pós exposição ao wafer em duas etapas em uma placa quente. Para um revestimento de 50 mícrons de material fotosensitivo, primeiro pré-cozem a bolacha a 65 ° C durante 1 min e imediatamente rampa até a temperatura da placa quente para o pós-asse a 95 ° C durante 5 min.
- Desenvolver o wafer em submergindo a bolacha em SU-8 desenvolvedor e agitando até que os recursos tornam-se claras sobre o wafer. Desenvolver o wafer de ~ 6 min para o fotorresiste de espessura 50 mm.
- Lavar o excesso de desenvolvedor com isopropanol e etanol, em seguida, secar o wafer com uma pistola de ar de azoto.
- Disco cozer a bolacha de silício sobre uma placa quente a 150 ° C durante 15 min.
- Coloque obolacha num exsicador com 25 uL do agente de silanização tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorossilano.
NOTA: O agente de silanização é corrosivo, portanto, deve ser usado em um exaustor de ácido / base, com equipamento adequado de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, fechou-toe sapatos). - Aplicar vácuo durante 5 minutos e expor a bolacha aos vapores de silano durante 30 min sem libertar o vácuo.
- Transferir a bolacha em um prato de Petri de tamanho adequado.
2. Fabricação de Mestre Moldes para macio Litografia com fita adesiva
- Desenhar o layout dos microcanais, utilizando uma ferramenta de desenho CAD e imprimir o desenho em papel branco.
- Limpar uma lâmina de vidro grande o suficiente para acomodar o projeto com isopropanol e depois secar o slide com uma pistola de ar.
- Anexar fita adesiva sobre a lâmina de vidro limpa. Seja não tomar cuidado para prender as bolhas de ar.
- Tape os lados do GLAss deslizar sobre o papel com o design, com o lado da fita para cima.
- Usar um bisturi para cortar a fita sobre a lâmina de vidro usando o design de papel como uma referência e, em seguida, descascar fita de áreas não desejadas de a lâmina de vidro.
- Lavar a lâmina de vidro com isopropanol e depois seque com uma pistola de ar. Cozer a lâmina de vidro em um forno a 65 ° C durante 30 min.
- Rolar suavemente sobre a fita adesiva com um rolo de borracha para retirar as bolhas de ar e permitir que a corrediça se arrefecer até à temperatura ambiente.
3. Macio Litografia Fabricação dos dispositivos PDMS
- Misture PDMS elastómero e o seu agente de cura numa proporção de 10: 1 (w: w), agita-se a mistura vigorosamente, e, em seguida, desgaseificar a mistura, colocando-o em uma câmara de vácuo até que não há bolhas de ar aparecer na mistura.
- Verter a mistura para um molde de silício silanizada ou molde de fita adesiva num prato de petri para obter um ~ 2 espessa camada de PDMS e desgaseificar mm até todo o ar bolhas desaparecem.
- Curar o PDMS em um fornoa 65 ° C durante 2 h.
- Use um bisturi para cortar a camada de PDMS pelo menos 5 mm de distância das características e, em seguida, descasque as PDMS curado fora do molde usando pinça.
- Um único orifício de entrada com uma biópsia de um milímetro perfurar qualquer lugar no microcanal, de preferência ao fim de uma rede de microcanais como pode ser visto na Figura 2-A e 4-B.
- Limpar o PDMS expressos com fita adesiva para remover partículas de poeira adsorvidos sobre o dispositivo. Esteriliza-se o dispositivo de microcanal PDMS (PDMS fundido) por lavagem com uma solução de etanol a 70%, seguido por estéril desionizada (DI) de água, e expor a UV durante 30 min.
- Manter o dispositivo PDMS estéril numa placa de Petri estéril até à sua utilização.
4. Substrato Padronização
- Coloque as PDMS estéreis expressos usando uma pinça para uma lamela de vidro esterilizada ou placa de petri e aplique uma leve pressão com a ponta da pinça.
NOTA: O elenco PDMS faz um conformado, mas vedação reversível com a gllamela asno ou placa de petri formando microcanais sem o uso de qualquer adesivo. - Coloque uma gota (20 - 40 ul) da solução de substrato na entrada cobrindo completamente o orifício de entrada. Padrão poli-D-lisina (PDL), colocando uma gota de 20 ul de PDL em tampão tetraborato de sódio na entrada dos microcanais.
- Colocar a placa de Petri num vácuo de ~ 254 mmHgA (equivalente a uma câmara de vácuo em laboratórios biológicos) durante 10 min, e observar o ar que sai do canal sob a forma de bolhas.
- Desligar o vácuo e observar a solução de substrato que flui para o microcanal.
- Incubar o prato com as condições adequadas para a adesão substrato. Ver Quadros 1 e 2 para as condições de incubação (estes variam dependendo do substrato). Para padronização PDL, incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Retire cuidadosamente o selo PDMS usando uma pinça estéreis e lavar o padrão na lamela de vidro três vezes com água DI. Adicionar uma solução a 1% de albumina de soro bovino (BSA) para a placa de petri para cobrir o prato ou a lamela de vidro e incubar durante a noite a 37 ° C.
NOTA: Isto irá reduzir a aderência não específica em regiões não revestidos. - Aspirar fora a solução de BSA a 1%, e o substrato modelado está agora pronto para usar.
5. Padronização indireta de Células
- Preparar a suspensão de células em meio de cultura isento de soro. O tipo de célula e a densidade de células são listadas na Tabela 1.
- Adicionar a suspensão de células para o prato modelado Petri e completamente imersa a região modelada em suspensão de células.
- Incubar a placa de Petri a 37 ° C em uma incubadora durante 15 minutos para permitir que as células para anexar o substrato modelado.
- Aspirar o excesso de suspensão de células a partir da placa de Petri e lavar as células modelado três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS), enquanto agitando durante 10 segundos para remover células não ligadas.
- Adicionar a umppropriate cultura médio para as culturas de células padronizadas e incubar as células padronizadas a 37 ° C em uma incubadora de CO 2.
6. Padronização direta de células
NOTA: Esta técnica é uma alternativa à padronização de células indirecto descrito no passo 5. No entanto, ao contrário de no passo 5, nesta técnica células são modelados em superfícies de cultura de tecidos com ou sem revestimento de substrato.
- Esteriliza-se o dispositivo de microfluidos por lavagem com uma solução de 70% de etanol seguido por água desionizada.
- Embeber o dispositivo durante a noite numa solução de 1% de BSA para evitar a adesão celular ao PDMS.
- Seca-se o dispositivo à temperatura ambiente e coloque-o da parte inferior da placa de petri tratadas com cultura de tecidos.
- Preparar a suspensão de células em meio de cultura isento de soro. O tipo de célula e a densidade de células são listadas na Tabela 2.
- Coloque uma gota (4-8 mL) da suspensão de células, suficiente para encher omicrocanais, na entrada cobrindo completamente o orifício de entrada.
- Colocar a placa de petri em vácuo durante 10 minutos e observar ar que sai do canal sob a forma de bolhas. Desligar o vácuo e observar a suspensão de células que flui para o microcanal.
- Incubar a placa de Petri dentro de uma incubadora para promover a adesão celular de acordo com as condições de incubação (dependem do tipo de célula modelado) mencionado na Tabela 2. Adicionar PBS numa placa de Petri submergindo o dispositivo de PDMS.
- Descasque o PDMS com cuidado para fora da placa de Petri com uma pinça e lavar o padrão com PBS. Adicionar meio de cultura de células para a placa de Petri e colocar a cultura de células na incubadora.
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Representative Results
Este método permite a padronização de proteínas e padronização indireta de células usando canais microfluídicos sem saída com dimensões tão pequenas quanto 10 mm e equipamentos disponíveis em quase todos os laboratórios biológicos uma vez que o molde mestre é feita. Esta técnica pode ser utilizada com canais microfluídicos PDMS criados usando fotolitografia suave tradicional, ou com canais microfluídicos PDMS criadas com fita adesiva de fabricação (Figura 1) 28, 29. Foi anteriormente demonstrada a utilização do presente procedimento de modelação indirecta de células neuronais para a avaliação de direccionamento axonal em fotorreceptores 4, 30, e demonstraram agora a sua utilização em vários tipos de células adicionais de origens diferentes. de rato embrionário neurónios corticais modelado sobre o poli-D-lisina (PDL) e superfícies de laminina demonstrar adherenc gerale para as áreas estampados e crescimento ao longo do PDL e listras laminina (Figura 3A). Linhas de células C2C12 de mioblastos também aderem à área modelada e demonstrar fusão em miotubos multinucleadas (Figura 3B). Nós também se adaptaram esta técnica para padronização celular direta como visto com fibroblastos na Figura 4. Como relatado anteriormente, este método de modelação celular directa mostrou nenhum efeito adverso sobre a sobrevivência da célula 30. As variáveis que conduzem à padronização directa ou indirecta com êxito de tipos de células indicados são listados na Tabela 1 e 2. Assim, no futuro, os investigadores podem utilizar esta técnica para células padrão e descobrir os fenómenos relacionados com a sua modelação específica.
Figura 1: Fabricação de Mold pela Soft litografia. Esquerda: fotolitoprocesso y. SU-8 é rodada revestida sobre uma bolacha de silício, exposta a radiação UV, e desenvolvido para remover o excesso de SU-8. Direita: Adhesive processo de fabricação de fita. fita adesiva é ligada a uma lâmina de vidro limpa, cortado com um bisturi e o excesso de fita é cuidadosamente removido. PDMS molde é, então, fabricada a partir de cada um dos moldes usando litografia macia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplo de um dispositivo de PDMS para Substrato Padronização. (A) PDMS elenco microfluídico com entrada utilizado para padronização de microfluidos de substratos. De entrada foi perfurado em uma extremidade da microcanais. (B) do canal microfluídicos como visto sob microscopia de contraste de fase. canais de microfluidos são 15 mm de comprimento e 20 m de largura, ANd separados por 200 um. A Figura 2 é reproduzido com permissão de IOP Publishing. Todos os direitos reservados 30. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Indireta Padronização celular. (A) processo de padronização de proteína de vácuo assistida. PDMS dispositivo de microfluidos canal está ligado a uma placa de Petri, a solução de substrato é carregado na entrada, o vácuo é aplicado à câmara e brevemente libertada, o dispositivo de PDMS é removido, é lavado padrão, e pronto para utilizar. (B) os neurónios corticais de ratos embrionários semearam-se sobre uma lamela com um substrato de PDL e laminina modelado. Linhas (c) C2C12 de mioblastos de células cultivadas em modelado PDL e laminina. Figuras 3a e 3c são reproduzidos com permission de IOP Publishing. Todos os direitos reservados 30. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Padronização celular direto. (A - c) Os fibroblastos estampados via padronização celular direto. (A) dispositivo de canal microfluídicos fabricados utilizando litografia de fita adesiva. (B) os canais microfluídicos após o enchimento com suspensão de células de fibroblastos utilizando vácuo assistida técnica de padronização. (C) após a remoção de Fibroblastos dispositivo de microfluidos. (D) A coloração por calceína-AM de fibroblastos após modelação de microfluidos. imagem de contraste (e) Fase de fibroblastos após padronização microfluídico. (F - g 30. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Padronização celular indireta | Substrato | Proteína Condições de incubação | Densidade celular | Adesão Celular Duração |
| PC12 | Collagen-1 | 1 h a 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 h a 37 ° C |
| Fibroblasto | Collagen-1 | 1 h a 50 ° C | 5 x 10 6 / mL | 1 h a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + laminina | 1 h a 37 ° C, lavagem com PBS, durante a noite a 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Embrionárias de rato neurônios corticais | PDL + laminina | 1 h a 37 ° C, lavagem com PBS, durante a noite a 37 ° C | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Salamander neurônios da retina | Sal-1 | durante a noite a 10 ° C | N / D | 1 h a 10 ° C |
Tabela 1: indiretos Condições celular padronização. Lista das condições de incubação, como o tipo de substrato, tempo, temperatura, densidade celular e para tipos de células típicas. Os investigadores devem optimizar as condições de incubação para os seus próprios substratos modelo e tipo de célula. Sal-1 é o substrato anticorpo utilizado para crescer salamandra neurónios retinais.
| Padronização celular direta | Substrato | Densidade celular | Tempo de Adesão Celular |
| PC12 | Collagen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 h a 37 ° C |
| Fibroblasto | Collagen-1 | 6 x 10 6 / mL | 1 h a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + laminina | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Embrionárias de rato neurônios corticais | PDL + laminina | 2 x 10 6 / mL | 15 min a 37 ° C |
| Salamander neurônios da retina | Sal-1 | N / D | 1 h a 10 ° C |
Tabela 2: Condições directos celular padronização. Lista das condições de incubação, tais como a temperatura, o tempo, e a densidade celular para tipos de células típicas. Os investigadores devem optimizar as condições de incubação para o seu próprio tipo de célula do modelo.
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Discussion
Enquanto fotolitografia convencional é uma técnica bem estabelecida para a realização de moldes de litografia macia, o equipamento, materiais, e as competências necessárias para utilizar fotolitografia convencional não estão prontamente disponíveis para a maioria dos laboratórios. Para laboratórios que não têm acesso a esses recursos, nós apresentamos a fabricação de fita adesiva como um método de criação de moldes com características relativamente simples para dispositivos microfluídicos. Este método permite que qualquer laboratório para criar e utilizar dispositivos microfluídicos para fins de investigação com ferramentas prontamente disponíveis. O método da fita adesiva pode ser melhorada com um baixo custo de corte de mesa de vinil 31. cortadores de desktop vinil pode aumentar a reprodutibilidade, a resolução, bem como a complexidade layout. Cada uma dessas opções, fotolitografia convencional, cortadores de desktop ou de fabricação de fita adesiva têm diferentes capacidades e limitações e investigadores devem considerar cuidadosamente qual método seria suficientepara as suas necessidades.
Em PDMS curadas, as longas cadeias poliméricas de siloxano de dimetilo formar uma estrutura, estrutura nanoporosa que cria regiões vazias que podem ser preenchidos com as moléculas de ar 27. Esta propriedade gás permeável é a chave para o nosso método de preenchimento canais microfluídicos. Quando colocado num ambiente de baixa pressão, as moléculas de ar são removidas do material a granel PDMS, bem como as próprias 25 microcanais. Quando o PDMS é então exposto a pressão atmosférica, o material a granel e de PDMS microcanais manter uma pressão negativa durante algum tempo 25, 30. Esta pressão negativa atrai líquido para os microcanais preenchendo automaticamente os canais microfluídicos. Esta pressão negativa continua a aspirar o líquido para dentro do canal até que o PDMS granel se equilibra com a pressão atmosférica.
Esta técnica assistida a vácuo permite patterning de proteínas e substratos específicos sobre um substrato de crescimento. No presente estudo, nós fomos capazes de padrão de vários substratos diferentes e tipos de células, tanto directamente como indirectamente (Tabela 1 e 2). No entanto, o experimentador ser necessário testar diferentes tempos de incubação, densidades celulares ou meios de semeadura para o seu tipo de célula particular. Estas variáveis provavelmente relacionadas com a capacidade inata de qualquer célula ou substrato para aderir à superfície que está a ser colocada em cima. Por exemplo, aqui C2C12 células necessária a utilização de meios isentos de soro para o meio de inoculação antes da cultura das células em DMEM com soro de cavalo a 2%. Além disso, as condições podem variar com base em se uma lamela de vidro ou placa de petri de plástico está sendo modelado. Aqui, ambos funcionou bem para permitir a modelação específica de vários tipos de células.
Uma das preocupações iniciais que tivemos enquanto utilizando esta técnica foi como a exposição a vácuo pode afetar a viabilidade celular. Este estudo e pestudos revious, no entanto, deve aliviar essas preocupações como temos demonstrado que o vácuo tem pouco ou nenhum efeito sobre uma variedade de células 30. Wang et al. anteriormente utilizados desgaseif icou-se irreversivelmente vedado câmaras de microfluidos para carregar células HeLa 32. Outros estudos têm utilizado a sementeira de células assistida por vácuo para uma variedade de tipos de células, incluindo células estaminais humanas, células aderentes e não aderentes, e a linha celular híbrida humano-hamster (A L) para carregar as células em canais microfluidicos 33. Além disso, outros investigadores têm células submetidas a pressões de vácuo muito maiores, em comparação com este estudo, com pouco ou nenhum efeito discernível sobre as células 33. Bolhas formadas durante a remoção de ar a partir do microcanal tendem a reunir na superfície da gotícula da suspensão na entrada. Muitas vezes, estas bolhas não se romper devido à tensão superficial da suspensão. Nós não observoed uma diminuição notável na viabilidade celular devido a bolhas. Além disso, a experiência com Calcein-AM não sugere uma diminuição significativa da viabilidade celular. Devido a isso, não temos exaustivamente analisada a morte celular especificamente devido a bolhas.
As tentativas anteriores para substratos ou padrão de células foram frequentemente atormentado por problemas tais como a formação de bolhas de ar nos dispositivos de microfluidos. A formação de bolhas de ar tornou difícil para injetar líquidos com facilidade e eficiência sem o uso de equipamentos ou materiais que não estão disponíveis na maioria dos laboratórios. Por exemplo, os métodos anteriores utilizaram a utilização de tratamento por plasma ou o tratamento de coroa para diminuir a hidrof obicidade de microcanais PDMS 15, 34. Apesar de eficaz, plasma e tratadores corona não estão prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Neste protocolo, demonstramos a capacidade de células padrão e substratos simplesmente usando labora comumvácuos tory. Usando a técnica de fabricação de fita adesiva, a metodologia pode ser utilizada para criar PDMS canais de microfluidos para substratos ou padrão de células em quase qualquer laboratório.
A fim de substratos padrão ou células com o protocolo de padronização vácuo, vários passos são críticos para padronização bem sucedida. Em primeiro lugar, para fabricar o mestre de fita adesiva, a fita adesiva tem de ser completamente ligado à lâmina de vidro e livre de bolhas de ar. As bolhas de ar enfraquecer a ligação entre a fita e a lâmina de vidro e pode conduzir a a fita a ser arrancado quando curado PDMS é retirado do molde de fita adesiva. Além disso, bolhas irá distorcer a geometria do canal microfluídico fazendo com que a superfície dos canais de ser não planar. Para fazer as PDMS expressos de SU-8 molde, o molde SU-8 deve ser silanizada antes de lançar com PDMS. Este passo é crítico na prevenção da aderência permanente de PDMS ao molde SU-8 após a cura de PDMS. Antes da selagem conformadado canal microfluídico PDMS para lamelas de vidro ou placas de petri de plástico, o PDMS tem de ser limpa de todas as partículas de poeira. Estas partículas podem impedir a formação de uma vedação entre conformada PDMS e de vidro e, assim, evitar a injecção de células ou substratos para o canal microfluídico. Tal como indicado no protocolo anterior, a limpeza dos canais de PDMS com fita adesiva é crítico antes de fazer aderir o microcanal para lamelas de vidro ou placas de petri de plástico. Finalmente, após a colocação do dispositivo para dentro da câmara de vácuo, o vácuo deve ser libertado suavemente para evitar o deslocamento da gotícula de solução de substrato ou de células a partir do orifício de entrada.
Se o fluido não se observa que flui para o canal microfluidico, pode haver uma fuga no canal microfluídico que impedir que o líquido que flui para dentro do canal. Remova o selo PDMS, seco e limpá-lo e, em seguida, repita o passo 4, 5 ou 6 da técnica. Se a solução não fluir para dentro do microcanal após release de vácuo, garantir que a solução é cobrindo completamente a entrada do microcanal. Isto pode ser feito por pipetagem solução cima e para baixo várias vezes, enquanto colocando-o no orifício de entrada. Se o substrato, depois de injectar no microcanal, não atribuem ao vidro, avaliar e determinar as condições óptimas de incubação necessários para o substrato utilizado. Se a remoção do PDMS expressos na superfície do vidro ou placa de petri de plástico faz com que as células estampados ou substratos para ser destruído, use um diluidor do elenco PDMS, submergir os PDMS expressos em PBS ou mídia, e lentamente e retire com cuidado os PDMS expressos a partir do vidro ou superfície de plástico com uma pinça.
Finalmente, BSA pode ser crítica na diminuição da adesão não específica de células para o vidro não padronizado de superfície ou de plástico. BSA é tipicamente utilizado como um reagente de bloqueio na transferência de Western, a imunocoloração, e outras técnicas de biologia molecular. Outros pesquisadores também utilizaram para indirecta ou directaprotocolos de modelação para diminuir a adesão celular não específica de 35, 36, 37. Descobrimos que a incubação do substrato com BSA foi necessário para a maioria dos tipos de células, excepto para as células da retina salamandra. Isto pode ser devido à natureza mais especializado do substrato (um anticorpo chamado Sal-1) que foi utilizado, bem como a falta geral de adesão celular por este tipo de célula 38. Nas nossas mãos, BSA também não visivelmente diminuir a adesão das células com as áreas modelado e, principalmente, serve para diminuir a aderência não específica.
Enquanto este método é projetado para ser versátil e flexível na sua aplicação a diferentes tipos de substrato e celulares, existem várias limitações para este protocolo e as células compatíveis e substrato. Devido à própria natureza da padronização de células para uma superfície, os tipos de células que esta técnica pode ser aplicada para se limitam a thosi que são passíveis de qualquer protocolo de padronização, tais como as células que são capazes de sobreviver com celular mais limitado de contacto das células, bem como aqueles que podem sobreviver em concentrações inferiores a sementeira de células. Por exemplo, uma potencial aplicação é a modelação das células de levedura para a microscopia de força atómica (AFM) 39. Enquanto nós testamos muitos substratos diferentes de células, outros substratos podem não funcionar com esta técnica particular, como os que formam géis tridimensionais. Neste momento, nós não examinaram se géis adequadamente formar e permanecer na superfície da lamela de vidro ou de plástico placa de Petri, após padronização. Esta técnica é capaz de padronização formas complexas e grandes áreas. No entanto, ele não pode padrão de uma variedade de formas separadas individuais sem interligando microcanais. Na ausência de microcanais interligados, cada indivíduo forma exigiria a sua própria entrada tornando a técnica complicada. Enquanto não notamos qualquer não-uniformidade na patterning proteína, a distribuição de células modelada no interior do microcanal pode ser não-uniforme. Esta falta de uniformidade pode ser devida à distribuição aleatória das células na célula suspensões, geometria e das dimensões dos microcanais, e a viscosidade da suspensão de células.
No futuro, esta técnica pode ser aplicada a outros tipos de substratos e células. Por exemplo, géis tridimensionais, como a matriz da membrana basal ou andaimes de colágeno podem potencialmente ser modelada e formada utilizando PDMS canais microfluídicos. Ao injectar um hidrogel para dentro do dispositivo de microfluidos, o hidrogel pode assumir a forma do dispositivo de microfluidos e ser capaz de formar os padrões complexos, sem o uso de impressoras 3-D ou de outras tecnologias. Estes permitiria a criação rápida de andaimes estruturados com ferramentas prontamente disponíveis e dispositivos microfluídicos.
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Acknowledgments
O financiamento para esta pesquisa foi fornecido pela New Jersey Comissão sobre a medula espinhal Research (NJCSCR) (a FHK), conceder CSCR14IRG005 (a BLF), NIH conceder R15NS087501 (a CHC), ea Fundação Kirby FM (a ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
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