Introduction
I vävnadsteknik och biosensing, förmågan att kontrollera den rumsliga organisationen av proteiner och celler på en pm skala, har blivit allt viktigare under de senaste fyra decennierna 1, 2, 3. Exakt rumslig organisationen av proteiner och celler har gjort det möjligt för forskare att undersöka växelverkan mellan celler och substrat som innehåller liknande eller olika typer av celler, för att vägleda celltillväxt, och att immobilisera biomolekyler för tillverkning av biosensorer 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Nuvarande metoder för mönstring proteiner inkluderar photopatterning och mikrokontakttryckning. Photopatterning utnyttjar ljuskänsligt material som tvärbinds vid exponering för Ultren violett (UV) ljus. UV-ljus riktas mot en fotomask (bestående av genomskinliga områden med mörkare regioner för att förhindra UV-ljustransmission) orsakar tvärbindning i specifika regioner som sedan kan användas för efterföljande fastsättning av biomaterial eller celler 10, 11. Medan detta system är mycket exakt och möjliggör exakt styrning av topografin av odlingsytan, är den begränsad till UV-känsliga biomolekyler som kan mönstras genom UV-strålning 12. Microcontact utskrift är en annan populär metod för mönstring specifika proteiner 13, 14. I denna metod, är en poly-dimetylsiloxan (PDMS) stämpel behandlades med en mängd olika ytmodifieringstekniker reagens innan de blötläggas i en lösning av den valda biomolekylära substratet. Det är sedan försiktigt pressas på ett täckglas eller annan yta som "stämpling" biomolekylen på odlingsytan. hoWever, är prägling begränsad till den typ av material som kan överföras samt vätbarheten av biomolekyler till ytan av PDMS stamp 15.
Direkt mönstring av celler kan vara svårare och förlitar sig på komplexa metoder såsom omkopplingsbara substrat, stencil baserade metoder eller mönstring med specifika celladhesionsmolekyler 16, 17. Dessa metoder är begränsade i sin förmåga att mönsterceller på grund av avsaknaden av kompatibla cellvidhäftnings substrat, på inkompatibilitet av processen arbeta med känsliga biologiska celler och begränsningar, inkonsekvens i reproducera mönstringen, och komplexiteten i förfarandet. Till exempel, med omkopplings substrat, anpassade substrat måste utformas för varje celltyp, att byta deras anslutning till specifika celltyper utan nedbrytning vid exponering för UV-ljus och värme som används i processen 17 < sup class = "xref"> 18, 19, 20. Stencil baserade mönstring metoder är mångsidiga i sin förmåga att mönsterceller; emellertid är det svårt att tillverka PDMS stenciler vid lämpliga tjocklekar för användning 16, 21. Direkt injektion av celler i PDMS mikroflödessystem kanaler har vissa fördelar, såsom: 1) underlätta vid tillverkning av mikroflödessystem kanaler och 2) lämplighet för många olika celler och substrat. Emellertid den förhärskande frågan om luftbubbla infångning under injektionsprocessen på grund av de hydrofoba egenskaperna hos PDMS utan användning av plasma rengöring, eller andra metoder för att minska luftbubblor, gör det svårt att genomgående skapa mönstrade celler på glas- eller plastytor 21.
Arbetet expanderar vid kapillär micromolding 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 och rapporterar en metod för att injicera protein och cellsuspensioner i mikrokanaler. Den metod som används här visar den mönstring av substrat och både direkt och indirekt mönstring av specifika celltyper. Denna teknik övervinner de höga hydrofobiciteten hos PDMS och eliminerar förekomsten av bubblor under insprutning av antingen substrat eller celler genom att dra nytta av gaspermeabiliteten hos PDMS 27. Denna uppsats visar användningen av tekniken med flera olika substrat och celltyper. Artikeln belyser också tillverkning av formar för mjuk litografi med konventionell fotolitografi samt en enkel och billig tejp metod användbar i resurs begränsade inställningar 28, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Några av de kemikalier som används i detta protokoll är giftiga och cancerframkallande. Använd alla lämpliga säkerhetsåtgärder (dragskåp handskfacket) och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, laboratorierock, fullängds byxor, sluten tå skor) vid användning av giftiga eller syra / basmaterial.
1. Tillverkning av master Formar för mjuk litografi med hjälp av Fotolitografi
- Rita utformningen av mikro med hjälp av en datorstödd konstruktion (CAD) ritverktyg.
- Skriv layouten på en tom mask plattan med laser maskritare.
- Skölj en 4 tums kiselskiva med aceton följt av isopropanol och torka med en kväve luftpistol för att säkerställa att inget lösningsmedel finns kvar på skivan.
- Dehydratisera wafern genom att baka den på en varm platta vid 200 ° C under 5 min.
- Välja en negativ fotoresist utformad för den önskade höjden på mikrokanaler. Feller exempel använda negativ fotoresist SU-8 50 för att erhålla mikro med en höjd av 50 um.
- Låt skivan svalna till rumstemperatur, och sedan rikta in skivan på chucken av en spinnbeläggare.
- Dispensera 4 ml (1 ml / inch diameter av skivan) av negativ fotoresist på mitten av skivan.
- Snurra belägga skivan med en tvåstegs centrifugering med hjälp av en spinner. Först tillämpa en spridningscykel av 500 varv per minut med en acceleration av 100 rpm / s för 10 s. Applicera sedan centrifugering av 2000 rpm med en acceleration av 300 rpm / s 2 under 30 sekunder för att få en 50 um beläggning av fotoresist på en skiva.
- Mjuk baka rånet i två steg på en värmeplatta enligt tillverkarens anvisningar. För en 50 | im beläggning av fotoresist, första förut baka rånet vid 65 ° C under 6 minuter och sedan omedelbart ramp upp den heta plattans temperatur för att posta-baka rånet vid 95 ° C under 20 min.
- Låt skivan svalna till rumstemperatur och sedan laddawafer på litografisteget.
- Rikta masken på skivan med hjälp av mask Aligner och utsätta skivan för UV-ljus (enligt tillverkarens anvisningar) vid en intensitet av 1,5 mW / cm 2 för 146 s för att tillämpa den totala UV-dos av 220 mJ / cm 2 som krävs för en 50 | j, m tjockt skikt av fotoresist.
- Tillämpa efterexponering baka till skivan i två steg på en varm platta. För en 50-um beläggning av fotoresist, första förut baka rånet vid 65 ° C under 1 min och omedelbart ramp upp den heta plattans temperatur för att posta-baka den vid 95 ° C under 5 min.
- Utveckla rånet i genom att sänka skivan i SU-8 utvecklare och försiktigt skaka tills funktionerna blir klar på skivan. Utveckla wafern för ~ 6 min för 50 | im tjock fotoresist.
- Skölj bort överflödig utvecklare med isopropanol och etanol, torka skivan med en kväve luftpistol.
- Hårt baka kiselskivan på en varm platta vid 150 ° C under 15 min.
- Placerawafer i en torkapparat med 25 mikroliter av silaniseringsmedel tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triklorsilan.
OBS! Silaniseringsmedel är frätande, därför bör användas i en syra / bas dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, fullängds byxor, sluten tå skor). - Applicera vakuum under 5 min och utsätta skivan för att ångorna av silan i 30 min utan att släppa vakuumet.
- Överföra skivan till en lämplig storlek petriskål.
2. Tillverkning av master Formar för mjuk litografi med tejp
- Rita utformningen av mikro med hjälp av en CAD-ritning verktyg och skriva ut ritning på vitt papper.
- Rengöra en glasskiva stor nog att rymma utformningen med isopropanol och torka sedan objektsglas med en luftpistol.
- Fäst tejp på den rengjorda glas. Var noga med att inte fälla några luftbubblor.
- Tejpa sidorna av glass glida på papperet med designen, med tejpen uppåt.
- Använd en skalpell för att skära tejpen på glasskivan med hjälp av pappers design som en referens och sedan dra av tejpen från oönskade delar av objektglas.
- Skölj glasskiva med isopropanol och torka sedan med en luftpistol. Baka glasskiva i en ugn vid 65 ° C under 30 min.
- Rulla försiktigt över tejpen med en gummivals för att avlägsna luftbubblor och tillåta sliden att svalna till rumstemperatur.
3. Mjuk Litografi Tillverkning av PDMS-enheter
- Blanda PDMS elastomer och dess härdningsmedel i ett förhållande av 10: 1 (vikt: vikt), rör om blandningen kraftigt, och sedan avgasas blandningen genom att placera den i en vakuumkammare tills inga luftbubblor förekommer i blandningen.
- Häll blandningen på en silaniserad kiselform eller tejp mögel i en petriskål för att få en ~ 2 mm tjockt lager av PDMS och Degas tills alla luftbubblor försvinner.
- Bota PDMS i en ugnvid 65 ° C under 2 h.
- Använd en skalpell för att skära PDMS skiktet åtminstone 5 mm från de funktioner och sedan dra de härdade PDMS utanför formen med hjälp av pincett.
- Stansa ett enda inloppshål med en 1 mm biopsistans var som helst på mikrokanalen, företrädesvis vid slutet av ett nätverk av mikrokanaler såsom framgår av fig 2a och 4b.
- Rengör PDMS gjutna med tejp för att avlägsna dammpartiklar adsorberade på enheten. Sterilisera PDMS mikrokanalanordningen (PDMS cast) genom att skölja med en lösning av 70% etanol följt av sterilt avjoniserat (DI) vatten, och exponera för UV under 30 minuter.
- Hålla den sterila PDMS anordningen i en steril petriskål tills användning.
4. Substrat Mönstring
- Placera sterila PDMS avgivna med pincett på en steril glastäck eller petriskål och tryck lätt med hjälp av spetsen på pincetten.
OBS! PDMS rösterna gör en konform men reversibel tätning med glass täck eller petriskål som bildar mikro utan användning av något bindemedel. - Placera en liten droppe (20 - 40 mikroliter) av substratlösningen på inlopps fullständigt täcker inloppshålet. Mönster Poly-D-lysin (PDL) genom att placera en 20 mikroliter droppe av PDL i natriumtetraborat-buffert på inloppet av mikrokanaler.
- Sätta petriskål i ett vakuum av ~ 254 mmHgA (ekvivalent till hus vakuum i biologiska laboratorier) under 10 min, och observera luft som kommer ut ur kanalen i form av bubblor.
- Släpp vakuum och observera substratlösningen strömmar in i mikro.
- Inkubera skålen vid lämpliga villkor för substrat vidhäftning. Se tabellerna 1 och 2 för inkubationsbetingelser (dessa varierar beroende på substratet). För PDL mönstring, inkubera under en timme vid 37 ° C.
- Försiktigt bort PDMS stämpel med sterila pincett och tvätta mönstret på glastäck tre gånger med avjoniserat vatten. Lägga till en 1% bovint serumalbumin (BSA) -lösning i petriskålen för att täcka skålen eller glastäckglas och inkubera över natten vid 37 ° C.
OBS: Detta kommer att minska ospecifik vidhäftning i obelagda regioner. - Sug bort BSA-lösningen 1%, och det mönstrade substratet är nu klar att användas.
5. Indirekt Mönstring av celler
- Förbereda cellsuspensionen i serumfritt odlingsmedium. Celltyp och celldensitet är listade i tabell 1.
- Tillsätt cellsuspension till det mönstrade petriskål och helt dränka den mönstrade regionen i cellsuspension.
- Inkubera petriskål vid 37 ° C i en inkubator under 15 min för att tillåta cellerna att fästa till det mönstrade substratet.
- Aspirera överskottet cellsuspensionen från petriskål och tvätta de mönstrade cellerna tre gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) under försiktig skakning under 10 s för att avlägsna obundna celler.
- Tillsätt enppropriate odlingsmedium för att de mönstrade cellkulturer och inkubera de mönstrade celler vid 37 ° C i en CO2-inkubator.
6. Direkt mönstring av celler
OBS: Denna teknik är ett alternativ till den indirekta cell mönstring beskrivs i steg 5. Emellertid, till skillnad från i steg 5, i denna teknik celler är mönstrade på vävnadsodlings ytor med eller utan substratbeläggningen.
- Sterilisera mikrofluidikanordning genom sköljning med en lösning av 70% etanol följt av DI-vatten.
- Blöt anordningen över natten i en lösning av 1% BSA för att förhindra celladhesion till PDMS.
- Torka enheten vid rumstemperatur och koppla den till botten av vävnadskultur-behandlade petriskål.
- Förbereda cellsuspensionen i serumfritt odlingsmedium. Celltyp och celldensitet är listade i tabell 2.
- Placera en liten droppe (4-8 mikroliter) av cellsuspensionen, tillräckligt för att fylla denmikro, på inlopps helt täcker inloppshålet.
- Sätta petriskål i ett vakuum under 10 minuter och observera luft som kommer ut ur kanalen i form av bubblor. Släpp vakuum och observera cellsuspensionen strömmar in i mikro.
- Inkubera petriskål i en inkubator för att främja cellvidhäftning enligt de inkubationsbetingelser (beror på typen av cell mönstrade) som nämns i tabell 2. Lägg PBS till petriskålen dränka PDMS-enheten.
- Skala PDMS försiktigt bort petriskål med pincett och tvätta mönster med PBS. Lägg cellodlingsmedia till petriskål och placera cellkulturen i inkubatorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod tillåter mönstring av proteiner och indirekt mönstring av celler med hjälp av återvändsmikroflödessystem kanaler med dimensioner så små som 10 nm och utrustning som finns i nästan alla biologiska laboratorium så snart master mögel görs. Denna teknik kan användas med PDMS mikroflödessystem kanaler som skapas med hjälp av traditionell mjuk fotolitografi, eller med PDMS mikroflödessystem kanaler som skapas med tejp tillverkning (Figur 1) 28, 29. Vi har tidigare visat att användningen av detta förfarande i indirekt mönstring av neuronala celler för utvärdering av Axon vägledning i fotoreceptorer 4, 30, och har nu visat sin användning i flera andra celltyper av olika ursprung. Embryonal råtta kortikala neuroner mönstrade på poly-D-lysin (PDL) och laminin ytor visar allmän adherence till de mönstrade områdena och tillväxt längs PDL och laminin ränder (figur 3a). C2C12 myoblast cellinjer också följa den mönstrade området och demonstrera fusion i flerkärniga myotuber (Figur 3B). Vi har också anpassat denna teknik för direkt cell mönstring som även ses med fibroblaster i figur 4. Som tidigare rapporterats, denna direkta cell mönstring metod visade ingen negativ effekt på cellöverlevnad 30. De variabler som leder till framgångsrik direkt eller indirekt mönstring av angivna celltyper räknas upp i tabell 1 och 2. Således i framtiden kan forskarna använda denna teknik för att mönsterceller och upptäcka fenomen relaterade till deras specifika mönster.
Figur 1: Tillverkning av Mold av mjuk litografi. Vänster: Photolithography processen. SU-8 är spinnbelades på en kiselskiva, exponeras för UV-strålning, och utvecklats för att avlägsna överskott av SU-8. Höger: Tejp tillverkningsprocessen. Tejp är fäst till en ren glasskiva, skars med en skalpell, och överskott av tejpen avlägsnas försiktigt. PDMS gjutna sedan tillverkas från varje form med användning mjuk litografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exempel på en PDMS-enhet för Substrate mönstring. (A) PDMS mikroflödes gjutna med inlopp som används för mikroflödes mönstring av substrat. Inlopp stansades ut i ena änden av mikrokanaler. (B) mikroflödessystem kanal som ses under faskontrastmikroskopi. Mikroflödeskanaler är 15 mm i längd, 20 ^ m breda, end åtskilda av 200 | j, m. Figur 2 återges med tillstånd från IOP Publishing. All rights reserved 30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Indirekt Cell mönstring. (A) vakuumassisterad protein mönstring process. PDMS mikroflödessystem kanal enheten är ansluten till en petriskål, är substratlösning laddas i inloppet är vakuum i korthet appliceras på kammaren och släpps PDMS enheten tas bort, mönster tvättas och klar att använda. (B) Embryonala kortikala råtta neuron ympas på en täck med en mönstrad PDL och laminin substrat. (C) C2C12 myoblast cellinjer odlas på mönstrade PDL och laminin. Figurerna 3a och 3c återges med permission från IOP Publishing. All rights reserved 30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Direkt Cell mönstring. (A - c) fibroblaster mönstrade via direkt cell mönstring. (A) Mikroflödeskanalanordning tillverkad med användning av tejp litografi. (B) mikroflödessystem kanaler efter fyllning med fibroblast cellsuspensionen med hjälp av vakuumassisterad mönstring teknik. (C) fibroblaster efter avlägsnande av mikroflödessystem enhet. (D) Calcein-AM färgning av fibroblaster efter mikroflödes mönstring. (E) Fas kontrastbild av fibroblaster efter mikroflödes mönstring. (F - g 30. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Indirekt Cell Mönstring | Substrat | Protein inkuberingsförhållanden | cell~~POS=TRUNC | Cell Adhesion Varaktighet |
| PC12 | Kollagen-1 | 1 h vid 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 h vid 37 ° C |
| fibroblast | Kollagen-1 | 1 h vid 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 h vid 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 1 h vid 37 ° C, tvätta PBS, över natt vid 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min vid 37 ° C |
| Embryonala Rat kortikala Neuroner | PDL + Laminin | 1 h vid 37 ° C, tvätta PBS, över natt vid 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min vid 37 ° C |
| Salamander näthinnan nervceller | Sal-1 | över natten vid 10 ° C | N / A | 1 h vid 10 ° C |
Tabell 1: Indirekt Cell mönstring villkor. Lista över inkubationsbetingelser såsom substrat typ, tid, temperatur och celldensiteten för typiska celltyper. Forskare bör optimera inkubationsbetingelser för sina egna modellsubstrat och celltyp. Sal-1 är antikroppen substrat som används för att växa Salamander retinala neuroner.
| Direkt Cell Mönstring | Substrat | cell~~POS=TRUNC | Cell Adhesion tid |
| PC12 | Kollagen-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h vid 37 ° C |
| fibroblast | Kollagen-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h vid 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 min vid 37 ° C |
| Embryonala Rat kortikala Neuroner | PDL + Laminin | 2 x 10 6 / ml | 15 min vid 37 ° C |
| Salamander näthinnan nervceller | Sal-1 | N / A | 1 h vid 10 ° C |
Tabell 2: Direkt Cell mönstring villkor. Lista över inkubationsbetingelser såsom temperatur, tid och celldensiteten för typiska celltyper. Forskare bör optimera inkubationsbetingelser för sin egen modell celltyp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Medan konventionell fotolitografi är en väl etablerad teknik för att skapa formar för mjuk litografi, utrustning, material och färdigheter som krävs för att använda konventionell fotolitografi inte är lätt tillgängliga för de flesta laboratorier. För laboratorier utan tillgång till dessa resurser, har vi presenterat tejp tillverkning som en metod för att skapa formar med relativt enkla funktioner för mikroflödessystem enheter. Denna metod gör något laboratorium för att skapa och utnyttja mikroflödessystem enheter för forskningsändamål med lättillgängliga verktyg. Tejpen metoden kan förbättras med en låg kostnad stationär vinyl cutter 31. Desktop vinyl fräsar kan öka reproducerbarhet, upplösning, liksom layout komplexitet. Var och en av dessa alternativ, konventionell fotolitografi, stationära fräsar, eller tejp tillverknings har olika möjligheter och begränsningar och forskare måste noga överväga vilken metod skulle räckaför deras behov.
I härdade PDMS, de långa polymerkedjorna av dimetylsiloxan bildar ett gitter, nanoporös struktur som skapar tomma regioner som kan fyllas med luftmolekyler 27. Denna gas genomsläppliga egenskapen är nyckeln till vår metod för att fylla mikroflödessystem kanaler. När de placeras i en lågtrycksmiljö, är luftmolekyler bort från PDMS bulkmaterialet samt de mikrokanaler själva 25. När PDMS exponeras därefter för atmosfärstryck, PDMS bulkmaterialet och mikrokanaler bibehålla ett negativt tryck under en tid 25, 30. Detta undertryck suger vätska in i mikrokanalerna automatiskt fyller de mikroflödeskanaler. Detta undertryck fortsätter att suga vätska in i kanalen tills bulk PDMS i jämvikt med atmosfärstryck.
Detta vakuum-assisterad teknik medger patterning av specifika proteiner och substrat på ett tillväxtsubstrat. I denna studie kunde vi mönster flera olika substrat och celltyper både direkt och indirekt (tabell 1 och 2). Emellertid kan den som utför experimentet behöva testa olika inkubationstider, celltätheter, eller sådd medier för deras särskilda celltyp. Dessa variabler sannolikt avser inneboende förmåga antingen cellen eller substratet för att ansluta sig till ytan den läggs på. Till exempel, här C2C12-celler krävde användning av serumfria medier för sådd media innan odling av cellerna i DMEM med 2% hästserum. Dessutom kan villkoren variera beroende på om ett täckglas eller plast petriskål är mönstrad. Här, både fungerat bra för att möjliggöra specifik mönstring av olika celltyper.
En av de första oro som vi hade samtidigt som man utnyttjar denna teknik var hur exponering för vakuum kan påverka cellernas livskraft. Denna studie och previous studier bör dock lindra dessa farhågor som vi har visat att vakuum har liten eller ingen effekt på en rad olika celler 30. Wang et al. tidigare utnyttjats avgasades irreversibelt tätade mikroflödeskammare för att ladda HeLa-celler 32. Andra studier har använt vakuumassisterad cellsådd för en rad olika celltyper inklusive mänskliga stamceller, vidhäftande och icke-vidhäftande celler, och celler human-hamster-hybrid-cellinje (A L) för att läsa in i mikroflödessystem kanaler 33. Dessutom har andra forskare utsattes celler för mycket högre vakuumtryck i jämförelse med den nuvarande studien med liten eller ingen märkbar effekt på cellerna 33. Bubblor, som bildas under avlägsnandet av luft från mikrokanalen tenderar att samlas på ytan av droppen av suspensionen vid inloppet. Ofta är dessa bubblor inte spricker på grund av ytspänning suspensionen. Vi har inte Observed en märkbar minskning av cellviabilitet på grund av bubblor. Dessutom har experimentet med kalcein-AM inte tyder på en betydande minskning av cellviabilitet. På grund av detta har vi inte grundligt undersökt celldöd specifikt på grund av bubblor.
Tidigare försök att mönstersubstrat eller celler var ofta av många problem, såsom bildning av luftbubblor i mikrofluidanordningar. Bildandet av luftbubblor gjorde det svårt att injicera vätskor lätt och effektivt utan användning av utrustning eller material som inte finns i de flesta laboratorier. Till exempel, tidigare metoder utnyttjade användningen av plasmabehandling eller koronabehandling för att minska hydrofobicitet PDMS mikro 15, 34. Även effektiv, plasma och corona trea inte är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. I detta protokoll visar vi möjligheten att mönster celler och substrat att bara använda vanliga laboratory dammsugare. Med användning av den adhesiva tejpen tillverkningstekniken, kan den metod användas för att skapa PDMS mikroflödeskanaler till mönstersubstrat eller celler i nästan alla laboratorier.
För att mönstersubstrat eller celler med vakuummönstrings protokollet flera steg är avgörande för framgångsrik mönstring. Först, för att tillverka den adhesiva tejpen herre, den adhesiva tejpen måste vara helt fäst till objektglaset och fri från luftbubblor. Luftbubblor försvaga bindningen mellan tejpen och glasskivan och kan leda till tejpen skalas av när de är härdade PDMS skalas bort tejpen mögel. Dessutom kommer bubblor förvränger geometrin hos mikroflödeskanalen som orsakar ytan av kanalerna för att vara icke-plana. För att göra PDMS avgivna från SU-8 mögel, måste SU-8 mögel kan silan före gjutning med PDMS. Detta steg är kritiskt för att förhindra permanent bindning av PDMS till SU-8 formen efter härdning av PDMS. Före konform tätningav PDMS mikroflödeskanalen till täckglas eller plastpetriskålar måste PDMS rengöras av alla dammpartiklar. Dessa partiklar kan förhindra bildandet av ett konformt tätning mellan PDMS och glas och sålunda förhindra injektion av celler eller substrat in i mikroflödeskanalen. Som framgår av ovanstående protokoll, rengöring PDMS kanaler med tejp är kritisk för vidhäftning av mikrokanalen till täckglas eller plastpetriskålar. Slutligen, efter att placera enheten in i vakuumkammaren, varvid vakuum måste varsamt frigöras för att förhindra förskjutning av droppen av substrat eller cell lösning från inloppshålet.
Om ingen vätska observeras strömmar in i mikroflödeskanalen, kan det finnas en läcka i mikroflödeskanalen, vilket skulle hindra vätska från att strömma in i kanalen. Ta bort PDMS stämpel, torr och rengöra den och sedan upprepa steg 4, 5 eller 6 av tekniken. Om lösningen inte strömma in i mikro efter release av vakuum, se till att lösningen helt täcker ingången till mikro. Detta kan göras genom att pipettera lösningen upp och ner flera gånger medan sätta den i inloppshålet. Om substratet, efter injektion i mikro, inte fäster glaset, utvärdera och bestämma de optimala inkubationsbetingelser som krävs för att använda substratet. Om du tar bort PDMS avgivna från glasytan eller plast petriskål orsakar de mönstrade celler eller substrat som skall förstöras, använd en tunnare PDMS rösterna, dränka PDMS gjutna i PBS eller media, och långsamt och försiktigt dra av PDMS avgivna från glaset eller plastyta med pincett.
Slutligen kan BSA vara kritisk för att minska ospecifik vidhäftning av celler till antingen omönstrad glas eller plast yta. BSA används typiskt som ett blockeringsreagens i Western blotting, immunfärgning, och andra molekylärbiologiska tekniker. Andra forskare har också utnyttjat det för indirekt eller direktmönstring protokoll för att minska ospecifik celladhesion 35, 36, 37. Vi fann att inkubation av substratet med BSA var nödvändigt för de flesta celltyper med undantag för salamander retinala celler. Detta kan bero på mer specialiserad karaktär av substratet (en antikropp som kallas Sal-1) som användes liksom den allmänna bristen på celladhesion av denna celltyp 38. I våra händer, BSA inte heller märkbart minska vidhäftningen av celler till de mönstrade områdena och främst tjänade till att minska ospecifik vidhäftning.
Även om denna metod är utformad för att vara mångsidig och flexibel i sin tillämpning på olika substrat och celltyper, det finns flera begränsningar för detta protokoll och kompatibla celler och substrat. På grund av den mycket karaktär av mönstring celler på en yta, till celltyper som denna teknik kan tillämpas är begränsade till thoSE som är mottagliga för någon mönstring protokoll såsom de celler som kan överleva med mer begränsad cell till cell kontakt liksom de som kan överleva vid lägre cell sådd koncentrationer. Till exempel, är en potentiell tillämpning mönstringen av jästceller för atomkraftsmikroskopi (AFM) 39. Även om vi har testat många olika cellsubstrat, kan andra substrat inte fungerar med just denna teknik såsom de som bildar tredimensionella geler. Vid denna tid har vi inte undersökt om geler ordentligt bilda och stanna på ytan av glastäck eller plast petriskål efter mönstringen. Denna teknik är i stånd att mönstring komplexa former och stora områden. Det kan dock inte mönstret en rad enskilda separerade former utan sammanbindande mikro. I avsaknad av sammankopplade mikro skulle varje enskild form kräver sin egen inlopp gör tekniken besvärlig. Även om vi inte märker någon ojämnhet i patterning protein, kan fördelningen av celler mönstrade inuti mikrokanalen vara olikformig. Denna olikformighet kan bero på den slumpmässiga fördelningen av celler i cell suspensioner, geometri och dimensionerna hos mikrokanalerna, och viskositet av cellsuspensionen.
I framtiden kan denna teknik appliceras på andra typer av substrat och celler. Exempelvis kan tredimensionella geler såsom basalmembranmatris eller kollagen ställningar potentiellt vara mönstrad och formas med användning av PDMS mikroflödeskanaler. Genom att injicera en hydrogel in i mikrofluidanordningen, kan hydrogelen ta på formen hos mikroflödessystem enheten och kunna bilda komplexa mönster utan användning av 3-D-skrivare eller annan teknik. Dessa skulle göra det möjligt för att snabbt skapa strukturerade ställningar med lättillgängliga verktyg och mikroflödessystem enheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Finansieringen av denna forskning har tillhandahållits av New Jersey kommissionen om ryggmärgs Research (NJCSCR) (till FHK), bevilja CSCR14IRG005 (till BLF), NIH bevilja R15NS087501 (till CHC) och FM Kirby Foundation (ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
- Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. Patterning proteins and cells using soft lithography. Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).
- Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering. Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).
- Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications. Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).
- Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning. Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).
- Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro. Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).
- Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Choi, Y., Lee, S. Guided cell growth through surface treatments. J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).
- Hwang, I. -T., et al. Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications. ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).
- Clark, P., Britland, S., Connolly, P. Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces. J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Douvas, A., et al. Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules. Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).
- Alom, R. S., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Essö, C. Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces. Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
- Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells. J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).
- Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces. Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).
- Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility. Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).
- Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture. Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).
- Takayama, S., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).
- Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. Micro-channel filling flow considering surface tension effect. J of Micromech Microeng. 12 (3), 236 (2002).
- Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science. J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).
- Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries. Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).
- Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding. Adv Mater. 11 (11), 946 (1999).
- Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).
- Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane). J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).
- Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays. Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).
- Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters. Lab Chip. , (2010).
- Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells. Biofabrication. 6 (3), 035016 (2014).
- Yuen, P. K., Goral, V. N. Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter. Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).
- Wang, L., et al. Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices. Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).
- Feng, H., et al. Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment. Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip. Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).
- Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking. Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).
- Zheng, C., et al. High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning. Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).
- MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).
- Suchodolskis, A., et al. Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM. Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).
