Introduction
In ingegneria dei tessuti e biosensori, la capacità di controllare l'organizzazione spaziale delle proteine e cellule su scala micron, è diventato sempre più importante negli ultimi quarant'anni 1, 2, 3. Precise organizzazione spaziale delle proteine e cellule ha permesso ai ricercatori di esaminare l'interazione tra cellule e substrati contenenti tipi simili o diversi di cellule, per guidare la crescita cellulare, e immobilizzare biomolecole per la fabbricazione di biosensori 4, 5, 6, 7, 8, 9.
Gli attuali metodi di proteine patterning includono photopatterning e stampa microcontact. Photopatterning utilizza materiale sensibile alla luce, che viene reticolato in seguito all'esposizione ad ultruna viola (UV). Luce UV diretta a un fotomaschera (costituito da aree trasparenti con le regioni più scure per prevenire la trasmissione della luce UV) provoca la reticolazione in regioni specifiche che possono poi essere utilizzati per successivo fissaggio dei biomateriali o celle 10, 11. Mentre questo schema è molto preciso e consente un controllo preciso della topografia della superficie cultura, è limitato a biomolecole sensibili ai raggi UV che possono essere modellati da radiazione UV 12. Stampa microcontact è un altro metodo popolare di patterning proteine specifiche 13, 14. In questo metodo, un silossano (PDMS) timbro poli-dimetil viene trattata con una varietà di reagenti modifica della superficie prima di essere stati immersi in una soluzione del substrato biomolecolare prescelto. E 'poi delicatamente pressato su un vetrino di vetro o di altra superficie così "stamping" biomolecole sulla superficie cultura. However, stampaggio è limitata al tipo di materiale che può essere trasferito, nonche la bagnabilità di biomolecole alla superficie del timbro PDMS 15.
Patterning diretto delle cellule può essere più difficile e si basa su metodi complessi come substrati commutabili, metodi basati stencil, o patterning con specifiche molecole di adesione cellulare 16, 17. Questi metodi sono limitati nella loro capacità di cellule modello a causa della mancanza di substrati di adesione cellulare compatibili, incompatibilità del processo di lavorare con cellule sensibili biologiche e vincoli, incoerenza nel riprodurre il patterning e complessità della procedura. Ad esempio, con i substrati commutabile, substrati personalizzati devono essere progettati per ogni tipo di cellula, per passare la loro adesione a specifici tipi cellulari senza degradazione per esposizione alla luce UV e calore utilizzato nel processo 17, < class = sup "xref"> 18, 19, 20. metodi di patterning basata Stencil sono versatili nella loro capacità di cellule del modello; Tuttavia, è difficile produrre matrici PDMS a spessori adeguati per l'utilizzo 16, 21. L'iniezione diretta di cellule in canali microfluidica PDMS hanno alcuni vantaggi quali: 1) facilità di fabbricazione di canali microfluidica e 2) di idoneità per molte cellule e substrati diversi. Tuttavia, il problema prevalente di cattura bolla d'aria durante il processo di iniezione a causa della idrofobicità del PDMS senza l'uso di pulizia al plasma, o altri metodi per ridurre bolle d'aria, rende difficile creare costantemente cellule modellata su superfici di vetro o di plastica 21.
Questo lavoro si espande su capillare micromolding 22, 23,lass = "xref"> 24, 25, 26 e riporta un metodo per iniettare proteine e cellule sospensioni in microcanali. Il metodo utilizzato qui dimostra la patterning dei substrati ed entrambi patterning diretto e indiretto di specifici tipi cellulari. Questa tecnica supera l'elevata idrofobicità di PDMS ed elimina la presenza di bolle durante l'iniezione del substrato o da cellule sfruttando la permeabilità ai gas di PDMS 27. Questo documento dimostra l'uso della tecnica con diversi substrati diversi e tipi di cellule. L'articolo evidenzia anche la fabbricazione di stampi per la litografia morbido utilizzando la fotolitografia convenzionale nonché una semplice ed adesivo a basso costo metodo nastro utile risorse limitate impostazioni 28, 29.
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Protocol
NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza materiale pertinente (MSDS) prima dell'uso. Alcune delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossici e cancerogeni. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguati (cappa, cassetto portaoggetti) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera, scarpe chiuse) quando si usano materiali tossici o acido / base.
1. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia mediante fotolitografia
- Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno computer-aided design (CAD).
- Stampa il layout su un piatto maschera vuoto utilizzando la maschera laser scrittore.
- Risciacquare un wafer di silicio da 4 pollici con acetone mediante isopropanolo e asciugare con una pistola ad aria azoto per garantire che nessun solvente viene lasciato sul wafer.
- Disidratare wafer mediante cottura su una piastra calda a 200 ° C per 5 min.
- Selezionare un fotoresist negativo progettata per l'altezza desiderata dei microcanali. Fo esempio, utilizzare fotoresist negativo SU-8 50 per ottenere microcanali con un'altezza di 50 micron.
- Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente, e quindi allineare il wafer sul mandrino di coater rotazione.
- Dispensare 4 ml (1 mL diametro / pollice della fetta) di fotoresist negativo sul centro della fetta.
- Spin cappotto il wafer con un ciclo di centrifuga in due fasi utilizzando un filatore. Innanzitutto, applicare un ciclo di diffusione di 500 rpm con un'accelerazione di 100 rpm / s per 10 s. Quindi applicare un ciclo di centrifuga di 2000 giri con un'accelerazione di 300 rpm / s 2 per 30 s per ottenere un rivestimento 50 micron di photoresist su un wafer.
- Morbido cuocere il wafer in due fasi su un piatto caldo secondo le istruzioni del produttore. Per un rivestimento 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 6 minuti e poi subito rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere il wafer a 95 ° C per 20 min.
- Lasciare il wafer raffreddare a temperatura ambiente e quindi caricare ilwafer sul palco litografia.
- Allineare la maschera sul wafer utilizzando maschera allineatore ed esporre la fetta di luce UV (come da istruzioni del produttore) ad una intensità di 1,5 mW / cm 2 per 146 s per applicare la dose totale UV di 220 mJ / cm 2 necessario per un 50 micron di spessore strato di resina fotosensibile.
- Applicare dopo l'esposizione cuocere al wafer in due fasi su un piatto caldo. Per un rivestimento di 50 micron di photoresist, prima pre-cuocere il wafer a 65 ° C per 1 min e immediatamente rampa della temperatura della piastra calda per lasciare cuocere è a 95 ° C per 5 min.
- Sviluppare il wafer in immergendo il wafer di SU-8 sviluppatore e scuotendo delicatamente fino a quando le caratteristiche diventano chiari sul wafer. Sviluppare il wafer per ~ 6 min per il photoresist spessore 50 micron.
- Risciacquare eccesso sviluppatore con isopropanolo ed etanolo, quindi asciugare il wafer con una pistola ad aria azoto.
- Duro cuocere il wafer di silicio su una piastra calda a 150 ° C per 15 min.
- Posiziona ilwafer in un essiccatore con 25 ml di agente silanizzazione tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano.
NOTA: L'agente silanizzazione è corrosivo, quindi dovrebbe essere utilizzato in un cappa acido / base, con attrezzature adeguate di protezione individuale (occhiali, guanti, camice, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe). - Applicare il vuoto per 5 minuti ed esporre il wafer ai vapori di silano per 30 minuti senza rilasciare il vuoto.
- Trasferire il wafer in una capsula di Petri opportunamente dimensionato.
2. Realizzazione del Maestro Stampo per Soft litografia con nastro adesivo
- Disegnare il layout delle microcanali utilizzando uno strumento di disegno CAD e stampare il disegno su carta bianca.
- Pulire un vetrino abbastanza grande per ospitare il disegno con isopropanolo e poi asciugare il vetrino con un fucile ad aria.
- Attaccare il nastro adesivo sul vetrino pulito. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d'aria.
- Nastro lati della glass scivolare sulla carta con il disegno, con il nastro rivolta verso l'alto.
- Utilizzare un bisturi per tagliare il nastro sul vetrino utilizzando il disegno di carta come riferimento e quindi rimuovere il nastro da aree indesiderate del vetrino.
- Sciacquare il vetrino con isopropanolo e asciugare con un fucile ad aria. Cuocere il vetrino in stufa a 65 ° C per 30 min.
- Delicatamente rotolare sopra il nastro con un rullo di gomma per rimuovere le bolle d'aria e consentire la slitta raffreddare a temperatura ambiente.
3. soft litografia fabbricazione dei dispositivi PDMS
- Mescolare PDMS elastomero e il suo agente di indurimento in un rapporto di 10: 1 (w: w), agitare la miscela vigorosamente, e quindi degassare la miscela ponendolo in una camera a vuoto fino bolle d'aria vengono visualizzati nella miscela.
- Versare il composto su uno stampo di silicone silanizzata o muffa nastro adesivo in una capsula di Petri per ottenere un ~ 2 spesso strato di PDMS e Degas mm fino a quando tutta l'aria bolle scompaiono.
- Curare il PDMS in un fornoa 65 ° C per 2 h.
- Utilizzare un bisturi per tagliare lo strato PDMS di almeno 5 mm di distanza dalle caratteristiche e poi sbucciate le PDMS curato fuori lo stampo con pinzetta.
- Effettuare un singolo foro di ingresso con una biopsia 1 millimetro punzone ovunque sul microcanali, preferibilmente al termine di una rete di microcanali, come mostrato nella figura 2a e 4b.
- Pulire i PDMS espressi con del nastro adesivo per rimuovere le particelle di polvere adsorbiti sul dispositivo. Sterilizzare il dispositivo microcanali PDMS (PDMS Cast) risciacquando con una soluzione di etanolo al 70% seguita da deionizzata sterile dell'acqua (DI), e esporre a UV per 30 min.
- Tenere il dispositivo PDMS sterile in una capsula di Petri sterile fino al momento dell'uso.
4. substrato Patterning
- Posizionare il PDMS sterili espressi con una pinzetta su un vetrino di vetro sterile o capsula di Petri e applicare una leggera pressione con la punta delle pinzette.
NOTA: Il cast PDMS fa una conforme, ma tenuta reversibili con la glass vetrino o una scatola Petri formando microcanali senza l'uso di alcun adesivo. - Posizionare una goccia (20 - 40 ml) della soluzione di substrato sull'ingresso copre completamente il foro di immissione. Motivo Poly-D-lisina (PDL) posizionando una goccia 20 ml di PDL in tampone sodio tetraborato in ingresso dei microcanali.
- Mettere la capsula di Petri in un vuoto di ~ 254 mmHgA (equivalente ad alloggiare vuoto in laboratori biologici) per 10 minuti, e osservare l'aria che esce dal canale nella forma di bolle.
- Rilasciare il vuoto e osservare la soluzione di substrato che scorre nel microcanali.
- Incubare il piatto alle condizioni adeguate per il substrato aderenza. Vedere Tabelle 1 e 2 per le condizioni di incubazione (questi variano a seconda del substrato). Per PDL patterning, incubare per 1 ora a 37 ° C.
- sbucciare con cautela il timbro PDMS con una pinzetta sterile e lavare il modello sul vetrino di vetro tre volte con acqua deionizzata. Aggiungere una soluzione 1% di siero albumina bovina (BSA) per capsula di Petri per coprire il piatto o vetro coprioggetto e incubare una notte a 37 ° C.
NOTA: Ciò consentirà di ridurre l'aderenza non specifico nelle regioni non rivestiti. - Aspirare off la soluzione BSA 1% e il substrato modellato è ora pronto per l'uso.
5. Patterning indiretta di celle
- Preparare la sospensione cellulare in terreno di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 1.
- Aggiungere la sospensione cellulare al piatto modellato Petri e sommergere completamente la regione modellata in sospensione cellulare.
- Incubare la piastra di Petri a 37 ° C in un incubatore per 15 minuti per permettere alle cellule di allegare al substrato modellato.
- Aspirare la sospensione cellulare in eccesso dalla piastra di Petri e lavare le cellule fantasia tre volte con tampone fosfato (PBS) mentre delicatamente agitazione per 10 s per rimuovere le cellule senza legami.
- Aggiungere l'unamezzo di coltura ppropriate alle colture cellulari fantasia e incubare le cellule modellata a 37 ° C in un incubatore CO 2.
6. Patterning diretta delle cellule
NOTA: Questa tecnica è un'alternativa al patterning cella indiretta descritto nel passaggio 5. Tuttavia, a differenza del passaggio 5, in questa tecnica cellule sono modellati su superfici coltura tissutale con o senza rivestimento substrato.
- Sterilizzare il dispositivo microfluidico risciacquando con una soluzione di 70% di etanolo seguito da acqua DI.
- Immergere il dispositivo notte in una soluzione di 1% BSA per impedire l'adesione cellulare ai PDMS.
- Essiccare il dispositivo a temperatura ambiente e fissarlo al fondo del piatto Petri coltura di tessuti trattati.
- Preparare la sospensione cellulare in terreni di coltura privo di siero. Il tipo di cellula e densità cellulare sono elencati nella Tabella 2.
- Inserire una gocciolina (4 - 8 ml) della sospensione cellulare, sufficiente a riempire lamicrocanali, sull'ingresso coprendo completamente il foro di immissione.
- Mettere la capsula di Petri in un vuoto per 10 minuti e osservare aria proveniente dal canale in forma di bolle. Il vuoto e osservare la sospensione cellulare scorre nel microcanali.
- Incubare la piastra di Petri in un incubatore per favorire l'adesione delle cellule secondo le condizioni di incubazione (dipende dal tipo di cellula modellata) indicato nella Tabella 2. Aggiungere PBS alla capsula di Petri immergendo il dispositivo PDMS.
- Sbucciare la PDMS con cautela la capsula di Petri con una pinzetta e lavare il modello con PBS. Aggiungere terreni di coltura cellulare per la piastra di Petri e posizionare la coltura cellulare in incubatrice.
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Representative Results
Questo metodo consente di patterning di proteine e patterning indiretta di cellule utilizzando dead-end canali microfluidica con dimensioni piccole come 10 micron e le attrezzature disponibili in quasi tutti i laboratori biologici una volta lo stampo maestro è fatto. Questa tecnica può essere utilizzata con canali microfluidici PDMS creata usando fotolitografia tradizionali morbido, o con canali microfluidici PDMS creati con nastro adesivo di fabbricazione (Figura 1) 28, 29. Abbiamo precedentemente dimostrato l'uso di questo procedimento in patterning indiretta di cellule neuronali per la valutazione di guida degli assoni in fotorecettori 4, 30, e ora abbiamo dimostrato il suo impiego in diversi tipi cellulari aggiuntivi di varia origine. Embrionali di topo neuroni corticali modellate sulla poli-D-lisina (PDL) e le superfici laminina dimostrano adherenc generalee per le zone a motivi geometrici e la crescita lungo il Pdl e strisce laminina (Figura 3a). Linee cellulari di mioblasti C2C12 aderiscono anche alla zona di fantasia e dimostrano la fusione in miotubi multinucleati (figura 3b). Abbiamo anche adattato questa tecnica per patterning cella diretta come visto con fibroblasti in Figura 4. Come riportato in precedenza, questo metodo patterning cella diretta ha mostrato alcun effetto negativo sulla sopravvivenza delle cellule 30. Le variabili che portano a patterning diretto o indiretto successo di tipi cellulari indicati sono elencati nella Tabella 1 e 2. Così, in futuro, i ricercatori possono utilizzare questa tecnica per cellule di pattern e scoprire fenomeni legati alla loro patterning specifica.
Figura 1: Realizzazione di stampi da Soft litografia. A sinistra: Fotolitografiaprocesso a. SU-8 è centrifuga rivestito su un wafer di silicio, esposto a radiazioni UV, e sviluppato per eliminare l'eccesso SU-8. A destra: Adesivo processo di fabbricazione del nastro. Nastro adesivo è attaccato ad un vetrino pulito, tagliato con un bisturi, e il nastro in eccesso viene rimosso con attenzione. PDMS cast è poi fabbricata da ogni stampo utilizzando la litografia soffice. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esempio di dispositivo PDMS per substrato Patterning. (A) PDMS getto microfluidica con l'ingresso utilizzato per patterning microfluidica di substrati. Inlet stato perforato a un'estremità microcanali. (B) il canale Microfluidic come si è visto al microscopio a contrasto di fase. canali microfluidica sono 15 mm di lunghezza, 20 micron di larghezza, und separati da 200 micron. La figura 2 è riprodotto con il permesso di IOP Publishing. Tutti i diritti riservati 30. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: indiretta cellulare Patterning. (A) processo di patterning di proteine vuoto assistita. PDMS dispositivo a canale microfluidico è collegata a una piastra di Petri, soluzione di substrato viene caricato in ingresso, si applica il vuoto brevemente camera e rilasciato, dispositivo PDMS viene rimosso, modello viene lavato e pronto all'uso. (B) embrionali neuroni di ratto corticali seminate su un vetrino con un substrato PDL e laminina fantasia. Linee (c) C2C12 cellule mioblasti coltivate su fantasia Pdl e laminina. Figure 3a e 3c sono riprodotti con permission da IOP Publishing. Tutti i diritti riservati 30. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cell Patterning diretto. (A - c) I fibroblasti fantasia via patterning cellulare diretta. (A) dispositivo a canale Microfluidic fabbricato utilizzando la litografia adesivo del nastro. (B) canali microfluidica dopo il riempimento con sospensione cellulare di fibroblasti usando il vuoto assistito tecnica patterning. (C) fibroblasti dopo la rimozione del dispositivo a microfluidi. (D) calceina-AM colorazione dei fibroblasti dopo patterning microfluidica. immagine contrasto (e) Fase di fibroblasti dopo patterning microfluidica. (F - g 30. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Indiretta Patterning cellulare | Substrato | Proteine Condizioni di incubazione | Densità cellulare | Adesione Cellulare Durata |
| PC12 | Collagene-1 | 1 ora a 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 h a 37 ° C |
| fibroblasti | Collagene-1 | 1 ora a 50 ° C | 5 x 10 6 / ml | 1 h a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminina | 1 h a 37 ° C, lavaggio PBS, overnight a 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min a 37 ° C |
| Embryonic Rat neuroni corticali | PDL + Laminina | 1 h a 37 ° C, lavaggio PBS, overnight a 37 ° C | 2 x 10 6 / ml | 15 min a 37 ° C |
| Salamander neuroni della retina | Sal-1 | notte a 10 ° C | N / A | 1 ora a 10 ° C |
Tabella 1: indiretti cellulare Patterning condizioni. Elenco delle condizioni di incubazione come il tipo di substrato, tempo, temperatura e densità cellulare per tipi cellulari tipici. I ricercatori dovrebbero ottimizzare le condizioni di incubazione per i propri substrati modello e tipo di cellula. Sal-1 è il substrato anticorpo utilizzato per crescere Salamander neuroni retinici.
| Patterning cellulare diretta | Substrato | Densità cellulare | Tempo Adesione Cellulare |
| PC12 | Collagene-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h a 37 ° C |
| fibroblasti | Collagene-1 | 6 x 10 6 / ml | 1 h a 37 ° C |
| C2C12 | PDL + Laminina | 2 x 10 6 / ml | 15 min a 37 ° C |
| Embryonic Rat neuroni corticali | PDL + Laminina | 2 x 10 6 / ml | 15 min a 37 ° C |
| Salamander neuroni della retina | Sal-1 | N / A | 1 ora a 10 ° C |
Tabella 2: Cell patterning diretto condizioni. Elenco delle condizioni di incubazione quali temperatura, tempo, e la densità delle cellule per tipi cellulari tipici. I ricercatori dovrebbero ottimizzare le condizioni di incubazione per il proprio tipo di cellula del modello.
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Discussion
Mentre fotolitografia convenzionale è una tecnica ben consolidata per la realizzazione di stampi per litografia soft, attrezzature, materiali e competenze necessarie per utilizzare fotolitografia convenzionale non sono facilmente disponibili al maggior parte dei laboratori. Per i laboratori senza accesso a queste risorse, abbiamo presentato adesivo fabbricazione nastro come un metodo per creare stampi con caratteristiche relativamente semplici per dispositivi microfluidici. Questo metodo permette qualsiasi laboratorio per creare e utilizzare dispositivi microfluidici per scopi di ricerca con strumenti facilmente reperibili. Il metodo di nastro adesivo può essere migliorata con un basso costo del vinile del desktop taglierina 31. plotter desktop possono aumentare la riproducibilità, risoluzione, così come la layout complessità. Ognuna di queste opzioni, fotolitografia convenzionale, taglierine del desktop o di fabbricazione del nastro adesivo hanno capacità diverse e limitazioni e ricercatori devono considerare attentamente quale metodo sarebbe sufficienteper le loro esigenze.
In PDMS curate, le lunghe catene polimeriche di dimetil silossano formano un reticolo, struttura nanoporosa che crea regioni vuote che possono essere riempiti con le molecole d'aria 27. Questa struttura permeabile a gas è la chiave per il nostro metodo di riempire i canali microfluidica. Quando posto in un ambiente a bassa pressione, le molecole d'aria vengono rimossi dal materiale sfuso PDMS nonché microcanali stessi 25. Quando il PDMS viene quindi esposto alla pressione atmosferica, il materiale sfuso PDMS e microcanali mantengono una pressione negativa per qualche tempo 25, 30. Questa pressione negativa attira liquido nei microcanali riempimento automaticamente i canali microfluidica. Questa pressione negativa continua a disegnare liquido nel canale fino PDMS bulk si equilibra con la pressione atmosferica.
Questa tecnica vacuum-assisted permette di patterning di proteine e substrati specifici su un substrato di crescita. In questo studio, siamo stati in grado di modello diversi substrati diversi e tipi di cellule, sia direttamente che indirettamente (Tabella 1 e 2). Tuttavia, lo sperimentatore può avere bisogno di testare diversi tempi di incubazione, densità delle celle, o supporti di semina per la loro particolare tipo di cellula. Queste variabili possono riguardano la capacità innata di una cella o substrato di aderire alla superficie sulla quale viene depositato. Per esempio, ecco C2C12 cellule richiesto l'utilizzo di mezzi senza siero per i mezzi di semina prima coltura le cellule in DMEM con il 2% siero di cavallo. Inoltre, le condizioni possono variare in base alle se un vetrino di vetro o di plastica capsula di Petri è in fase di fantasia. Qui, sia lavorato bene per permettere specifica patterning di vari tipi cellulari.
Una delle preoccupazioni iniziali che abbiamo avuto, mentre utilizzando questa tecnica è stata come l'esposizione al vuoto potrebbe influenzare la vitalità delle cellule. Questo studio e pstudi sola esistenza, tuttavia, dovrebbero alleviare tali preoccupazioni, come abbiamo dimostrato che il vuoto ha poco o nessun effetto su una varietà di cellule 30. Wang et al. precedentemente utilizzato degasato irreversibilmente sigillato camere di microfluidica per caricare cellule HeLa 32. Altri studi hanno utilizzato vuoto-assistita semina cellulare per una varietà di tipi di cellule umane, comprese le cellule staminali, cellule aderenti e non aderenti, e linea cellulare ibrido uomo-criceto (A L) cellule caricare in canali microfluidica 33. Inoltre, altri ricercatori hanno sottoposto cellule molto maggiori pressioni di vuoto rispetto a questo studio con poco o nessun effetto rilevante sulle cellule 33. Bolle formatisi durante la rimozione dell'aria dai microcanale tendono a raggrupparsi sulla superficie della goccia della sospensione in ingresso. Spesso queste bolle non rottura a causa della tensione superficiale della sospensione. Non abbiamo Observcato una notevole diminuzione della vitalità cellulare a causa di bolle. Inoltre, l'esperimento con calceina-AM non suggerisce una significativa diminuzione della vitalità cellulare. A causa di questo, non abbiamo esaminato a fondo la morte delle cellule specificamente a causa di bolle.
I precedenti tentativi di substrati modello o cellule erano spesso afflitti da problemi quali la formazione di bolle d'aria nei dispositivi microfluidici. La formazione di bolle d'aria ha reso difficile iniettare liquidi semplice ed efficiente senza l'impiego di apparecchiature o materiali che non sono disponibili in molti laboratori. Ad esempio, i metodi precedenti utilizzati l'uso del trattamento al plasma o trattamento corona per diminuire l'idrofobicità di PDMS microcanali 15, 34. Mentre efficace, plasma e dispositivi di trattamento corona non sono facilmente disponibili in molti laboratori. In questo protocollo, dimostriamo la capacità di cellule di pattern e substrati semplicemente utilizzando labora comunevuoti conservatore. Utilizzando la tecnica di fabbricazione del nastro adesivo, il metodo può essere utilizzato per creare PDMS canali microfluidica a substrati modello o cellule in quasi qualsiasi laboratorio.
Per substrati modello o cellule con il protocollo patterning vuoto, diversi passaggi sono fondamentali per patterning successo. Innanzitutto, per fabbricare il master nastro adesivo, il nastro adesivo deve essere completamente collegato al vetrino e privo di bolle d'aria. Le bolle d'aria indebolire il legame tra il nastro e la lastra di vetro e può portare al nastro di essere staccata quando curato PDMS è staccata stampo nastro adesivo. Inoltre, bolle falsare la geometria del canale microfluidico causando la superficie dei canali di essere non planare. Per rendere il PDMS espressi dal SU-8 stampo, lo stampo SU-8 deve essere silanizzata prima del getto con PDMS. Questo passaggio è fondamentale nel prevenire l'adesione permanente di PDMS allo stampo SU-8 dopo l'indurimento di PDMS. Prima di tenuta conformazionaledel canale microfluidica PDMS di lamelle di vetro o scatole Petri in plastica, i PDMS devono essere puliti di tutte le particelle di polvere. Queste particelle possono impedire la formazione di una tenuta conforme tra PDMS e vetro e quindi prevenire l'iniezione di cellule o substrati nel canale microfluidica. Come indicato nel protocollo di cui sopra, la pulizia dei PDMS canali con del nastro adesivo è fondamentale prima di aderire il microcanali di coprioggetto di vetro o scatole Petri in plastica. Infine, dopo aver posizionato il dispositivo nella camera a vuoto, il vuoto deve essere rilasciato delicatamente per impedire lo spostamento della goccia di substrato o cella soluzione dal foro di ingresso.
Se non si osservano fluido che scorre nel canale microfluidica, ci può essere una perdita nel canale microfluidico che impedirebbe liquido di fluire nel canale. Rimuovere il timbro PDMS, asciutto e pulito e poi ripetere il punto 4, 5, o 6 della tecnica. Se la soluzione non scorre nel microcanali dopo release del vuoto, assicurarsi che la soluzione sia completamente copre l'ingresso del microcanale. Questo può essere fatto pipettando soluzione su e giù parecchie volte mentre metterlo nel foro di ingresso. Se il substrato, dopo aver iniettato nel microcanali, non allegare al vetro, valutare e determinare le condizioni di incubazione ottimali necessarie per il substrato utilizzato. Se la rimozione della PDMS espressi dalla superficie del vetro o capsula di Petri di plastica induce le cellule o substrati fantasia per essere distrutti, utilizzare un cast PDMS più sottile, immergere il PDMS espressi in PBS o supporto, e lentamente e delicatamente staccare il PDMS espressi dal vetro o superficie di plastica con una pinzetta.
Infine, BSA può essere critica nel ridurre l'adesione aspecifica delle cellule per il vetro di nanostrutturata o superficie di plastica. BSA è tipicamente usato come reagente bloccante in western blotting, immunostaining e altre tecniche di biologia molecolare. Altri ricercatori hanno anche utilizzato per indiretta o direttaprotocolli di patterning per diminuire l'adesione delle cellule aspecifica 35, 36, 37. Abbiamo scoperto che l'incubazione del substrato con BSA era necessaria per molti tipi di cellule tranne cellule retiniche salamandra. Questo può essere a causa della natura più specializzata del substrato (un anticorpo chiamato Sal-1) che è stato utilizzato, nonché la generale mancanza di adesione cellulare da questo tipo di cella 38. Nelle nostre mani, BSA inoltre, non ha notevolmente diminuire l'adesione delle cellule alle aree fantasia e soprattutto servita a diminuire l'aderenza non specifico.
Mentre questo metodo è progettato per essere versatile e flessibile nella sua applicazione ai vari tipi di substrato e cellulari, ci sono diverse limitazioni a questo protocollo e le cellule compatibili e substrato. A causa della natura di patterning cellule su una superficie, i tipi di cellule che questa tecnica può essere applicata a sono limitati a those suscettibili di qualsiasi protocollo patterning come quelle cellule che sono in grado di sopravvivere con più celle limitata a contatto cellula così come quelli che può sopravvivere a concentrazioni cellulari semina inferiori. Ad esempio, una possibile applicazione è il patterning di cellule di lievito per microscopia a forza atomica (AFM) 39. Anche se abbiamo testato molti substrati cellulari diversi, altri substrati potrebbero non funzionare con questa particolare tecnica, come quelle che formano i gel tridimensionali. In questo momento, non abbiamo esaminato se i gel formano correttamente e rimanere sulla superficie del vetrino di vetro o di plastica capsula di Petri dopo patterning. Questa tecnica è in grado di patterning forme complesse e grandi aree. Tuttavia, essa non può modello di una serie di singole forme separate senza interconnessione microcanali. In assenza di microcanali interconnessi, ciascuno di forma sarebbe necessario un ingresso rendendo la tecnica ingombrante. Anche se non abbiamo notato alcuna non uniformità in patterning proteine, la distribuzione delle cellule modellato all'interno del microcanale può essere non uniforme. Questa disuniformità può essere dovuto alla distribuzione casuale delle cellule in cellule sospensioni, la geometria e le dimensioni dei microcanali, e la viscosità della sospensione cellulare.
In futuro, questa tecnica può essere applicata ad altri tipi di substrati e cellule. Ad esempio, i gel tridimensionali come la matrice di membrana basale o impalcature di collagene possono potenzialmente essere modellati e formati utilizzando PDMS canali microfluidica. Iniettando un idrogel nel dispositivo microfluidica, l'idrogel può assumere la forma del dispositivo microfluidico ed essere in grado di formare complessi schemi senza l'uso di stampanti 3-D o altre tecnologie. Ciò consentirebbe per la creazione rapida di ponteggi strutturati con strumenti facilmente disponibili e dispositivi microfluidici.
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Acknowledgments
Il finanziamento per questa ricerca è stato fornito dalla Commissione del New Jersey su Spinal Cord Research (NJCSCR) (a FHK), concedere CSCR14IRG005 (a BLF), NIH concedere R15NS087501 (a CHC), e la Kirby Fondazione FM (ETA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CorelDRAW X4 CAD Drawing Tools | Corel Corporation, Canada | X4 Version 14.0.0.701 | CAD tool used to draw the layout of the microfluidic device |
| Laser Printer HP | Hewlett Packard, CA | 1739629 | Used to print the layout of microfluidic device for adhesive tape technique |
| Bel-Art Dessicator | Fisher Scientific, MA | 08-594-16B | Used to degass the PDMS mixture |
| Adhesive Scotch Tape | 3M Product, MN | Tape 600 | Used to fabricate adhesive tape Master |
| PDMS Sylgard 184 | Dow Corning, MI | 1064291 | Casting polymer |
| Petri Dish | Fisher Scientific, MA | 08-772-23 | Used to keep the mold to cast with PDMS |
| Stainless steel Scalpel (#3) with blade (# 11) | Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan | 2976#11 | Used to cut the PDMS |
| Tweezers | Ted Pella, CA | 5627-07 | Used to handle the PDMS cast during peeling |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-546-2 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Glass slides | Fisher Scientific, MA | 12-544-4 | Used as surface to pattern the Substrate |
| Rubber Roller | Dick Blick Art Materials, IL | 40104-1004 | Used to attach adhesive tape on glass without trapping air bubbles |
| Laser Mask Writer | Heidelberg Instruments, Germany | DWL66fs | Used to fabricate quartz mask used in photolithography fabrication process |
| EVG Mask Aligner (Photolithography UV exposure tool) | EV Group, Germany | EVG 620T(B) | Used to expose the photoresist to UV light |
| Spin Coater Headway | Headway Research Inc, TX | PWM32-PS-CB15PL | Used to spin coat the photoresist on silicon wafer |
| Photoresists SU-8 50 | MicroChem, MA | Y131269 | Negative photoresist used for mold fabrication |
| SU-8 Devloper | MicroChem, MA | Y020100 | Photoresist developer |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane | UCT Specialties, PA | T2492-KG | Coat mold to avoid PDMS adhesion |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, MO | 190764 | Cleaning Solvent |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, MO | 24102 | Sterilization Solvent |
| Poly-D-Lysine hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich, MO | P0899-10MG | PDL solution is made at 0.1 mg/mL in Sodium Tetraborate Buffer |
| Laminin | Sigma-Aldrich, MO | L2020 | Laminin aliquoted into 10 µL aliquots and diluted to 20 µg/µL in PBS prior to use |
| BSA | Fisher Scientific, MA | BP1605100 | Cell culture |
| C2C12 Myoblast cell lline | ATCC, VA | CRL-1722 | Used to demonstrate C2C12 patterning |
| PC12 Cell Line | ATCC, VA | CRL-1721 | Used to demonstrate PC12 patterning |
| Collagen type 1, rat tail | BD Biosciences | 40236 | Cell culture |
| DMEM | GIBCO, MA | 11965-084 | Cell culture |
| Horse Serum, heat inactivated | Fisher Scientific, MA | 26050-070 | Cell culture |
| Phalloidin-tetramethylrhodamine B isothiocyanate (TRITC) | Sigma-Aldrich, MO | P1951 | To label cells |
| Calcein-AM live dead cell Assay kit | Invitrogen, MA | L-3224 | Cell viability Assay |
| Biopsy Hole Punch | Ted Pella, CA | 15110-10 | Punched hole in PDMS |
References
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